彭喜霞黃 貝段利朋李春艷梁 英聶 品,黃文樹,

(1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 廈門 361021; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室, 武漢 430072; 3. 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心, 廈門 361021; 4. 福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心, 廈門 361005)

日本鰻鱺IFN-γ 基因的鑒定、表達(dá)模式及啟動子活性分析

彭喜霞1黃 貝1段利朋1李春艷1梁 英1聶 品1,2黃文樹1,3,4

(1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 廈門 361021; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室, 武漢 430072; 3. 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心, 廈門 361021; 4. 福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心, 廈門 361005)

為揭示魚類IFN-γ的生物學(xué)功能, 研究從日本鰻鱺(Anguilla japonica)中克隆獲得了IFN-γ基因, 命名為AjIFN-γ。AjIFN-γ具有脊椎動物IFN-γ的典型特征: 包括4外顯子/3內(nèi)含子的基因結(jié)構(gòu)、C端的IFN-γ特征性氨基酸基序和1個核定位信號, 以及6個α-螺旋反向平行構(gòu)成的二級結(jié)構(gòu)。AjIFN-γ在日本鰻鱺所有組織中均低水平轉(zhuǎn)錄表達(dá), 其中肝臟中表達(dá)量最高, 其次是皮膚和頭腎。Poly I:C刺激和遲緩愛德華氏菌感染均可顯著誘導(dǎo)AjIFN-γ在鰓、頭腎、體腎和(或)脾臟中的轉(zhuǎn)錄表達(dá), 表明AjIFN-γ能夠參與日本鰻鱺抗菌和抗病毒的免疫過程。此外, 研究還克隆了AjIFN-γ基因的5′調(diào)控區(qū)序列共1536 bp, 并構(gòu)建了一系列AjIFN-γ 5′調(diào)控區(qū)刪節(jié)突變體, 分析其啟動子活性, 結(jié)果表明, 上游–240/+136區(qū)域中含有起始AjIFN-γ轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵啟動子調(diào)控元件,–1062/–814區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控元件, 而–1252/–1062區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控元件。上述結(jié)果進(jìn)一步豐富了魚類IFN-γ的基礎(chǔ)知識。

IFN-γ; 日本鰻鱺; 轉(zhuǎn)錄表達(dá); 啟動子

在哺乳動物中, IFN-γ (interferon-γ, 干擾素γ)是II型IFN的唯一成員, 主要由CD4+輔助T淋巴細(xì)胞、CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞、NK細(xì)胞以及APC細(xì)胞產(chǎn)生[1—3]。IFN-γ在進(jìn)化中高度保守, 其基因組均由4個外顯子和3個內(nèi)含子結(jié)構(gòu)組成, 氨基酸序列的C端含有IFN-γ特征基序和由4個連續(xù)的賴氨酸或精氨酸組成的核定位基序(Nuclear localization site; NLS)。IFN-γ不僅可調(diào)節(jié)前炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生、激活巨噬細(xì)胞的吞噬作用、刺激具有抗菌活性的氧中間體和一氧化氮的產(chǎn)生和釋放, 還可促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞, 并誘導(dǎo)MHCⅠ、MHCⅡ類分子和抗原提呈細(xì)胞上協(xié)同刺激分子的表達(dá)以及B細(xì)胞中免疫球蛋白類型轉(zhuǎn)換[4], 在宿主抵抗病毒和胞內(nèi)細(xì)菌感染的過程中發(fā)揮著重要的作用。

與哺乳動物不同, 魚類基因組中發(fā)現(xiàn)兩個緊密連鎖的IFN-γ基因。第一個IFN-γ是Zou等[5]通過基因共線性分析從河鲀(Takifugu rubripes)中首先發(fā)現(xiàn)。2006年, Igawa等[6]發(fā)現(xiàn)在斑馬魚(Danio rerio)和綠河鲀(Tetraodon nigrovirdis)基因組IFN-γ的附近發(fā)現(xiàn)另一個IFN-γ同源基因, 即IFN-γrel (IFN-γ related gene), 隨后, 從斑點叉尾(Ictalurus punctatus)[7]、鯉(Cyprinus carpio)[8]、金魚(Carassius auratus auratus)[9]和草魚(Ctenopharyngodon idellus)[10,11]等魚類克隆了該基因。研究發(fā)現(xiàn)該兩個IFN-γ基因均為4個外顯子/3個內(nèi)含子結(jié)構(gòu), 其氨基酸序列的C-端都含有一段保守的IFN-γ特征基序, 然而, IFN-γ的C-端有1個NLS(由4個精氨酸或賴氨酸組成), 而IFN-γrel則無。近年, Shibasaki等[12]在鯽(Carassius auratus langsdorfi)和金魚中再克隆出一個IFN-γrel基因, 并提出根據(jù)其氨基酸序列的C端是否具有NLS將鯉科魚類IFN-γrel分為兩類, 即IFN-γrel1的C端有一段富含堿性氨基酸的NLS, 在金魚和鯽中均為“KHHHR”, 而IFN-γrel2則缺乏該NLS。根據(jù)該分類特征, 目前已發(fā)現(xiàn)的斑馬魚和草魚IFN-γrel均屬于IFN-γrel1, 而鯉IFN-γrel則屬于IFN-γrel2。除綠河鲀外, 目前克隆到的魚類IFN-γrel基因均源自鯉形總目(1971年拉斯分類系統(tǒng)), 無法確定以上IFN-γrel的特征是魚類共有, 還是鯉形總目魚類所特有的。

