李茹，程濱，趙瑞芬，滑小贊，王釗

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所，山西太原030031）

不同劑量的核桃青皮對氮在土壤中轉(zhuǎn)化的影響

李茹1，程濱2，趙瑞芬2，滑小贊2，王釗2

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所，山西太原030031）

為研究核桃青皮對氮在土壤中轉(zhuǎn)化的影響，明確其對土壤氮轉(zhuǎn)化效應(yīng)，采用室內(nèi)培養(yǎng)試驗方法，研究土壤中施入不同用量的核桃青皮時，土壤中硝態(tài)氮、脲酶、硝酸還原酶和亞硝酸還原酶的變化。結(jié)果表明，與對照相比，施入核桃青皮確實有一定的硝化抑制效應(yīng)，且核桃青皮量是尿素2倍的比1倍的硝化抑制效應(yīng)明顯。綜合考慮，在土壤中施用200%核桃青皮效果較好。

核桃青皮；硝化抑制；硝態(tài)氮；酶活性

氮是植物生長發(fā)育所需要的大量元素之一，也是對作物產(chǎn)量和品質(zhì)形成起重要作用的元素[1]。我國是世界上化肥消耗量最大的國家，僅氮肥用量占世界氮肥用量的30.1%[2]，并出現(xiàn)進(jìn)一步增加態(tài)勢。現(xiàn)在多數(shù)國家土壤貧瘠，為了使農(nóng)作物增產(chǎn)，會在土壤中施用大量的肥料，以增強(qiáng)土壤的肥力[3]。其中，常見的氮肥有尿素、硫酸銨等，其主要成分為銨態(tài)氮[4-5]。氮肥在施入土壤中后，被土壤中的酶分解，最終以氨揮發(fā)、硝態(tài)氮的淋失、氧化亞氮釋放等進(jìn)入自然環(huán)境，對水體和大氣產(chǎn)生污染，甚至形成溫室效應(yīng)等環(huán)境問題[6-7]。

化肥大量施用已經(jīng)造成地下水污染、溫室氣體排放增加等大量環(huán)境問題，提高化肥利用率，是實現(xiàn)化肥零增長的有效途徑之一[8]。中國科學(xué)院南京土壤研究所對全國782個田間試驗點的氮肥利用情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明，我國氮肥利用率為28%～ 41%，平均為33.7%，比發(fā)達(dá)國家低10%～15%[9]。大量研究表明，應(yīng)用硝化抑制劑能顯著提高氮肥利用率[10-12]。目前，化學(xué)合成的硝化抑制劑已經(jīng)作為氮肥增效劑應(yīng)用在肥料中。

核桃（Juglans regia L.）又名胡桃、羌桃，核桃屬，外部有一層厚厚的綠色果皮，即為核桃青皮。有研究表明，核桃葉、枝、青皮、樹皮都有藥用價值，因核桃青皮中含有萘醌及其苷類、黃酮及其苷類、二芳基庚烷類、萜類、有機(jī)酸類等化合物，具有抑菌和消毒等功能[13-15]。朱天慧等[16]報道了核桃青皮可以抑制硝化作用，減少N2O的排放。此外，核桃青皮作為有機(jī)物質(zhì)施入土壤，可以改善土壤環(huán)境、提高土壤有機(jī)質(zhì)。

本試驗比較系統(tǒng)地研究了核桃青皮對土壤中硝化抑制作用的影響效果，旨在探討核桃青皮的施用劑量，以明確核桃青皮對氮是否有硝化作用，為獲得一種天然的、價廉物美和無土壤污染的氮肥增效劑提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試土壤為壤土，采自汾陽市0～20 cm耕層土壤，通過多點采樣法進(jìn)行采集，把采取的土壤樣品進(jìn)行風(fēng)干，清理掉土壤樣品中與試驗沒有關(guān)系的物質(zhì)，在其經(jīng)過混合、攪拌、磨細(xì)等過程之后，過2 mm篩，放置待用。供試土壤的基本理化性質(zhì)列于表1。核桃青皮用量分別為：純氮量的0%（CK），100%（處理1），200%（處理2）共3個水平，每處理4次重復(fù)。供試尿素用量為每千克風(fēng)干土0.5 g。

表1 供試土壤的基本理化性質(zhì)

