張小輝，暢志堅，喬麟軼，郭慧娟，詹海仙，李欣，任永康，任文斌，張曉軍

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，山西太原030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運城044000）

99份小麥地方品種抗白粉病種質(zhì)發(fā)掘及其分子鑒定

張小輝1，暢志堅2，喬麟軼2，郭慧娟2，詹海仙2，李欣2，任永康2，任文斌3，張曉軍2

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，山西太原030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運城044000）

利用國內(nèi)白粉菌流行小種E09和E20分別對收集到的99份小麥農(nóng)家種及地方品種進行了苗期抗性鑒定，共篩選出10份兼抗2個小種的材料，其中對2個小種均達到高抗以上的材料有6份，分別為028079、石家莊8號、菏澤2號、復(fù)壯30、冀麥2號和白齊麥。利用抗白粉病基因Pm21，Pm52，PmLK906和PmLX66對99份材料進行了分子檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)壯30、菏澤2號分別含有Pm5E和Pm52，臺中23和成都禿頭含有PmLK906，其余材料均未檢測到上述抗白粉病基因，也未見有含抗白粉病基因的報道。這6份材料可以作為有效抗源應(yīng)用于小麥抗病育種中。

小麥；地方品種；抗白粉??；種質(zhì)資源；分子鑒定

由專化型寄生真菌小麥白粉菌（Blumeria graminis f.sp.tritici）侵染引起的小麥白粉病是我國小麥主產(chǎn)區(qū)的常見真菌病害之一，其中以黃淮麥區(qū)、北部冬麥區(qū)為害尤為嚴重，年發(fā)病面積高達600萬～800萬hm2[1]，是影響小麥產(chǎn)量增加、品質(zhì)改善的重大疾病。培育和種植抗病品種是防治小麥白粉病為害的有效措施[2]，但隨著矮稈、高密等高產(chǎn)品種的普及，單一品種的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，加速了白粉菌生理小種的變異，致使原有的抗病基因迅速喪失抗性[3]。因此，不斷發(fā)掘與利用抗白粉病品種，篩選和鑒定出更多的抗白粉病基因，拓寬小麥育種中抗白粉病基因來源，進一步推進小麥的抗病分子育種工作，做到抗白粉病基因的合理布局，是我國小麥抗病育種重要的研究內(nèi)容[4]。

本研究利用國內(nèi)白粉菌流行小種E09和毒性最強的小種E20對作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室收集的99份小麥農(nóng)家種及地方品種進行苗期接種鑒定，并利用E09對其進行成株期接種鑒定，評價其抗性表現(xiàn)；利用生產(chǎn)上起主要作用的抗白粉病基因連鎖標記對所選種質(zhì)資源進行分子標記檢測。根據(jù)抗病鑒定與分子標記檢測結(jié)果，發(fā)掘仍然有效的優(yōu)質(zhì)抗源及抗病新基因，旨在為小麥抗病育種提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試小麥材料為99份小麥農(nóng)家種及地方品種，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所張俊靈研究員提供，作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室保存。小麥白粉菌E09，E20小種由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所段瑕瑜、周益林研究員提供，以高感白粉病小麥品系SY95-71活體繁菌保存。感病對照及病菌誘發(fā)材料均為SY95-71，由成都電子科技大學(xué)楊足君教授惠贈。抗病對照品種分別為楊麥21、良星99、良星66和蘭考906，均為目前我國小麥主產(chǎn)區(qū)大面積推廣品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 白粉病抗性鑒定白粉病抗性鑒定采用苗期人工接菌鑒定法，在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所人工氣候培養(yǎng)室內(nèi)進行，分別接種白粉菌E09和E20小種。

將99份試驗材料與對照品種于2015年10月播種于72穴育苗盤內(nèi)，每份材料播種2穴，每穴5粒，共10粒。感病對照均勻種植在每盤的4個角以及中間穴內(nèi)。培養(yǎng)室溫度18℃，濕度70%，光照強度為10 000 lx，光照時間14 h/d。待鑒定材料生長至1葉1心，且第1葉片完全展開時，用噴霧器適當噴濕幼苗，采用掃抹法分別接種白粉菌小種E09和E20的新鮮孢子，第2天重復(fù)接種一次。接種10～15 d后，當感病對照SY95-71充分發(fā)病時，調(diào)查記載其苗期抗性。抗病反應(yīng)型根據(jù)葉片侵染嚴重度分為6個級別，分別為0（免疫）、0；（過敏性壞死）、1（高抗）、2（中抗）、3（中感）和4（高感），其中，0～2級為抗病型，3～4級為感病型[5]。