IFN-γ與哺乳動物IFN-γ具有類似的功能。首先, 魚類IFN-γ參與魚類抗病毒反應(yīng): Poly I:C可顯著誘導(dǎo)虹鱒(Oncorhynchus mykiss)頭腎細(xì)胞、斑馬魚的鰓和腸、大西洋鱈(Gadus morhua)的頭腎以及大黃魚(Pseudosciaena crocea)多個組織(腎、脾臟、鰓、頭腎、皮膚和胸腺)中IFN-γ的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[6,13—15];鯉科皰疹病毒三型(Cyprinid herpesvirus-3, CyHV-3)可顯著誘導(dǎo)鯉IFN-γ和IFN-γrel的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[16]。重組表達(dá)的魚類IFN-γ可誘導(dǎo)抗病毒基因GBP (Guanylate-Binding Protein)、ISG (Interferon-Stimulated Gene)和Mx (Myxovirus-resistant)等的表達(dá)[17—19]; 鯽IFN-γ能夠顯著提高浸泡感染了CHNV (Crucian Carp Hematopoietic Necrosis Virus)鯽胸腺細(xì)胞(GTS9細(xì)胞)的存活率[12], 大西洋鮭IFN-γ具有抗IPNV (Infectious Pancreatic Necrosis Virus)和SAV3 (Salmonid Alphavirus 3)的生物活性[18]。其次, 魚類IFN-γ也參與抗菌免疫反應(yīng): LPS刺激可上調(diào)斑馬魚和鯉IFN-γrel基因的表達(dá)量[6,8], 鰻弧菌(Vibrio anguillarum)及哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)可分別誘導(dǎo)IFN-γ基因在大西洋鱈頭腎組織和大黃魚多個組織(肝臟、脾臟和頭腎等)中的表達(dá)[14,15]。與哺乳動物IFN-γ相似, 魚類IFN-γ也可激活巨噬細(xì)胞和誘導(dǎo)MHC II類分子表達(dá)[4,9,13,20,21]。此外, IFN-γ還可參與魚類抗寄生蟲感染的免疫過程: 刺激隱核蟲(Cryptocryon irritans)感染可誘導(dǎo)大黃魚脾臟、腸和皮膚等組織中IFN-γ的表達(dá)[15], 血液寄生的擬錐蟲(Trypanoplasma borreli)感染也可上調(diào)鯉IFN-γ的表達(dá)[8]。

日本鰻鱺(Anguilla japonica)屬于鰻鱺目鰻鱺科, 是重要的經(jīng)濟魚類。在養(yǎng)殖過程中, 細(xì)菌、寄生蟲、真菌和病毒性疾病時有發(fā)生, 給鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失[22]。然而, 目前有關(guān)日本鰻鱺抗病基因相關(guān)研究仍較為薄弱。本文首先從日本鰻鱺中克隆獲得IFN-γ基因(命名AjIFN-γ), 并研究AjIFN-γ在健康狀態(tài)以及病原感染情況下的表達(dá)模式, 初步分析了AjIFN-γ 5′-調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。本研究將目前魚類IFN-γ的研究領(lǐng)域延伸到鰻鱺總目, 將有助于更全面地了解魚類IFN-γ的結(jié)構(gòu)、功能以及進(jìn)化過程, 同時, 為深入探索鰻鱺的免疫防御機制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

日本鰻鱺[質(zhì)量(203±53) g]購于福建省集美大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地, 養(yǎng)殖水溫為(28±2)℃。遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)為本實驗室保種。AJSB細(xì)胞株為本實驗室構(gòu)建, 未發(fā)表。

1.2 AjIFN-γ cDNA全長序列的擴增

根據(jù)cDNA文庫中獲得的IFN-γEST序列, 設(shè)計引物AjIFN-gF/AjIFN-gR, 以日本鰻鱺腸道cDNA為模板, PCR擴增獲得AjIFN-γcDNA部分序列。反應(yīng)體系(25 μL)為: HSTMReaction Mix 12.5 μL(HSTMkit, 東盛生物), ddH2O 9.25 μL, 上下游引物各1.0 μL, HSTMTaq聚合酶0.25 μL(HSTMkit, 東盛生物), 模板1.0 μL。反應(yīng)程序為: 94℃ 3min; 94℃ 30s, 62℃30s, 72℃ 40s, 運行38個循環(huán); 72℃ 10min。然后根據(jù)獲得的部分cDNA序列, 參照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech, 美國)試劑盒原理, 設(shè)計合成3′-和5′-RACE特異性引物(表 1)。以腸道3′-和5′-SMART cDNA為模板, 進(jìn)行巢式PCR。拼接RACE獲得的3′-和5′-末端序列與cDNA部分序列, 得到AjIFN-γ基因的cDNA全長序列。再根據(jù)拼接獲得的cDNA全長序列, 在UTR區(qū)設(shè)計引物(表1), 通過PCR驗證拼接的cDNA全長序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、回收、連接、轉(zhuǎn)化后將陽性克隆子送測序, 具體操作參照本課題組前期研究[23]。

1.3 AjIFN-γ基因序列生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站中的Blast (http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列比對, 使用Primer Premier 6軟件設(shè)計引物, 利用ExPASy的翻譯工具(http:// web.expasy.org/translate/)獲得對應(yīng)的氨基酸序列, ExPASy (http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測蛋白分子量和pI值, 用SignalP 4.1 Server程序(http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號肽, 使用NetNGlyc 1.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetNGlyc/)預(yù)測潛在的N-糖基化位點, 分別使用PSIPRED程序(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和Phyre2程序(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)預(yù)測蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)。用ClastalW進(jìn)行氨基酸序列多重比對; 使用MEGA 6.0中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, Bootstrap置換1000次。

1.4 AjIFN-γ的表達(dá)模式分析

遲緩愛德華氏菌菌液制備: 取遲緩愛德華氏菌菌株劃線于LB瓊脂平板, 37℃培養(yǎng)16h, 挑取單克隆于1 mL LB液體培養(yǎng)基中, 37℃, 180 r/min培養(yǎng)4h。取100 μL菌液按1：100 (體積比)加入LB液體培養(yǎng)基, 37℃, 180 r/min培養(yǎng)至菌液A600達(dá)到0.5—0.7時, 收菌。取500 μL菌液, 梯度稀釋后各取100 μL涂布在LB瓊脂平板上, 37℃培養(yǎng)16h后計數(shù)菌落單位, 推算原菌液的濃度, 用PBS緩沖液洗滌并稀釋至使用濃度。

