王丹丹，李衛(wèi)華，時夏，劉坤，郭海平，閆鵬帥，謝惠玲，白琪林

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點實驗室，河南鄭州450002）

玉米穗粗雜種優(yōu)勢位點的初步定位

王丹丹1，2，李衛(wèi)華3，時夏3，劉坤3，郭海平3，閆鵬帥3，謝惠玲3，白琪林2

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點實驗室，河南鄭州450002）

以玉米自交系C7-2為供體、lx9801為受體所構(gòu)建的一批含有雜種優(yōu)勢位點的單片段代換系10su076-3為材料，利用供體染色體片段（C7-2）兩端的純合分子標(biāo)記對單片段代換系與輪回親本lx9801構(gòu)建的BC7F2分離群體的單粒胚乳進(jìn)行分析，篩選含有穗粗雜種優(yōu)勢位點的交換單株，主要目的是對控制穗粗雜種優(yōu)勢的位點進(jìn)行定位。通過對不同交換單株與自交系鄭58的雜交組合、對照雜交種魯單9002的穗粗表型進(jìn)行鑒定，最終將控制穗粗雜種優(yōu)勢位點定位在2號染色體上2.04 bin。

玉米；穗粗；雜種優(yōu)勢位點

玉米是我國重要的糧食作物，提高玉米產(chǎn)量是育種家的育種目標(biāo)[1]。而玉米的單株產(chǎn)量受穗行數(shù)、行粒數(shù)、百粒質(zhì)量3個主要因子的影響，鑒于穗行數(shù)與穗粗呈正相關(guān)，因此，可以通過增加穗粗使得穗行數(shù)也增加，進(jìn)而提高玉米的產(chǎn)量[2]。韓立軍等[3]對玉米穗粗進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穗粗的遺傳為超顯性遺傳，顯性基因為增效基因；如果母本為長筒穗型Mo17，父本為粗穗型340，更容易得到粗穗、大穗型的玉米品種。張懷勝等[4]選取了2個組合的6個世代對玉米穗粗的遺傳模型進(jìn)行分析，結(jié)果表明，PH6WC/7873組合的穗粗為加性—顯性—上位性多基因混合遺傳模型，而MX002/MS001組合的穗粗為1對加性主基因+加性—顯性多基因混合遺傳模型。VELDBOOM等[5]利用RFLP分子標(biāo)記的方法對自交系Mo17×H99的150個F2∶3家系進(jìn)行定位，結(jié)果檢測到4個控制穗粗的QTL。代國麗等[6]將控制玉米穗粗的QTL位點定位到第10染色體的umc1962和umc1152之間。BEAVIS等[7]對B73× Mo17的F2∶4后代進(jìn)行檢測，結(jié)果也檢測到了控制穗粗的QTL。SABADIN等[8]對400個F2∶3家系進(jìn)行檢測，結(jié)果檢測到5個控制穗粗的QTL。

雜種優(yōu)勢普遍存在于各類農(nóng)作物中[9-10]。前人對雜種優(yōu)勢的研究數(shù)不勝數(shù)[11-12]，湯繼華等[13]利用單片段代換系的測交群體對玉米產(chǎn)量相關(guān)性狀的雜種優(yōu)勢位點進(jìn)行定位，結(jié)果檢測到64個與產(chǎn)量相關(guān)的雜種優(yōu)勢位點，其中，有23個在2個環(huán)境中都可以檢測到，包括4個與穗長有關(guān)的雜種優(yōu)勢位點，4個與穗粗有關(guān)的雜種優(yōu)勢位點，4個與穗行數(shù)有關(guān)的雜種優(yōu)勢位點，7個與行粒數(shù)有關(guān)的雜種優(yōu)勢位點，4個與產(chǎn)量有關(guān)的雜種優(yōu)勢位點。郭戰(zhàn)勇等[14]利用單片段代換系的測交群體對玉米籽粒性狀相關(guān)的雜種優(yōu)勢位點進(jìn)行定位，共檢測到75個雜種優(yōu)勢位點，有11個在2個環(huán)境中都可以檢測到。張祖新等[15]利用染色體單片段代換系對玉米產(chǎn)量相關(guān)的QTL位點進(jìn)行定位，共檢測到22個與產(chǎn)量相關(guān)的QTL位點，其中，有11個是控制穗行數(shù)的QTL，4個是控制穗長的QTL，7個是控制行粒數(shù)的QTL。盡管前人對玉米的穗粗進(jìn)行了大量的研究，但目前對控制玉米穗粗基因克隆的報道還很少，所以，研究控制玉米穗粗的QTL位點將對育種家選育高產(chǎn)玉米品種起到指導(dǎo)作用。

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，通過對分子標(biāo)記的開發(fā)，篩選包含穗粗雜種優(yōu)勢基因的供體染色體區(qū)段（C7-2）與受體染色體區(qū)段（lx9801）的交換單株，并且結(jié)合雜交組合與對照雜交種穗粗表型的田間鑒定，從而實現(xiàn)對穗粗雜種優(yōu)勢基因位點的初步定位。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為以C7-2作供體親本、lx9801作受體親本，經(jīng)過7個世代的回交和2個世代的自交，構(gòu)建的107份以lx9801為遺傳背景的C7-2染色體單片段代換系群體。