1.2.2 抗病基因的分子標記檢測供試材料采用SDS法[6]提取基因組DNA。用于鑒定與篩選抗病基因的分子標記分別采用目前我國生產(chǎn)上起主要作用的抗白粉病基因Pm21，Pm52，PmLK906和PmLX66的連鎖標記，所用引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（上海生工）合成，引物序列列于表1。

PCR擴增在PTC-200型熱循環(huán)儀（MJ Research，美國）上進行。PCR反應(yīng)體系（15 μL）為：1.5 μL 10×PCR buffer，0.15 mmol/L dNTP，0.75 U Taq酶，0.25 μmol/L引物和50 ng模板DNA。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，退火45s，每對引物的退火溫度參考表1，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，經(jīng)硝酸銀染色后觀察照相。

表1 用于抗白粉病基因檢測的分子標記

2 結(jié)果與分析

2.1 白粉病苗期抗性鑒定

利用國內(nèi)白粉菌流行小種E09和E20分別對99份小麥農(nóng)家種及地方品種進行苗期抗性鑒定，結(jié)果表明，只對E09小種表現(xiàn)為抗性（IT＝0～2級）的材料共有22份，占全部材料的22.22%。其中，表現(xiàn)為免疫（IT＝0）和近免疫（IT＝0；）的材料有8份，高抗的（IT＝1）有4份，中抗的（IT＝2）有10份，其余77份均中感或高感E09小種。只對E20小種表現(xiàn)為抗性的材料共有16份，占全部材料的16.16%。其中，表現(xiàn)為免疫和近免疫的材料有5份，高抗的有4份，中抗的有7份，其余83份均中感或高感E20小種。對E09和E20均表現(xiàn)為抗性的材料共有10份，占全部材料的10.1%。但同時對2個小種均表現(xiàn)為免疫或近免疫的材料僅有4份，分別為復(fù)壯30、石家莊8號、028079和菏澤2號。對E09和E20均表現(xiàn)為感病的材料共有71份，占全部材料的71.72%。感病對照品種SY95-71對2個小種均表現(xiàn)為高感（IT=4）?？共φ掌贩N除蘭考906分別表現(xiàn)為高抗和中抗以外，其余3個品種（楊麥21、良星99和良星66）均表現(xiàn)為免疫（表2）。

表299 份小麥種質(zhì)對E09，E20的抗性表現(xiàn)及標記檢測

續(xù)表2

2.2 抗病基因連鎖標記的分子鑒定

2.2.1 Pm21的分子標記檢測以楊麥21作為陽性對照，用劉志勇等[7]開發(fā)的SCAR標記SCAR1265對99份供試材料進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅在水源86上能夠擴增出相應(yīng)的1 265 bp的特異片段（圖1），在其他材料上均未能擴增出相應(yīng)的條帶。由此可見，除水源86外，其余98份材料中均不含有Pm21基因。而水源86對E09表現(xiàn)為中抗，對E20表現(xiàn)為高感，根據(jù)Pm21對白粉病的抗性表現(xiàn)，水源86含有Pm21的可能性也較小。

2.2.2 Pm52的分子標記檢測利用與Pm52[8]緊密連鎖的分子標記Xgwm120進行PCR擴增，以良星99作為陽性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在99份材料中，有8份材料可以擴增出和Pm52連鎖的特異性條帶（圖2），分別為豐產(chǎn)3號、濟南2號、魯麥19、菏澤2號、泰山1號、漢中白、深根和敦化春化，其中，菏澤2號對E09和E20都具有良好的抗性，泰山1號近免疫E09，對E20則表現(xiàn)為中抗，這2份材料中可能含有Pm52基因；其余6份材料對E09和E20則表現(xiàn)為中感或高感，都不含有該基因，表現(xiàn)為假陽性。