正常養(yǎng)殖鰻鱺不同組織中的表達(dá)差異: 采集健康日本鰻鱺(黑仔鰻)血液、鰓、心臟、肝臟、腸、胃、脾臟、頭腎、體腎、性腺、鰾和皮膚共12個組織/器官, 使用Lightcycler 480 SYBR Green I試劑盒(Roche, 德國)在Ligthcycler 480 II PCR儀(Roche,德國)上, 參照Wang等[24]方法進(jìn)行實時熒光定量PCR, 研究AjIFN-γ在不同組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量差異。β-actin和AjIFN-γ的定量引物的熒光信號采集溫度分別為80℃、82℃和76℃。通過Excel工具計算AjIFN-γ與β-actin的拷貝數(shù)比值, 以確定AjIFN-γ在mRNA水平相對β-actin的表達(dá)量, 使用DPS 7.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計分析, 使用GraphPad Prism 6.0軟件繪圖。

不同免疫物刺激后的表達(dá)差異: 實驗設(shè)PBS對照組、Poly I:C刺激組(1 mg/100 g魚, Sigma)和遲緩愛德華氏菌刺激組(2×107cfu/100 g魚), 免疫方法是腹腔注射。在注射后8h、16h、24h和72h分別采集脾臟、鰓、頭腎及體腎, 每個時間點、每條魚的每個組織作為單獨樣品, 進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。定量數(shù)據(jù)經(jīng)β-actin校正后, 以相應(yīng)時間點、相同組織的PBS對照組中靶基因的表達(dá)量為基準(zhǔn)計算AjIFN-γ相對表達(dá)量的倍數(shù)變化。結(jié)果用Excel軟件進(jìn)行計算, 用單因素變量方差分析法(ANOVA)分析刺激組與PBS對照組之間的表達(dá)差異的顯著性。

1.5 AjIFN-γ基因啟動子活性分析

根據(jù)日本鰻鱺基因組數(shù)據(jù)設(shè)計引物AjIFN-γ ProF/AjIFN-γProR, 以日本鰻鱺肌肉基因組為模板,PCR擴增獲得AjIFN-γ基因上游約2000 bp的調(diào)控序列。利用TSSG程序(http://linux1.softberry.com)預(yù)測其啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(Transcriptional Start Site, TSS)及TATA-box。其調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(Transcription Factor Binding Site, TFBS)的預(yù)測利用Alibaba 2程序(http://www.gene-regulation.com/ pub/programs/alibaba2/)和PAPIA程序(http://mbs. cbrc.jp/papia/)。

表 1 本文中所用引物序列Tab. 1 Primers used in the present study

根據(jù)克隆的5′調(diào)控序列以及預(yù)測的TFBS, 設(shè)計5′調(diào)控區(qū)刪節(jié)引物(表 1)。上、下游引物5′-端分別添加限制性內(nèi)切酶MluⅠ和Bgl Ⅱ的酶切位點。以pMD19-T-AjIFN-gPro質(zhì)粒作為模板, PCR擴增系列5′調(diào)控區(qū)刪節(jié)片段: P1 (–1400/+136)、P2 (–1252/+ 136)、P3 (–1062/+136)、P4 (–814/+136)、P5 (–543/+ 136)和P6 (–240/+136), 經(jīng)限制性內(nèi)切酶MluⅠ和BglⅡ酶切后, 連接至pGL3-basic載體(Promega, 美國),構(gòu)建刪節(jié)突變體質(zhì)粒。使用E.Z.N.A Endo-Free Plasmid DNA Mini Kit (Omega, 美國)提取相應(yīng)質(zhì)粒并測序驗證。

將AjIFN-γ基因5′調(diào)控區(qū)刪節(jié)突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AJSB細(xì)胞, 具體操作如下: 將AJSB細(xì)胞(1.5×105cell/mL)接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 28℃培養(yǎng)48h至貼壁后,使用Lipofectamine 3000 (Invitrogen, 美國)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔加入相應(yīng)刪節(jié)突變體質(zhì)粒0.5 μg和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK (Promega, 美國)0.005 μg, 對照組轉(zhuǎn)染pGL3-basic質(zhì)粒和pRL-TK質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24h后, 用Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, 美國)檢測細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性。每組設(shè)3個重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 AjIFN-γ基因序列分析

根據(jù)EST序列設(shè)計引物, PCR擴增獲得cDNA序列, 再設(shè)計RACE引物, 經(jīng)克隆、拼接和PCR驗證, 獲得AjIFN-γ的全長cDNA序列, GenBank登錄號為KU950362。AjIFN-γcDNA序列全長共912 bp, 開放閱讀框546 bp, 可編碼181個氨基酸(aa)的多肽, 預(yù)測該多肽N-端21 aa為信號肽。同時, 本實驗室還克隆了日本鰻鱺IFN-γrel (AjIFN-γrel)的cDNA序列(登錄號為KU950363), AjIFN-γrelcDNA全長為888 bp,開放閱讀框為483 bp可編碼160個aa的多肽, 比AjIFN-γ少21 aa, 其N-端23 aa為信號肽。AjIFN-γ cDNA的3′-UTR含有IFN-γ序列中普遍存在的mRNA不穩(wěn)定基序(ATTTA)3個, 而在AjIFN-γrelcDNA的3′-UTR中沒有發(fā)現(xiàn)該基序。AjIFN-γ的C-端具有IFN-γ特征基序“T-Q-R-K-A-I-R-D-L-L-T-V”和1個NLS (RRRR), 然而, AjIFN-γrel僅具有部分IFN-γ特征基序, 并且與其他魚類的IFN-γrel相似, AjIFN-γrel的C-端也缺乏NLS以及鯉形總目魚類IFN-γrel中保守的“CTC”基序(圖 1)。

