韓永利，張建海

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

氟對(duì)雄性大鼠附睪組織形態(tài)學(xué)的影響

韓永利，張建海

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

試驗(yàn)選取12周齡雄性Wistar大鼠48只，隨機(jī)分為2組，其中，對(duì)照組大鼠飲用去離子水，處理組大鼠飲用含100 mg/L氟化鈉的去離子水，染氟56 d后，取附睪組織，經(jīng)Bouin′s固定液固定制作石蠟切片，進(jìn)行組織切片形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，處理組精子的排列方式由分散于整個(gè)附睪管變成集中于附睪管一端；附睪管內(nèi)的上皮細(xì)胞出現(xiàn)了松散的現(xiàn)象，上皮變矮，胞質(zhì)疏松；管腔內(nèi)的精子空虛，主細(xì)胞之間的間隙明顯增加，排列不精密。說明氟暴露會(huì)導(dǎo)致附睪管內(nèi)精子的數(shù)量減少、附睪管形態(tài)發(fā)生改變，具體表現(xiàn)在附睪管上皮細(xì)胞由緊密排列變得松散、分裂。結(jié)果可為氟的生殖毒性研究與檢測提供依據(jù)。

氟；附睪管；主細(xì)胞

氟中毒是一種嚴(yán)重危害人畜環(huán)境的化學(xué)性疾病，在動(dòng)物中，主要以消瘦、骨骼牙齒損害為主[1]。近年來，越來越多研究表明，氟對(duì)雄性生殖系統(tǒng)具有重要作用[2-3]，其研究主要集中于睪丸組織。還有研究表明，氟中毒可引起雄性動(dòng)物附睪成熟精子超微結(jié)構(gòu)改變[4]。附睪是雄性動(dòng)物的重要生殖器官，具有生精和內(nèi)分泌的功能，精子在睪丸的曲細(xì)精管中產(chǎn)生，但必須經(jīng)過附睪才能漸漸成熟，附睪結(jié)構(gòu)的完整與否直接或間接地影響精子是否成熟，從而影響雄性的繁殖能力及子代的健康。

本試驗(yàn)對(duì)處理組大鼠飲用含100 mg/L氟化鈉的蒸餾水，染氟56 d后，取附睪組織，經(jīng)Bouin′s固定液固定制作石蠟切片，進(jìn)行組織切片形態(tài)學(xué)觀察，主要研究氟對(duì)附睪的形態(tài)學(xué)變化，旨在為進(jìn)一步研究氟對(duì)生殖系統(tǒng)的影響與檢測提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供驗(yàn)動(dòng)物為普通級(jí)12周齡Wistar雄性大白鼠48只，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要儀器及試劑

生物顯微鏡購自日本Olympus公司；生物組織包埋機(jī)（HY-BM1160）購自金華惠支儀器設(shè)備有限公司，生物組織切片機(jī)（RM2265）購自德國Leica公司；生物組織攤烤片機(jī)（YT-6C）購自湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；氟化鈉（NaF）購自天津市化學(xué)試劑三廠。冰醋酸（AR）、生理鹽水、甲醛、蘇木素、伊紅、無水乙醇等均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物的分組及染毒12周齡Wistar雄性大白鼠48只，進(jìn)行7 d適應(yīng)性飼養(yǎng)后，根據(jù)體質(zhì)量和活動(dòng)相近程度隨機(jī)分成對(duì)照組（大鼠自由飲用去離子水）和高氟組（大鼠飲用含質(zhì)量濃度為100 mg/L的氟化鈉（NaF）水（去離子水配制，自由飲用）），每組24只，進(jìn)行分籠飼養(yǎng)，其處理?xiàng)l件如表1所示。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及氟的處理?xiàng)l件

1.3.2 試驗(yàn)樣品采集和前處理分別在大鼠染毒56 d后，每組隨機(jī)抽取大鼠10只，運(yùn)用代謝籠收集晨尿（24 h），4℃保存，用于氟含量測定，后稱質(zhì)量；然后，按100 g體質(zhì)量0.7 mL腹腔注射20%烏拉坦麻醉，迅速剖開大鼠，取睪丸稱質(zhì)量后，37℃生理鹽水心臟灌流，取附睪組織稱質(zhì)量，切取部分組織迅速固定；余下組織稱質(zhì)量后，分裝，于-80℃冷凍備用。

1.3.3 大鼠生長發(fā)育情況觀察染毒期間，隨時(shí)觀察動(dòng)物的精神體態(tài)與生長發(fā)育狀況，每天詳細(xì)記錄飲水和進(jìn)食情況，每周稱質(zhì)量一次。染毒結(jié)束后，根據(jù)記錄的各臟器濕質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)。

臟器系數(shù)＝臟器濕質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）× 100%。

1.3.4 制作大鼠附睪的組織切片取出附睪組織后，放入Bouin′s固定液中，固定12 h后，直接放入70%酒精中，中間換液2～3次，洗去淡黃色苦味酸后，依次用80%，85%，90%，95%（2次），100%（2次）梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋。采用常規(guī)的HE染色，制作石蠟切片。之后在光學(xué)顯微鏡下觀察附睪的組織結(jié)構(gòu)和精子的排列、形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，測定結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。差異顯著性利用one-way analysis of variance（ANOVA）進(jìn)行分析，*代表P＜0.05差異顯著，**代表P＜0.01差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠生長發(fā)育情況和附睪臟器系數(shù)變化

由表2可知，在處理28 d后，與對(duì)照組相比，高氟組附睪臟器系數(shù)差異不顯著；處理56 d后，與對(duì)照組相比，高氟組附睪臟器系數(shù)有下降趨勢，但差異不顯著。