2.2.3 PmLK906的分子標記檢測以蘭考906為陽性對照，利用與PmLK906[9]緊密連鎖的分子標記Xgdm93和Xgwm265對99份材料進行了檢測，其中，利用Xgdm93可以在泰山1號、臺中23、成都禿頭、三月黃、平陽269、蜀萬8號、Atlas 66、江東門和咸農(nóng)39等9份材料中擴增出與PmLK906連鎖的特異性條帶，利用Xgwm265可以在冀麥2號、菏澤2號、蛐子麥、碧螞4號、臺中23、成都禿頭、藏冬4號、同家壩等8份材料中擴增出與PmLK906連鎖的特異性條帶（圖3）。Xgdm93和Xgwm265都能擴增出特異性條帶的材料為臺中23和成都禿頭，這2份材料對E09和E20都表現(xiàn)為高抗或中抗，表明這2份材料可能含有PmLK906基因，其余材料雖然也能表現(xiàn)一定的抗性，但其中含有PmLK906基因的可能性較小。

2.2.4 PmLX66的分子標記檢測以良星66為陽性對照，利用與PmLX66[10]連鎖的分子標記Xcfd81和SCAR203對99份材料進行PCR擴增，其中，利用Xcfd81可以在小偃麥6號、紅須麥、醬麥等3份材料中擴增出約300 bp的特異性條帶；利用SCAR203可以在白芒麥、上林小麥、老來瞎、藏冬4號、邊巴春麥-6、豬屎麥等6份材料中擴增中約203 bp的特異性條帶（圖4）。這9份材料中，除醬麥對E09表現(xiàn)為近免疫、對E20則高感，藏冬4號對E09高抗、對E20中感外，其余7份材料對2個小種均表現(xiàn)為中感或高感，且Xcfd81和SCAR203的特異性條帶并未在醬麥和藏冬4號中同時出現(xiàn)，表明這2份材料雖然對E09具有抗性，但其中含有PmLX66的可能性較小，其可能含有其他抗性基因，其余7份材料均不含有抗白粉病基因PmLX66。

3 結(jié)論與討論

3.1 地方品種在小麥品種改良中的作用

我國具有悠久的小麥種植歷史，在長期馴化栽培過程中，形成了多種多樣的小麥地方品種及農(nóng)家栽培品種[11]。據(jù)考證，我國擁有1.3萬多份在品質(zhì)、抗病等方面具有地方特色的小麥農(nóng)家種及地方品種資源，具有豐富的遺傳多樣性，同時也蘊含著大量的抗病基因源[12]，具有世界上許多國家不可比擬的資源優(yōu)勢。HUANG等[13]從我國農(nóng)家品種復(fù)壯30中發(fā)現(xiàn)了小麥抗白粉病基因Pm5E；XUE等[14]從地方品種齒牙糙中發(fā)現(xiàn)并定位了抗白粉病基因Pm24；MA等[15]利用我國小麥品種Yingbo 700鑒定出了PmYB，位于等位基因Pm2的染色體區(qū)域，具有廣譜抗性，對來自我國不同地區(qū)的48個白粉菌株均表現(xiàn)抗性。望水白對小麥赤霉病具有良好抗性，是當前抗性最好的赤霉病抗源之一[16]。盡管國際上已在64個等位基因位點正式命名了50個小麥抗白粉病基因（Pm1～Pm50）[17]，但由于白粉菌小種毒性增長快、變異頻率高，許多白粉病基因已在我國主要麥區(qū)逐漸減弱甚至喪失抗性[18]，失去其應(yīng)用價值。因此，充分發(fā)掘和利用小麥地方品種及農(nóng)家栽培品種中的有益基因資源對于現(xiàn)代小麥抗病育種及遺傳改良具有重要意義。

3.2 抗白粉病基因Pm21，Pm52，PmLK906和PmLX66的分子檢測

本試驗使用的4個抗白粉病基因載體品種對白粉菌小種E09和E20，除蘭考906對2個小種分別表現(xiàn)為高抗和中抗外，其余3個品種（楊麥21、良星99和良星66）均表現(xiàn)為免疫。供試的99份材料中，共篩選出10份兼抗2個小種的材料，其中對2個小種均達到高抗以上抗性的材料有6份，分別為28079、石家莊8號、菏澤2號、復(fù)壯30、冀麥2號和白齊麥，除復(fù)壯30中含有抗白粉病基因Pm5E外，其余材料中未見到含有抗白粉病基因，且未見有報道。Pm21分子標記均未在這10份材料中檢測到其特異性條帶，僅在水源86上擴增出相應(yīng)的1 265 bp的特異片段，而水源86對E09表現(xiàn)為中抗，對E20表現(xiàn)為高感。由于供試的99份材料均為經(jīng)過長期馴化栽培的地方品種[19]，而Pm21是齊莉莉等[20]于1995年利用遠緣雜交從簇毛麥中導(dǎo)入的抗白粉病基因，其雖具有較好的抗性，但作為抗病親本應(yīng)用于小麥育種時間尚短，因此，認為水源86中并不含有Pm21，其所擴增出的條帶應(yīng)為假陽性。