氨基酸序列同源性分析顯示, AjIFN-γ與AjIFN-γrel的一致性和相似性分別為38.88%和50.66%。PSIPRED程序預(yù)測結(jié)果顯示, AjIFN-γ的成熟肽二級結(jié)構(gòu)由6個α-螺旋組成, 而AjIFN-γrel僅有4個α-螺旋, 其位置與AjIFN-γ前4個螺旋分別對應(yīng)(圖 1)。進(jìn)一步使用Phyre2程序構(gòu)建了AjIFN-γ和AjIFN-γrel成熟肽的三級結(jié)構(gòu)模型。結(jié)果顯示, AjIFN-γ由6個長短不一的α-螺旋反向平行構(gòu)成(圖 2A), 而AjIFN-γrel則僅由4個α-螺旋反向平行構(gòu)成(圖 2B)。

2.2 脊椎動物IFN-γ氨基酸序列多重比對

選取人類、小鼠、雞的IFN-γ, 以及硬骨魚類IFN-γ和IFN-γrel的氨基酸全長序列進(jìn)行多重比對。結(jié)果顯示, 雖然脊椎動物IFN-γ氨基酸序列一致性較低,但是, 都具有特征基序“[I/V]-Q-X-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V]”和由4個連續(xù)精氨酸或賴氨酸組成的NLS; 魚類IFN-γrel均缺乏該類NLS, 此外, 鯉形總目魚類IFN-γrel氨基酸序列的近1/2處有一個“CTC”基序, 而AjIFN-γrel和綠河鲀IFN-γrel則無(圖 1)。N-糖基化位點預(yù)測結(jié)果顯示, 爪蟾和大西洋鱈均缺少N-糖基化位點, 而褐牙鲆有3個, 其他IFN-γ和IFN-γrel均具有1—2個, 其中AjIFN-γ和AjIFN-γrel均具有2個糖基化位點(圖 1、表 2)。

2.3 AjIFN-γ同源性分析

為了研究日本鰻鱺II型IFN與其他脊椎動物II型IFN的同源性, 使用ClustalW軟件和SIAS程序(http://imed.med.ucm.es/Tools/sias.html)分析其氨基酸成熟肽序列的一致性和相似性。AjIFN-γ與其他脊椎動物IFN-γ的一致性均相對稍高于AjIFN-γrel: AjIFN-γ與高等脊椎動物IFN-γ的一致性為14.3%—20%, 而AjIFN-γrel僅為9%—17.5%; AjIFN-γ與其他魚類IFN-γ的一致性為20%—30.7%, AjIFN-γrel為16.8%—27%。除斑點叉尾和綠河鲀外, AjIFN-γrel與其他魚類IFN-γrel的相似性高于其與同種魚類IFN-γ的相似性。鲇形目和鮭形目魚類IFN-γ與日本鰻鱺II型IFN的同源性相對高于其他魚類:在所比較的魚類IFN-γ中, 與AjIFN-γ的同源性最高者為大西洋鮭, 與AjIFN-γrel同源性最高的是斑點叉尾; 與AjIFN-γ和AjIFN-γrel的同源性最低的均為大黃魚IFN-γ (表 2)。

2.4 AjIFN-γ基因結(jié)構(gòu)分析

圖 1 氨基酸序列多重比對Fig. 1 Multiple alignment of deduced amino acid sequence of IFN-γs and IFN-γrels“–”表示空缺; “*”表示一致, “.”或“:”表示相似; 粗體為NLS; 灰底黑字為IFN-γ特征基序, 灰色名稱為IFN-γrel; 下劃線為預(yù)測的α-螺旋;灰底白字為信號肽序列; 方框內(nèi)為預(yù)測的N-糖基化位點; 黑色背景為鯉科魚類中保守的“CTC”基序”Dashes (–) indicate gaps in the alignment, asterisks (*) indicate identity and dots (or :) indicate similarity. Nuclear localization signals are in bold and the conserved IFN-γ family signatures are depicted in dark grey. Sequences underlined represent the predicted α-helices. The predicted signal peptides are in italic. The predicted N-glycosylation sites are showed in boxes. The conserved “CTC” motif is shaded in black

圖 2 AjIFN-γ(A)和AjIFN-γrel(B)成熟肽的三級結(jié)構(gòu)Fig. 2 3D structures for AjIFN-γ (A) and AjIFN-γrel (B) mature peptides

表 2 日本鰻鱺Ⅱ型IFN與其他脊椎動物Ⅱ型IFN的同源性Tab. 2 Protein homology between type Ⅱ IFN from Japanese eel and other vetebrates

使用Spidey程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ spidey/)比對AjIFN-γ和AjIFN-γrel的cDNA序列和基因組序列, 獲得其基因結(jié)構(gòu); 同時, 從Ensembl數(shù)據(jù)庫中提取人類、小鼠、雞、爪蟾、斑馬魚以及青鳉的IFN-γ以及斑馬魚和草魚IFN-γrel的基因數(shù)據(jù);使用GeneMaper 2.5 繪制基因結(jié)構(gòu)圖。結(jié)果顯示,雖然不同物種間IFN-γ的總核苷酸數(shù)量差異較大(817—5601 bp), 但是其基因結(jié)構(gòu)相似, 都由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成, 所有內(nèi)含子均為0相位, 4個外顯子的相對大小比較保守, 最小的均為外顯子2,最大的均為外顯子3 (圖 3A), 表明IFN-γ的基因結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過程中較為保守。

斑馬魚和草魚的IFN-γrel與脊椎動物IFN-γ的基因結(jié)構(gòu)相似, 也是由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成,最小和最大的外顯子也分別是外顯子2和外顯子3,但是, 其外顯子1都大于IFN-γ的外顯子1, 而外顯子4均小于IFN-γ外顯子4。值得注意的是, 與斑馬魚和草魚IFN-γrel不同, AjIFN-γrel的基因結(jié)構(gòu)僅由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成, 且外顯子3的大小約為其他物種的IFN-γ或IFN-γrel的外顯子3和外顯子4的大小之和(圖 3B)。