1.2 試驗設(shè)計

在備用的土壤樣品中取200 g置于培養(yǎng)皿中，通過用噴水容器在土壤表面噴灑一定量的蒸餾水，對土壤樣品的含水量進(jìn)行調(diào)節(jié)，使其達(dá)到WHC（田間最大持水量）的60%，因為試驗所采用的土壤樣品是風(fēng)干土，因此其水分含量按3%計算。在培養(yǎng)試驗開始之前，將0.1 g尿素和不同用量的核桃青皮分別添加到玻璃培養(yǎng)皿中，充分混勻；后將培養(yǎng)皿放置在溫度25℃的智能植物培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)[17]。在放入培養(yǎng)箱后，第1，3，5，7，11，15，20，25，30天分別對培養(yǎng)皿中的土壤進(jìn)行取樣，土樣質(zhì)量約為25 g。同時將2.0 mol/LKCl溶液倒入樣品中，進(jìn)行充分混合，浸出土壤樣品溶液，然后過濾，將濾液保存在-20℃冷凍箱中，以抑制土壤中的無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮，以免影響樣品中硝態(tài)氮的測定。在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)皿中的土壤水分會蒸發(fā)損失，因此，每隔2 d通過稱重法用蒸餾水補(bǔ)充。培養(yǎng)結(jié)束后，對土壤樣品進(jìn)行風(fēng)干，用于測定土壤酶的活性。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 硝態(tài)氮含量的測定[18]將2 mol/LKCl溶液加入土壤樣品中，對土壤進(jìn)行浸提（m（KCl）∶m（土）＝5∶1），用振蕩器振蕩30 min后，用流動分析儀對土壤中硝態(tài)氮含量進(jìn)行測定。

1.3.2 土壤脲酶的測定其采用比色法[19]。在堿性溶液中及亞硝基鐵氰化鈉催化劑存在下，以尿素為基質(zhì)產(chǎn)生的脲酶酶促產(chǎn)物與苯酚-次氯酸鈉反應(yīng)并且會生成藍(lán)色的靛酚，578 nm比色測定酶促反應(yīng)后藍(lán)色靛酚的量，來表征脲酶的活性，酶活性單位為mgNH3-N/（24 h·gsoil），以mg/g計。

1.3.3 土壤硝酸還原酶的測定其采用比色法[20]。在培養(yǎng)皿中加入硝酸鉀溶液，然后將抑制亞硝酸還原酶活性的2，4-二硝基苯酚添加進(jìn)培養(yǎng)皿中，經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)后會產(chǎn)生亞硝酸根離子，然后將它和Грисс試劑混合在一起，使其產(chǎn)生顏色反應(yīng)，并在520 nm條件下進(jìn)行比色，進(jìn)行酶促反應(yīng)，并且對反應(yīng)過程中生成的亞硝態(tài)氮的含量進(jìn)行測定，來比較土壤中所含有的硝酸還原酶的活性，酶活性單位為mgNO2-N/（24 h·gsoil），以mg/g計。

1.3.4 土壤亞硝酸還原酶測定[21]其采用比色法。在土壤中加入一定量的亞硝酸鈉溶液，把亞硝酸鈉作為反應(yīng)的底物，在反應(yīng)進(jìn)行過程中，會產(chǎn)生一定量的亞硝酸根，將產(chǎn)生的亞硝酸根和鹽酸萘乙二胺試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，并在520 nm條件下進(jìn)行比色，然后通過測定亞硝酸還原酶酶促反應(yīng)前后亞硝態(tài)氮含量之差，來表征土壤中亞硝酸還原酶的活性，酶活性單位為mgNO2-N/（24 h·gsoil），以mg/g計。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel 2007和SPASS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃青皮對土壤中硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化的影響

2.2 核桃青皮對與尿素轉(zhuǎn)化有關(guān)的土壤酶的影響

2.2.1 核桃青皮對土壤中脲酶活性的影響土壤脲酶在土壤氮素循環(huán)中有著不可替代的作用[22]，土壤中含氮有機(jī)物的轉(zhuǎn)化也需要脲酶的參與，土壤氮素供應(yīng)強(qiáng)度常常用其活性強(qiáng)度來表示。脲酶比較專性，由于土壤中脲酶的存在，土壤中的尿素才能夠進(jìn)行水解，變?yōu)榘?、二氧化氮和水。在試驗過程中，土壤脲酶的活性在初期和后期出現(xiàn)高峰（圖2）。對土壤處理不一樣，脲酶的活性出現(xiàn)高峰的時間也不一樣，其中，對照出現(xiàn)的高峰時間是5，20 d；處理1出現(xiàn)高峰的時間是3，11 d；處理2出現(xiàn)高峰的時間是5，15 d。核桃青皮與對照相比，土壤脲酶活性并沒有呈現(xiàn)明顯的降低。表明核桃青皮能抑制土壤脲酶的活性，減緩尿素的水解，使得土壤可以較多地吸附尿素的水解產(chǎn)物，從而減少氨的揮發(fā)。

2.2.2 核桃青皮對土壤中硝酸還原酶活性的影響

硝酸還原酶作為一種催化劑，能使土壤中的硝酸鹽在有氧條件下，轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽；在厭氧條件下，則起到反硝化作用[23-24]。本試驗主要是為了驗證硝酸還原酶的反硝化作用。通過分析得出，硝酸還原酶活性高峰出現(xiàn)的時間與脲酶完全不同，同時各個處理出現(xiàn)高峰的時間也不相同（圖3）。