1.2 田間表型的鑒定

將通過標(biāo)記跟蹤選擇出含有目的基因的單片段代換系與鄭58進(jìn)行測交，將構(gòu)建的含有控制穗粗雜種優(yōu)勢位點的測交群體（CSSSLs×鄭58）和對照種魯單9002（鄭58×lx9801）分別種植在河南長葛縣和?？h試驗田，每個試點采取相同的田間管理方式，采取完全隨機區(qū)組設(shè)計的方法[16]，3個重復(fù)，單行區(qū)，行長為4 m，每行大約為15株。為了保證定位結(jié)果的準(zhǔn)確性，每隔5行種植一行對照種魯單9002[17]。等到成熟后每行收取10個穗子，自然晾干后對每個穗子進(jìn)行考種，分別測量每個穗子的單穗粗和單軸粗[18-19]。如果鑒定的穗粗性狀明顯大于對照，則認(rèn)為該單片段代換系含有目的基因，而后再進(jìn)行下一步的工作。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 18.0對考種數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[20]。以魯單9002（鄭58×lx9801）穗部的測量數(shù)據(jù)為對照，對含有控制穗粗雜種優(yōu)勢位點的測交群體（CSSLs×鄭58）穗部的測量數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，若P≤0.05，則認(rèn)為該供體片段含有控制穗粗雜種優(yōu)勢的位點。

1.4 DNA提取

葉片DNA的提取采用改良的SLS法[21]，胚乳DNA的提取采用NaOH裂解法[22]。

1.5 SSR反應(yīng)程序

1.5.1 PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序PCR的反應(yīng)體系和PCR的反應(yīng)程序參考VANDANA[23]文獻(xiàn)中所提到的方法。

1.5.2 擴增產(chǎn)物檢測用聚丙烯酰胺凝膠（6% PAGE）電泳對擴增的DNA產(chǎn)物進(jìn)行檢測[24]。

1.5.3 SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)收集本研究中分子標(biāo)記的篩選和片段的跟蹤是關(guān)鍵，由于利用的是高級作圖群體單片段代換系，所以篩選分子標(biāo)記的過程中只需進(jìn)行親本間的比較即可，將C7-2的帶型記為2，lx9801的帶型記為1，雜合帶型記為3，進(jìn)行PAGE電泳數(shù)據(jù)分析，判斷亞單片段代換系長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 交換單株的篩選和雜交組合的組配

對2014年組配的群體BC7F2進(jìn)行交換單株篩選，通過田間取樣葉片DNA提取，共篩選了3 000份分離群體，篩選出交換單株72份，并對其片段長度進(jìn)行檢測，獲得72份材料的代換片段長度，這些亞單片段材料作為父本與鄭58構(gòu)建測交群體；2014年海南加代期間與lx9801回交構(gòu)建BC8F1群體；2015年夏播時，將這些回交F1的分離群體自交，從而構(gòu)建回交F2群體，使BC8F2群體數(shù)量達(dá)到3.5萬份；2015年夏天，在試驗地長葛和新鄉(xiāng)，分別種植鑒定群體，以進(jìn)行表型的調(diào)查統(tǒng)計分析，從而確定穗粗雜種優(yōu)勢位點可能存在的位置。

2015年秋季對2014年冬季的測交群體完成了考種，通過重疊群分析，確定了穗粗雜種優(yōu)勢位點所在的片段的長度，以及此片段左右兩側(cè)的標(biāo)記的物理距離，并通過不同位置上的標(biāo)記將夏季自交組配的3.5萬份BC8F2分離群體進(jìn)行了分類，結(jié)合秋季的考種結(jié)果和交換單株的基因型信息，挑選出BC8F2群體中含有穗粗雜種優(yōu)勢位點的群體材料進(jìn)行大群體篩選，最終完成初步定位。

2.2 表現(xiàn)型的結(jié)果分析

2015年夏天在長葛和新鄉(xiāng)2個試驗地，分別種植BC7F2交換單株的測交群體。將每份測交材料（CSSLs×鄭58）分別與臨近對照（lx9801×鄭58）進(jìn)行比較，分析測交后代與對照間穗粗差異是否顯著，具體分析結(jié)果如表1所示。

表1 含有穗粗雜種優(yōu)勢位點的不同次級單片段代換系測交后代與對照間穗粗的差異比較

從表1可以看出，14SS5316-4，14SS5316-5，14SS5315-8的測交后代在不同的2個試驗點種植與鄰近對照進(jìn)行比較，穗粗性狀均存在顯著性差異（圖1），可以確定這些亞單片段代換系的代換片段上都有玉米穗粗雜種優(yōu)勢位點。值得注意的是，同樣的材料在長葛點差異只達(dá)到了顯著水平（P＜0.05），而在?？h則均表現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01），可能是因為地力差異導(dǎo)致，長葛在河南地區(qū)屬于中低產(chǎn)田，而?？h則屬于高產(chǎn)田，即環(huán)境差異對于雜種優(yōu)勢的強弱具有一定的影響力，說明雜種優(yōu)勢的強弱程度與環(huán)境相關(guān)。