2.5 AjIFN-γ基因簇基因共線性分析

低等脊椎動物與哺乳動物的染色體存在共線性, 許多細(xì)胞因子基因在不同動物染色體上的位置相對保守[5,25,26]。同時, 由于魚類細(xì)胞因子與哺乳動物的同源基因間同源性低, 因此, 染色體共線性分析已成為尋找魚類細(xì)胞因子基因的常用方法之一。利用該方法, 已在魚類中發(fā)現(xiàn)了許多細(xì)胞因子基因, 包括IL-10、IL-22、IFN-γ、IL-2和IL-21等[5,6,27—29]。本研究將克隆獲得的AjIFN-γ和AjIFN-γrel基因cDNA序列在日本鰻鱺基因組數(shù)據(jù)(Gen-Bank登錄號: AVPY00000000.1)中進(jìn)行比對, 發(fā)現(xiàn)AjIFN-γ位于日本鰻鱺基因組數(shù)據(jù)庫Scoffold_1498,運用FGENESH網(wǎng)站(http://www.softberry.com/berry. phtml)對Scoffold_1498進(jìn)行基因預(yù)測, 發(fā)現(xiàn)6個基因, 其中前5個分別為MDM1、IL-22、IL-26、IFN-γ和IFN-γrel, 第6個為假定基因。我們選擇了人類、小鼠、爪蟾、斑馬魚和綠河鲀與日本鰻鱺的IFN-γ基因簇進(jìn)行共線性分析, 結(jié)果顯示, 與人類、非洲爪蟾和斑馬魚一致, AjIFN-γ上游基因主要包括MDM1、IL-22、IL-26, 但是在非洲爪蟾IL-22和MDM1之間插入了一個MDM4基因, 而在綠河鲀的IL-22與MDM1基因之間則插入了一個RAP1B基因,該基因在人類和小鼠中均位于MDM1基因的上游。小鼠IFN-γ上游有兩個IL-22基因(IL-22a和IL-22b),但是其IL-26基因為假基因, 在其序列中間插入了一段由長散布核元件(Long Interspersed Nuclear Elements, LINE)和長末端重復(fù)序列(Long Terminal Re-peat, LTR)組成的(LTR)-LINE-LTR結(jié)構(gòu)[30]。與其他脊椎動物相比, 魚類IFN-γ的上游額外增加一個IFN-γrel基因, 因此, 認(rèn)為該基因應(yīng)為魚類所特有。除了小鼠IL-22b和非洲爪蟾MDM1以外, IFN-γ基因簇上各基因的轉(zhuǎn)錄方向均相同(圖 4)。

圖 3 IFN-γ (A)和IFN-γrel (B)基因結(jié)構(gòu)比較分析Fig. 3 Comparative analysis of IFN-γ (A) and IFN-γrel (B) genomic structures線條表示內(nèi)含子, 斜線框表示外顯子, 數(shù)字表示內(nèi)含子或外顯子的堿基數(shù); 基因結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來源于Ensembl基因組數(shù)據(jù)庫Exons are showed as slash boxes and introns are presented as lines. Numbers above boxes and below lines indicate the size of exons and introns, respectively. The data are derived from Ensembl database

2.6 AjIFN-γ在魚體中的組織分布

采用實時熒光定量方法檢測AjIFN-γ在日本鰻鱺皮膚、鰓、腸、胃、肝臟、脾臟、心臟、鰾、頭腎、體腎、性腺和血液共12個組織/器官中的表達(dá)量。結(jié)果表明, AjIFN-γ在健康日本鰻鱺的所有檢測組織中均有不同程度的低水平轉(zhuǎn)錄表達(dá), 表達(dá)量約為β-actin的1‰, 其中, AjIFN-γ肝臟中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量最高, 其次是皮膚和頭腎, 在胃、性腺和鰾中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量最低(圖 5)。

2.7 Poly I:C刺激能誘導(dǎo)AjIFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

為了研究Poly I:C刺激對重要免疫器官中AjIFN-γ轉(zhuǎn)錄表達(dá)的誘導(dǎo)作用, 本研究對健康日本鰻鱺腹腔注射Poly I:C, 注射后8h、16h、24h以及72h, 采用實時熒光定量的方法分別檢測AjIFN-γ在鰓、脾臟、頭腎和體腎中的表達(dá)量, 對照組注射等體積PBS。結(jié)果顯示, Poly I:C能夠顯著上調(diào)AjIFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平(P＜0.05)。除脾臟以外, 其他3個組織中AjIFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均在Poly I:C刺激后8h極顯著上調(diào)(P＜0.01)。在鰓和體腎中, 表達(dá)量在16h達(dá)到最高, 而后下降, 在24h仍顯著高于對照組, 72h恢復(fù)到與對照組相似水平。在脾臟中, AjIFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量在刺激后各個時間點均無顯著變化(P＞0.05)(圖 6)。

2.8 遲緩愛德華氏菌感染能誘導(dǎo)AjIFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

遲緩愛德華氏菌是日本鰻鱺常見的致病菌之一, 本研究檢測了健康日本鰻鱺腹腔注射遲緩愛德華氏菌后8h、16h、24h和72h, AjIFN-γ在鰓、脾臟、頭腎和體腎中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量, 對照組注射等體積PBS。結(jié)果顯示, 遲緩愛德華氏菌感染可顯著誘導(dǎo)AjIFN-γ在鰓、頭腎、體腎和脾臟中的表達(dá)(P＜0.05)。在鰓、頭腎和體腎中, 遲緩愛德華氏菌感染8h后, AjIFN-γ的表達(dá)量先略為下調(diào), 而后在16h顯著上調(diào)(P＜0.05), 在24h達(dá)到最高水平; 在體腎中, 刺激后72h, AjIFN-γ的表達(dá)量仍極顯著高于對照組(P＜0.001), 而在鰓和頭腎中則與對照組無差異; 在脾臟中, AjIFN-γ的表達(dá)量在8h、16h和24h均顯著下調(diào)(P＜0.05), 但是呈現(xiàn)逐步上升的趨勢, 在72h表達(dá)量達(dá)到最高, 且極顯著高于對照組(P＜0.001)(圖 7)。