表2 雄性大鼠附睪臟體比值

2.2 大鼠睪組織的形態(tài)變化

對(duì)照組大鼠附睪組織的形態(tài)如圖1-A，B所示。在大鼠附睪管內(nèi)的精子分布狀況是分散存在于附睪管內(nèi)，精子的排列不規(guī)范，精子在附睪管內(nèi)清晰可見。如圖1-C所示，觀察附睪管的黏膜上皮表面光滑完整，可見主細(xì)胞緊密地排列在一起，主細(xì)胞呈高柱狀，在主細(xì)胞的游離面有成簇的靜纖毛，胞質(zhì)紅染，胞核圓。

高氟組大鼠附睪的組織形態(tài)如圖1-D所示。附睪管內(nèi)的精子排列與對(duì)照組相比發(fā)生明顯的變化，其中，附睪管內(nèi)的精子不均勻地排列在附睪管內(nèi)，有向一側(cè)集中的表現(xiàn)，說明可能附睪內(nèi)的精子失去了運(yùn)動(dòng)能力，而附睪管內(nèi)的上皮細(xì)胞出現(xiàn)了松散的現(xiàn)象，上皮變矮，胞質(zhì)疏松，管腔內(nèi)的精子空虛。如圖1-E，F(xiàn)所示，主細(xì)胞之間的間隙明顯增加，排列不精密、分開，主細(xì)胞游面的靜纖毛消失，胞核的形狀不規(guī)則，排列不整齊，有的核染色加深而小。

3 結(jié)論與討論

氟的生殖毒性主要表現(xiàn)在精子生成障礙、精子數(shù)量下降[5]、精子活動(dòng)率下降[6]和精子畸形率升高[7]。研究發(fā)現(xiàn)，工業(yè)性氟暴露會(huì)使人精子數(shù)量減少、精子活動(dòng)力降低，且僅為同齡組健康人的50%或更低，說明氟對(duì)精子具有較明顯的損傷作用[8]。氟可以進(jìn)入附睪組織里，使附睪的血-附睪屏障缺失或損壞，并最終損害其精子的成熟和儲(chǔ)存功能[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠飲用質(zhì)量濃度為130 mg/L的氟化鈉水，會(huì)導(dǎo)致染毒鼠精子數(shù)目下降、畸形率增高[10]。

附睪是哺乳動(dòng)物精子成熟、獲得受精能力[11-12]、儲(chǔ)存和保護(hù)精子的重要器官，其具有血-附睪屏障和免疫屏障2個(gè)屏障作用[13]。附睪的免疫屏障和血－附睪屏障的缺失或損害，會(huì)導(dǎo)致精子及其功能受到傷害[14]。附睪是精子的儲(chǔ)存場所，精子由睪丸運(yùn)輸?shù)礁讲G后即開始儲(chǔ)存，成熟后的精子獲得了活動(dòng)力和受精能力，然后儲(chǔ)存在附睪尾和輸精管內(nèi)[15]。附睪具有內(nèi)分泌功能，來自附睪的睪丸網(wǎng)液會(huì)產(chǎn)生很高的雄激素，附睪上皮本身也可以分泌少量的雄激素，它對(duì)精子的成熟與獲能起重要作用。附睪具有多種糖蛋白，附睪管內(nèi)的主細(xì)胞能分泌甘油磷酸膽堿、肉毒堿、抗氧化酶[16]以及多種酶，其與精子的生理功能、精子的成熟、精子的活力息息相關(guān)[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，附睪管頭部對(duì)精子的成熟具有十分重要的作用[19]。

精子在附睪內(nèi)的成熟過程包括獲得了前向運(yùn)動(dòng)能力[17]、固著于透明帶的能力和受精能力[20]，附睪這一功能與主細(xì)胞密切相關(guān)。本試驗(yàn)通過大鼠染氟56 d對(duì)附睪的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，氟會(huì)對(duì)生殖系統(tǒng)造成危害，而關(guān)于氟是如何引起附睪的內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的損傷，以及氟是如何造成附睪內(nèi)部主細(xì)胞的損傷，進(jìn)而影響到精子在附睪內(nèi)部成熟的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Fluoride on Morphology of Epididymis in Male Rats

HANYongli，ZHANGJianhai
（College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The objective of this study was to explore the effect of fluoride on the histomorphology of epididymis in rats,and to provide the basis for the studyand detection offluoride toxicity.Forty-eight healthy12-week-old male Wistar rats were randomlydivided into two groups.The rats in the control group were drinking distilled water.The rats in the experimental group were drinking distilled water containing 100 mg/L sodium fluoride and exposed to fluoride for 8 weeks.Epididymis was made into paraffin sections by Bouin′s fixative fixed and observed tissue section morphology.The results showed that sperm focused on the epididymal tube end in the experimental group compared with the control group scattered throughout the epididymal tube.Epithelial cells in the epididymal tube was loose,epithelial was dwarf and cytoplasm was loose.There was a little sperm in the tube.The gaps between the main cells were significantly increased.The results suggested that the number of sperm in the epididymal tube was reduced and epididymal tube shape was changed.The shape ofepithelial cells in the epididymal tube became closelyintoloose and split.

fluoride;epididymal tube;chiefcell

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.05.18

R995；S865.1＋2

：A

：1002-2481（2017）05-0743-03

2017-03-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（面上項(xiàng)目）（31172380）

韓永利（1989-），男，內(nèi)蒙古包頭人，在讀碩士，研究方向：環(huán)境獸醫(yī)學(xué)。張建海為通信作者。