在試驗過程中，不同處理的核桃青皮，在第7天左右出現(xiàn)了第1個活性高峰。與對照組相比，添加了核桃青皮的硝酸還原酶的活性均要高一些，而添加200%核桃青皮處理的硝酸還原酶的活性最高。在之后的培養(yǎng)過程中，由于添加的尿素會水解生成氨、二氧化氮和水，使得土壤中硝化作用提高，抑制了試驗培養(yǎng)過程中土壤中硝酸還原酶的活性，這種變化與李東坡等[25]的研究結(jié)果大體上一致。土壤中的硝酸還原酶受核桃青皮添加量的影響，酶自始至終保持較高的活性，加快土壤中硝酸根離子還原為亞硝酸根離子，降低了土壤中硝酸根離子的含量，同時也減少了土壤中硝酸鹽不同程度的累積和淋溶，在反硝化作用進(jìn)行的過程中，反應(yīng)產(chǎn)生的NO3-作為底物會產(chǎn)生N2O等溫室氣體，硝酸還原酶會減少這種氣體的產(chǎn)生，從而降低氮的損失和空氣污染的可能性。

2.2.3 核桃青皮對土壤中亞硝酸還原酶活性的影響本試驗主要研究的是亞硝酸還原酶作為土壤中的一種催化劑，在有氧條件下，使亞硝酸鹽變?yōu)榱u胺。土壤亞硝酸還原酶隨著條件的不同呈現(xiàn)不同的變化趨勢（圖4），各處理時間隨培養(yǎng)時間的延長，呈波動性下降趨勢，而對照組波動性下降以后又有上升的趨勢。

在試驗過程中，添加核桃青皮的亞硝酸還原酶的活性均比對照高，而在培養(yǎng)開始后的第20天和第15天之后處理1和處理2分別低于了對照處理，說明核桃青皮隨著時間的延長對土壤中亞硝酸鹽還原酶的抑制作用下降。如果土壤中存在的亞硝酸還原酶活性比較高，那么在培養(yǎng)過程中就有可能加快土壤中累積的亞硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為NH2OH的過程，從而減少其對土壤產(chǎn)生的傷害，降低亞硝酸鹽氮的積累。

3 結(jié)論與討論

在土壤中添加核桃青皮可以降低培養(yǎng)過程中NH3的表觀濃度。添加核桃青皮既可以使得土壤中濃度保持在對照組之下，也可以在反應(yīng)過程中使淋失的概率變小，大大地增強(qiáng)了土壤中的穩(wěn)定性，使NH3的直接揮發(fā)量減少。在反應(yīng)過程中，添加核桃青皮還可以促進(jìn)黏附在土壤顆粒上，降低土壤中的含量，使尿素能夠長時間保持肥效，提高氮素的綜合利用率[26]。

本試驗通過研究核桃青皮對氮在土壤中轉(zhuǎn)化的影響，比較不同濃度的核桃青皮的抑制效果，并探討了核桃青皮在酶學(xué)上的抑制機(jī)制，旨在選擇土壤中較理想的核桃青皮量，為進(jìn)一步提高氮素利用率、減少環(huán)境污染提供依據(jù)。結(jié)果表明，核桃青皮可使土壤中尿素水解的時間延長，使土壤中的氧化作用被抑制，降低土壤中的含量，并且延滯土壤中的硝化作用，降低淋溶及累積的可能性。核桃青皮使得釋放密度大的時間變長，對反應(yīng)過程中所進(jìn)行的的硝化作用有著明顯的抑制作用，大大提高了尿素的綜合利用率。

在土壤中加入核桃青皮對與硝化作用有關(guān)的各種酶類都有不同程度的影響，如脲酶、硝酸還原酶和亞硝酸還原酶等水解酶類，使土壤中的脲酶和亞硝酸還原酶不能發(fā)揮其最大的作用，而使土壤中硝酸還原酶的活性得到最大發(fā)揮，通過改變不同酶活性的方式，對土壤中的氮轉(zhuǎn)化起到一定的作用。在土壤中加入200%核桃青皮效果較好。

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Effects of Different Doses of Walnut Green Husk on Transformation of Nitrogen in the Soil

LI Ru1，CHENGBin2，ZHAORuifen2，HUAXiaozan2，WANGZhao2
（1.College ofBiological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute ofAgricultural Environment&Resources，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

Tostudythe effect ofwalnut green husk on transformation ofnitrogen in the soil and clear its transformation effect on soil nitrogen，the paper uses indoor test methods,researches in the soil the different dosage of walnut green husk,the change of nitrate nitrogen in the soil,urease,and nitrate reductase and nitrite reductase.The results show that compared with controls,application the walnut peel does have a certain inhibitory effect,and the amount of walnut green husk is urea twice more than double the nitrification inhibition effect is obvious.Consideringthe effect ofapplying200%walnut green husk in the soil is better.

walnut green husk;nitrification inhibition;nitrate nitrogen;enzyme activity

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.05.30

S158

：A

：1002-2481（2017）05-0791-04

2016-12-09

山西省科技攻關(guān)項目（20150311014-4）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新研究課題（ZDFYS1511）

李茹（1991-），女，山西永濟(jì)人，在讀碩士，研究方向：土地生產(chǎn)力恢復(fù)與荒漠化防治。程濱為通信作者。