2.9 AjIFN-γ基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和刪節(jié)突變體活性分析

擴增日本鰻鱺AjIFN-γ基因5′-側(cè)翼區(qū)長為1536 bp的序列, 預(yù)測其轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)位于起始密碼子上游155 bp處, TATA-box位于TSS上游24 bp處; AjIFN-γ基因5′-側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(TFBS)包括GATA-1 (GATA結(jié)合因子-1)、SRF(血清應(yīng)答因子)、AP-1(激活蛋白-1)、IRF-1 (干擾素調(diào)節(jié)因子-1)、C/EBPβ (CCAAT增強子結(jié)合蛋白β)、NF-κB (核因子-κB)等(圖 8A)。

圖 4 AjIFN-γ基因座的基因共線性比較分析Fig. 4 Gene synteny analysis of the AjIFN-γ gene locus with that from human, mouse, zebrafish and Xenopus箭頭指示基因的轉(zhuǎn)錄方向, 方框內(nèi)為基因名稱?！唉住北硎炯倩駻rrows indicate gene transcription orientation. ψ represents pseudo gene

為研究AjIFN-γ啟動子活性的調(diào)控序列, 以pGL3-basic載體, 構(gòu)建了6個5′-端刪節(jié)片段的突變體質(zhì)粒(P1—P6), 并分別轉(zhuǎn)染AJSB細(xì)胞, 測定各刪節(jié)突變體的相對熒光素酶活性。以pGL3-basic為對照組。結(jié)果顯示, 6個AjIFN-γ啟動子刪節(jié)突變體的相對活性都顯著高于pGL3-basic。P6(–240/+ 136)活性約為pGL3-basic的40倍; P3(–1062/+136)活性最高, 為pGL3-basic的157倍, 并且顯著高于P2(–1252/+136)和P4(–814/+136), 而P1、P2和P4之間相對活性無顯著差異, 但其活性顯著高于pGL3-basic, 為后者的48—68倍(圖 8B)。

3 討論

哺乳動物、鳥類和兩棲類的Ⅱ型IFN成員均只有1個, 而魚類的Ⅱ型IFN包括IFN-γ和IFN-γrel。本研究克隆獲得了日本鰻鱺IFN-γ基因(AjIFN-γ)的cDNA序列, 并與本實驗室已經(jīng)克隆的日本鰻鱺IFN-γrel的cDNA序列進(jìn)行了比較分析, 同時, 對AjIFN-γ和AjIFN-γrel進(jìn)行了基因結(jié)構(gòu)和共線性分析。此外, 研究了AjIFN-γ在健康日本鰻鱺中的組織分布及Poly I:C誘導(dǎo)和遲緩愛德華氏菌感染誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)的效應(yīng), 初步揭示其在抗菌和抗病毒方面的作用。此外, 我們還克隆了AjIFN-γ的5′調(diào)控區(qū)序列,預(yù)測其中的TFBS, 并研究了其啟動子活性。

圖 5 健康日本鰻鱺不同組織/器官中AjIFN-γ相對β-actin的表達(dá)量Fig. 5 Relative expressions of AjIFN-γ in various tissues of healthy Japanese eel relative to β-actin數(shù)值通過1000×(AjIFN-γ/β-actin)公式計算; 縱軸表示平均值±SEM, N=6; 相同字母表示沒有顯著性差異, P＞0.05The value is present by 1000×(AjIFN-γ/β-actin). Vertical bars represent mean±SEM, N=6. Same letter above the bars means no significant difference. P＞0.05

圖 6 腹腔注射Poly I:C后AjIFN-γ相對表達(dá)量Fig. 6 The relative expression of AjIFN-γ in various tissues after intraperitoneal injection with Poly I:CPoly I:C刺激后8h、16h、24h、72h時, 采用real-time PCR分析不同組織中AjIFN-γ的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量; 以每個組織中β-actin作為內(nèi)參比; 縱軸表示平均值± SEM, N=6 (鰓16h組, N=5); *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, t-test; 下同Real-time PCR was used to analyze the amount of AjIFN-γ transcript in different tissues at 8h, 16h, 24h, 72h after being stimulated by Poly I:C in vivo. Copies of β-actin in each tissue was used as an internal control for normalized different samples. Vertical bars represented the mean±SEM, N=6 (for gill at 16h, N=5) *P＜0.05, **P＜0.01 and ***P＜0.001, t-test; the same applies below

圖 7 腹腔注射E. tarda后AjIFN-γ的相對表達(dá)量Fig. 7 The relative expression of AjIFN-γ after intraperitoneal injection with E. tardaE. tarda 刺激后8h、16h、24h、72h時, 采用real-time PCR分析不同組織中AjIFN-γ的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量Real-time PCR was used to analyze the amount of AjIFN-γ transcript in different tissues at 8h, 16h, 24h and 72h after being challenged by E. tardain in vivo

圖 8 AjIFN-γ啟動子刪節(jié)突變體的相對活性Fig. 8 Relative luciferase activities of promoter 5′-deletion mutants of AjIFN-γA. 用于構(gòu)建AjIFN-γ啟動子5′-端刪節(jié)突變體的插入序列及其預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點示意圖; B. AjIFN-γ啟動子5′-端刪節(jié)突變體在AJSB細(xì)胞中的相對活性; 啟動子活性以經(jīng)海腎熒光素酶活性校正的相對光度單位(RLU)表示A. Schematic diagram of the promoter deletion mutants in different length and the TFBSs on them; B. Relative luciferase activities of promoter 5′-deletion mutants of AjIFN-γ in AJSB cells