數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，這3份材料雖然在目標(biāo)性狀穗粗上與對照相比都存在顯著性差異，但是在一年2點的田間鑒定中穗軸性狀與對照相比也存在一定的差異，表2的數(shù)據(jù)說明穗粗存在顯著性差異，原因可能是由于軸粗差異導(dǎo)致，但是在長葛試驗點14SS5316-5，14SS5315-8與對照相比，軸粗性狀上均無顯著性差異，說明軸粗對于穗粗性狀有一定的貢獻(xiàn)，但是效應(yīng)微小，尤其是在地力較差的試驗點，對穗粗沒有貢獻(xiàn)。

表2 含有穗粗雜種優(yōu)勢位點的不同次級單片段代換系測交后代與對照間的穗軸粗差異比較

2.3 玉米試驗材料重疊群的分析

對不同材料的基因型信息進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖2所示。圖2顯示的含有代換片段的位點為黑色，不含代換片段的部分為白色，通過分析不同材料的表型數(shù)據(jù)，再結(jié)合重疊圖比對的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，圖2箭頭所示片段含有穗粗雜種優(yōu)勢位點。

3 討論

對于雜種優(yōu)勢分子機理的研究仍然停留在假說階段[25]，目前為止還沒有一個定論，故揭示雜種優(yōu)勢的分子機理對于人類認(rèn)識這種自然現(xiàn)象有著重要的指導(dǎo)意義[26-27]。

本研究通過分子標(biāo)記的開發(fā)和通過對CSSLs構(gòu)建的回交F2分離群體的分析，將目標(biāo)片段假設(shè)的錨定在300 kb左右。初級單片段的片段長度為1 400萬bp，通過分子標(biāo)記的跟蹤和分割，將大片段分割為3個300 kb左右的小片段，具體目的基因的位置位于哪個亞單片段代換系，需要對亞單片段代換系與自交系鄭58的測交群體與對照魯單9002的田間表型進(jìn)行鑒定。由于表型鑒定方面的不穩(wěn)定性，為目的片段的確定設(shè)置了障礙，所以我們通過一年多點的方法去消除這些誤差。為了進(jìn)一步提高定位的準(zhǔn)確性，每隔5行種植1行對照。

本研究所選用的基礎(chǔ)材料是一套以lx9801為背景的C7-2單片段代換系，因此，經(jīng)過試驗篩選出的差異性狀的材料，除了在供體片段上與自交系lx9801存在差異外，其他的遺傳背景一致，一旦發(fā)現(xiàn)差異性狀均可認(rèn)為是由代換片段引起的，排除了不同環(huán)境和不同遺傳背景對雜種優(yōu)勢表型鑒定的影響，這些優(yōu)勢條件都為雜種優(yōu)勢的研究提供了便利和可靠的保障，也為在單基因水平上揭示雜種優(yōu)勢的形成機理提供了條件[28]。

本研究只是初步將控制穗粗的雜種優(yōu)勢位點定位在第2染色體2.04 bin，接下來還需要進(jìn)一步擴大含有穗粗雜種優(yōu)勢位點的測交群體，參考B73序列設(shè)計SSR引物，篩選出lx9801與C7-2有差異的標(biāo)記，通過幾輪的回交和測交，最終將含有穗粗雜種優(yōu)勢位點的片段定位到某一區(qū)段。

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Preliminary Mapping of Heterotic Loci for Ear Width in Maize

WANGDandan1，2，LI Weihua3，SHI Xia3，LIUKun3，GUOHaiping3，YANPengshuai3，XIE Huiling3，BAI Qilin2
（1.College ofBioengineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute ofCrop Sciences，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；3.College ofAgronomy，Henan Agricultural University，State KeyLaboratoryofWheat and Maize Crops，Zhengzhou 450002，China）

In this study,a set of chromosome segment substitution lines（CSSLs）population,which had the heterotic loci,was constructed using the inbred line lx9801 as the receptor parent and the inbred line C7-2 as he donor parent.The endosperms of BC7F2segregation population was analyzed by homozygous molecular markers at both ends of the donor chromosome fragment（C7-2）. Recombinant,which had the heterotic loci,was screened out,the main purpose ofthis paper was tolocate the heterotic loci controllingthe ear width.Finally,the heterotic loci was located on 2.04 bin of chromosome 2 by identifying the ear width of test hybrid（CSSLs× Zheng58）and CK（lx9801×Zheng58）.

maize;ear width;heterotic loci

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.05.06

S513

：A

：1002-2481（2017）05-0699-04

2017-01-15

國家自然科學(xué)基金項目（31201216）；河南省科技攻關(guān)項目（152102110062）；山西省自然科學(xué)基金項目（2014011004-2）

王丹丹（1990-），女，山西柳林人，在讀碩士，研究方向：玉米遺傳育種。白琪林為通信作者。