Pm52分子標記檢測結(jié)果顯示，在8份材料中可以擴增出和Pm52連鎖的特異性條帶，但只有菏澤2號和泰山1號對E09和E20表現(xiàn)出良好抗性，因此，推測這2份材料中可能含有Pm52基因，其余6份材料由于中感或高感白粉病，都不含有該基因。其原因可能是由于分子標記Xgwm120與Pm52連鎖距離較遠，單個標記檢測的準確性不高。與PmLK906連鎖的2個分子標記Xgdm93和Xgwm265都能在臺中23和成都禿頭2個材料中擴增出特異性條帶，而這2份材料對E09和E20都表現(xiàn)為高抗或中抗，與蘭考906的抗性結(jié)果基本一致，表明這2份材料都含有PmLK906基因。而與Pm－LX66連鎖的分子標記Xcfd81和SCAR203并未能在同一材料中同時擴增出特異性條帶，雖然醬麥和藏冬4號分別對E09和E20有較好的抗性，但其含有PmLX66的可能性較小。

綜上所述，本試驗所檢測的99份材料中，有6份對白粉菌小種E09和E20表現(xiàn)出良好抗性，分別為28079、石家莊8號、菏澤2號、復(fù)壯30、冀麥2號和白齊麥；泰山1號、蜀萬8號、大粒半芒、醬麥、臺中23、藏冬4號等6份材料僅對E09表現(xiàn)出較好抗性，蛐子麥、日喀則8號、碧螞4號等3份材料僅對E20表現(xiàn)出較好抗性。其中，復(fù)壯30含有Pm5E，菏澤2號含有Pm52，另外臺中23和成都禿頭含有PmLK906，其余材料則可能含有未公布的新抗病基因。由于28079、石家莊8號、菏澤2號、復(fù)壯30、冀麥2號和白齊麥具有良好抗性，而且它們都不含有其他不良性狀，故可作為優(yōu)良親本應(yīng)用于小麥抗病育種。

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Germplasms Discovering and Molecular Identification from 99 Wheat Landraces with Powdery Mildew Resistance

ZHANGXiaohui1，CHANGZhijian2，QIAOLinyi2，GUOHuijuan2，ZHANHaixian2，LI Xin2，RENYongkang2，RENWenbin3，ZHANGXiaojun2
（1.College ofBio-engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute ofCrop Sciences，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Shanxi Province KeyLaboratoryofCrop Genetics and Molecular Improvement，Taiyuan 030031，China；3.Institute ofCotton，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Yuncheng044000，China）

To discover more powdery mildew resistance germplasms and genes,seedling resistance identification for 99 wheat landraces were carried with Bgt races E09 and E20,respectively.Ten resistant varieties were found from them to both the two Bgt races. Among them,028079,Shijiazhuang 8,Heze 2,Fuzhuang 30,Jimai 2 and Baiqimai had a excellent resistance.Molecular identification was screened for the 99 wheat landraces with six linked molecular markers of four wheat powdery mildewresistance genes Pm21,Pm52, PmLK906 and PmLX66.Besides the Fuzhuang 30 contained Pm5E gene,we found that Heze 2 contained Pm52 gene,Taizhong 23 and Chengdututou contained PmLK906 gene.The other materials were not detected powdery mildewresistance genes,and reports containing these genes.Therefore,the sixwheat landraces can be used towheat powderymildewresistance breedingas effective resistance sources.

wheat;landrace;powderymildewresistance;germplasmresource;molecular identification

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.05.05

S512.1

：A

：1002-2481（2017）05-0692-07

2016-12-12

國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0102004-07）；山西省科技攻關(guān)項目（20150311001-1）；山西省自然科學(xué)基金項目（201601D102051，201601D011001）；山西省青年基金項目（2015021145）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重點項目（YGG1602）

張小輝（1991-），男，山西孝義人，在讀碩士，研究方向：小麥遺傳育種。張曉軍為通信作者。