3.1 AjIFN-γ具有魚類Ⅱ型IFN的典型特征

雖然AjIFN-γ與其他物種IFN-γ的一致性較低,但是, 具有IFN-γ的典型特征, 包括特征基序“[I/V]-Q-X-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V]”、C端保守的NLS (“RRRR”)以及6個α-螺旋構(gòu)成的高級結(jié)構(gòu)。迄今, 僅在魚類中發(fā)現(xiàn)了第二個Ⅱ型IFN, 即IFN-γrel,其最初被命名為IFN-γ1[6], 隨后, 發(fā)現(xiàn)其與魚類IFN-γ同源性不高, 且與高等脊椎動物IFN-γ的同源性低, 更名為IFN-γrel[31]。與其他魚類IFN-γrel相似,日本鰻鱺IFN-γrel也缺少魚類IFN-γ的C端高度保守的由連續(xù)4個賴氨酸或精氨酸組成的NLS (為區(qū)分,以下記為NLS1)。盡管有研究認(rèn)為虹鱒IFN-γ缺失NLS1, 其生物活性受影響[13], 然而, Grayfer等[21]研究發(fā)現(xiàn), 缺乏NLS1的重組金魚IFN-γrel, 仍然具有誘導(dǎo)單核細(xì)胞反應(yīng)性氧中間物(ROI)的產(chǎn)生、激活巨噬細(xì)胞的吞噬作用、通過誘導(dǎo)iNOS基因的表達(dá)增加NO的產(chǎn)生、誘導(dǎo)前炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)以及STAT1的磷酸化作用等生物活性。最近, Shibasaki等[12]在鯽和金魚中分別克隆到2個IFN-γrel, 部分魚類IFN-γrel的C端具有一個富含堿性氨基酸的NLS(記為NLS2, 在金魚和鯽中均為“KHHHR”), NLS2也能夠發(fā)揮核定位作用。此外,他們根據(jù)IFN-γrel中是否含有NLS2分為IFN-γrel1,主要包括鯉科魚類; 缺乏NLS2的IFN-γrel為IFN-γrel2。本實驗室克隆到的AjIFN-γrel與Shibasaki等[12]所描述的IFN-γrel2相似, 也缺少NLS2。此外, AjIFN-γrel和綠河鲀IFN-γrel均缺乏鯉形總目魚類中高度保守的“CTC”基序, 推測該基序只存在于鯉形總目魚類中。

3.2 AjIFN-γ主要參與日本鰻鱺的抗病毒免疫過程

早期采用半定量PCR方法, 在健康斑馬魚和虹鱒的多個組織中均未發(fā)現(xiàn)IFN-γ的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[6,13],而斑點叉尾IFN-γ僅在頭腎和脾臟中檢測到一定的表達(dá)[7]。而采用靈敏度更高的熒光定量PCR方法后, 發(fā)現(xiàn)IFN-γ在健康魚體的不同組織中均有表達(dá), 尤其是鰓和脾臟。此外, 金魚和南亞野鯪(Labeo rohita) IFN-γ在脾臟中的表達(dá)量均高于其他組織[9,32], 鯉IFN-γ在腸和鰓中的表達(dá)量最高[8], 大西洋鱈IFN-γ在鰓和脾臟中表達(dá)量最高[14]。本研究中AjIFN-γ在所檢測的12個組織中均低水平表達(dá), 其表達(dá)模式與大黃魚IFN-γ相似, 主要在肝臟以及主要免疫組織(皮膚和頭腎)中表達(dá), 暗示其可能參與機體的免疫過程。

與哺乳動物相似, 魚類IFN-γ參與機體的抗病毒反應(yīng)。經(jīng)Poly I:C誘導(dǎo)后, 虹鱒(頭腎白細(xì)胞、腎和脾臟)、斑馬魚(鰓和腸)、大西洋鱈(頭腎)、金魚(腎白細(xì)胞)IFN-γ的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均上調(diào)[6,9,13,14]。在鯉科皰疹病毒三型感染的每一個階段, 鯉IFN-γ和IFN-γrel的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均顯著上調(diào)[16]。Stolte等[8]發(fā)現(xiàn)鯉IFN-γrel主要由IgM+細(xì)胞產(chǎn)生, 表明其主要調(diào)節(jié)體液免疫[8,33]。在本研究中, Poly I:C刺激后, AjIFN-γ在鰓、頭腎和體腎中的表達(dá)量顯著上調(diào), 尤其是體腎中, 上調(diào)約39倍, 而頭腎和體腎是硬骨魚類抗體產(chǎn)生的重要器官[34], 魚類鰓中也含有抗體分泌細(xì)胞[35,36]以及T淋巴細(xì)胞[37], 并且能高水平表達(dá)T淋巴細(xì)胞相關(guān)的基因[38,39], 推測AjIFN-γ也可能參與日本鰻鱺抗病毒的體液免疫和(或) T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

愛德華氏菌病是嚴(yán)重危害日本鰻鱺養(yǎng)殖的主要疾病之一, 流行范圍廣, 給日本、中國臺灣和大陸的養(yǎng)鰻業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[40]。有研究發(fā)現(xiàn), 褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)重組IFN-γ可激活宿主的抗遲緩愛德華氏菌感染的免疫反應(yīng)[41]。在本研究中, AjIFN-γ在鰓、頭腎和體腎中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均在遲緩愛德華氏菌感染16h開始顯著上調(diào), 24h表達(dá)水平達(dá)到最高, 而脾臟中在72h也顯著上調(diào)。該結(jié)果表明, AjIFN-γ可參與日本鰻鱺抵抗遲緩愛德華氏菌感染的免疫反應(yīng)。

3.3 AjIFN-γ啟動子活性分析

哺乳動物IFN-γ的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受一系列轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控, 尤其是NFAT、AP-1和NF-κB家族的轉(zhuǎn)錄因子[42—48]。AjIFN-γ的啟動子區(qū)存在AP-1、NF-κB、GATA-1、SRF、IRF-1、C/EBPβ等TFBS。對刪節(jié)突變體的啟動子活性的分析結(jié)果顯示, P6(–240/+ 136)的相對活性顯著高于pGL3-basic, 表明上游–240/+136區(qū)域中含有AjIFN-γ啟動子的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件, 可起始AjIFN-γ的轉(zhuǎn)錄, 該區(qū)域內(nèi)含有我們所預(yù)測的TSS和TATA-box, 說明該TSS可能是AjIFN-γ轉(zhuǎn)錄起始的位置。此外, 研究結(jié)果還顯示, P3(–1062/+ 136)相對活性最高, 且顯著高于P2(–1252/+136)和P4(–814/+136), 說明在–1062/–814區(qū)域中可能存在提高AjIFN-γ轉(zhuǎn)錄活性的TFBS, 而在–1252/–1062區(qū)域可能含有抑制AjIFN-γ轉(zhuǎn)錄活性的TFBS。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)–1062/–814區(qū)域中含有2個AP-1和1個SRF,–1252/–1062區(qū)域中包括AP-1、GATA-1和IRF-1,然而, 究竟是哪個TFBS正向調(diào)控或負(fù)向調(diào)控AjIFN-γ的轉(zhuǎn)錄表達(dá), 有待進(jìn)一步研究。值得一提的是, Lai等[49]研究發(fā)現(xiàn), 在草魚腎臟細(xì)胞中過表達(dá)IRF-1可以提高Ⅰ型IFN的啟動子活性, 而有關(guān)IRF-1對Ⅱ型IFN啟動子活性的調(diào)控作用, 未見相關(guān)報道。

綜上所述, 本研究克隆獲得了日本鰻鱺IFN-γ基因, 命名為AjIFN-γ; 研究了AjIFN-γ在日本鰻鱺中的表達(dá)情況, 發(fā)現(xiàn)其在肝臟、皮膚和脾臟中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平較高; 研究其對不同免疫刺激的響應(yīng), Poly I:C刺激和遲緩愛德華氏菌感染都能誘導(dǎo)AjIFN-γ的轉(zhuǎn)錄表達(dá); 克隆并分析AjIFN-γ的上游調(diào)控區(qū)序列, 通過構(gòu)建不同長度啟動子區(qū)刪節(jié)突變體并分析其啟動子活性, 發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)–1062/–814區(qū)域可能存在AjIFN-γ的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控元件。后續(xù)我們將通過體外重組表達(dá)獲得AjIFN-γ的重組蛋白, 對其免疫功能進(jìn)行深入研究, 并繼續(xù)細(xì)化分析AjIFN-γ的啟動子區(qū)–1062/–814區(qū)域, 進(jìn)一步研究其主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。

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CHARACTERIZATION, EXPRESSION PATTERN AND PROMOTER ACTIVITY ANALYSIS OF INTERFERON-GAMMA IN JAPANESE EEL, ANGUILLA JAPONICA

PENG Xi-Xia1, HUANG Bei1, DUAN Li-Peng1, LI Chun-Yan1, LIANG Ying1, NIE Pin1,2and HUANG Wen-Shu1,3,4
(1. College of Fisheries, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 3. Engineering Research Center of the Modern Technology for EelIndustry, Ministry of Education PRC, Xiamen 361021, China; 4. Fujian Collaborative Innovation Center for Development and Utilization of Marine Biological Resources, Xiamen 361005, China)

IFN-γ is a cytokine that is critical for innate and adaptive immunity against viral, some bacterial and protozoal infections. In this study, an interferon-γ gene, named AjIFN-γ, was cloned and characterized from Japanese eel, Anguilla japonica. The AjIFN-γ shared some common features with its vertebrate homologues including a 4-exon/3-intron gene structure, a typical IFN-γ characteristic motif and a predicted nuclear localization site in the predicted protein. AjIFN-γ mRNA could be detected in all the tested tissues from healthy Japanese eel with the highest in liver, followed by skin and head kidney by real-time RT-PCR. A significantly increased expression of AjIFN-γ could be found in gill, head kidney, trunk kidney and (or) spleen post intraperitoneal injection with Poly I:C or Edwardsiella tarda, which indicated a role in defense of Japanese eel against both viruses and bacteria. Furthermore, luciferase reporter assay demonstrated that the sequence from –240 bp to +136 bp in the 5′ flanking region of AjIFN-γ gene was essential for initiating the transcription of AjIFN-γ, and the sequence form –1062 bp to –814 bp may contain some positive transcriptional regulatory elements while the sequence from –1252 bp to –1062 bp may contain negative transcriptional regulatory elements. This study provided the basis for further investigation of the expanding functions of IFN-γ molecules in immunity and other physiological processes in teleost and other animals.

IFN-γ; Anguilla japonica; Transcriptional expression; Promoter

Q344+.1

A

1000-3207(2017)03-0589-14

10.7541/2017.76

2016-05-18;

2016-08-21

國家自然科學(xué)基金(31402329、31174238和U1205123); 福建省自然科學(xué)基金(2014J05042、2012J06008和JK2014026); 鰻鱺工程中心科研基金資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31402329, 31174238 and U1205123); the Natural Science Foundation of Fujian Province (2014J05042, 2012J06008 and JK2014026); a Fund from Engineering Research Center of the Modern Technology for Eel Industry]

彭喜霞(1990—), 女, 江西吉安人; 碩士; 主要研究方向為魚類免疫學(xué)。E-mail: pengxixia1990@163.com

聶品, E-mail: pinnie@ihb.ac.cn; 黃文樹, E-mail: wshuang@jmu.edu.cn