樊凌志，季科研，蒲首丞，孫梅好

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

水稻脫落酸響應(yīng)基因分析

樊凌志，季科研，蒲首丞，孫梅好

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

脫落酸（ABA）參與調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，在植物抗擊外界環(huán)境壓力方面起到了重要的作用。為了篩選出水稻體內(nèi)的脫落酸響應(yīng)基因，試驗(yàn)設(shè)計(jì)了OsRD22，OsLTP4，OsLEA7的定量PCR引物，同時(shí)利用以終濃度為50 μmol/L的外源脫落酸處理的水稻葉片為材料，分析3種基因?qū)ν庠疵撀渌岬捻憫?yīng)情況。結(jié)果表明，隨著外源脫落酸處理時(shí)間的延長(zhǎng)，OsLTP4，OsLEA7等2種基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平并沒(méi)有隨之增長(zhǎng)；OsRD22基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平隨著時(shí)間的增加，呈現(xiàn)出表達(dá)量逐漸升高的趨勢(shì)。因此，基因OsRD22的表達(dá)水平可以作為測(cè)定水稻葉片內(nèi)脫落酸相對(duì)含量的指標(biāo)。

脫酸酸；水稻；相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平；RT-PCR

水稻是世界上最重要的主食作物之一，其提供和保證了熱帶、亞熱帶以及亞洲的近30億人每日的能量攝入。近幾年，水稻作為單子葉植物是研究先天免疫的關(guān)鍵模型[1]；而在植物激素方面，特別是激素在水稻防御機(jī)制中的作用方面研究卻很少。

ABA參與植物生長(zhǎng)發(fā)育許多方面的調(diào)節(jié)，包括種子發(fā)芽、胚胎成熟、葉衰老、氣孔孔徑和對(duì)外界環(huán)境脅迫的適應(yīng)。因此，ABA在植物防御反應(yīng)中起重要作用[2]。在不同類(lèi)型的植物—病原體相互作用中，ABA通常參與植物對(duì)各種生物營(yíng)養(yǎng)和壞死性病原體防御的負(fù)調(diào)節(jié)：ABA主要通過(guò)引發(fā)胼質(zhì)體的沉積誘導(dǎo)抗性[3]。HERNANDEZ-BLANCO等[4]提供了ABA信號(hào)直接參與控制擬南芥R.solanacearum抗性的證據(jù)：在影響次級(jí)細(xì)胞壁形成所需的纖維素合酶基因的擬南芥突變體中，對(duì)響應(yīng)ABA防御相關(guān)基因的誘導(dǎo)明顯增加。表明ABA可以通過(guò)調(diào)節(jié)擬南芥中的細(xì)胞壁代謝來(lái)發(fā)揮其對(duì)植物的防御作用。同時(shí)，在擬南芥中，ABA響應(yīng)基因包括RD22，LTP4，LEA7基因，相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平都受到外源脫落酸的調(diào)節(jié)，并且在外源處理擬南芥42 d后，LEA7的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平是野生型的60倍[5-7]。

本研究以日本晴為材料、擬南芥的內(nèi)源ABA響應(yīng)基因[8]為模板，比對(duì)水稻的同源基因，通過(guò)加入外源ABA處理水稻，探討水稻體內(nèi)3種基因（OsRD22，OsLTP4，OsLEA7）表達(dá)量，分析脫落酸與這3個(gè)基因表達(dá)的相關(guān)性，篩選水稻內(nèi)源ABA的響應(yīng)基因。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)以日本晴種子為材料。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件種子經(jīng)消毒劑（10%的次氯酸鈉）處理后，用無(wú)菌水漂洗4次，隨即放于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行萌發(fā)，3～4 d后取露白種子置于96孔板中，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行水培（28℃/26℃，14/10 h）。三葉期后，用已配制好的新鮮水培培養(yǎng)液（3.3 mmol/L硫酸鹽半培養(yǎng)液）培養(yǎng)7 d，轉(zhuǎn)用3.3 mmol/L全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.2.2 水稻脫落酸（ABA）響應(yīng)基因的對(duì)比和引物篩選以擬南芥中脫落酸響應(yīng)基因AtRD22，AtLTP4，AtLEA7的蛋白質(zhì)序列為模板，通過(guò)BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行比對(duì)，獲得水稻粳稻OsRD22，OsLTP4，OsLEA7的蛋白質(zhì)和DNA序列，利用primers 5軟件設(shè)計(jì)3種基因的相應(yīng)引物，經(jīng)RT-PCR溶解曲線峰檢測(cè)引物特異性，從而篩選出特異性引物（表1）。

表1 RT-PCR引物

1.2.3 水稻葉片總RNA提取和cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成

14 d幼苗經(jīng)外源脫落酸（50 μmol/L）處理不同時(shí)間后，剪取水稻葉片（0.2 g）放置于研缽中，加入液氮，研磨充分至粉末，利用Trizol法[9]提取水稻葉片的總RNA，測(cè)量濃度后，將RNA置于65℃的水浴鍋中變性5 min，按照表2中列出的試劑逐一加入，水浴37℃15 min，98℃5 min，反應(yīng)結(jié)束后存放于-20℃。

表2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（20 μL）

1.2.4 RT-PCR篩選響應(yīng)基因用設(shè)備ABI7500，采用20 μL反應(yīng)體系，按照表3逐一加入相應(yīng)的定量試劑（Toyobo）。擴(kuò)增條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，62℃退火30 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。以水稻基因作為內(nèi)參，并采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析。

表3 RT-PCR反應(yīng)體系（20 μL）

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)同源性比對(duì)

通過(guò)對(duì)擬南芥中ABA響應(yīng)基因蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，擬南芥ABA響應(yīng)基因RD22蛋白序列與水稻同源類(lèi)似物（XM_015772750.1，XM_015775371.1，XM_015763238.1）的氨基酸序列相似度分別為33%，57%和51%。

2.2 OsRD22轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

經(jīng)外源脫落酸（終濃度50 μmol/L）處理0，6，12，24 h后，利用定量PCR的方法分析水稻葉片中OsRD22的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著脫落酸處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其相對(duì)轉(zhuǎn)錄量逐漸增多（圖1），處理24 h后其相對(duì)轉(zhuǎn)錄量是對(duì)照的55.7倍。

2.3 OsLEA7轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

經(jīng)外源脫落酸（終濃度50 μmol/L）處理0，6，12，24 h后，利用定量PCR的方法分析水稻葉片中OsLEA7的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著脫落酸處理時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)的水平并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何規(guī)律性變化，0～12 h內(nèi)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸降低；但是在24 h時(shí)，表達(dá)量是0 h的12倍（圖2）。

2.4 OsLTP4轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

經(jīng)外源脫落酸（終濃度50 μmol/L）處理0，6，12，24 h后，利用定量PCR的方法分析水稻葉片中OsLTP4的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著脫落酸處理時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)的水平并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何規(guī)律，0～6 h內(nèi)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)表達(dá)量逐漸升高；6～24 h內(nèi)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)表達(dá)量先降低后又升高（圖3）。

3 討論

許多非生物脅迫伴隨著干燥和滲透壓的不平衡，最常見(jiàn)的一種對(duì)環(huán)境逆境的反應(yīng)是脫落酸（ABA）水平的短暫上升。ABA的合成會(huì)觸發(fā)多種防御措施，包括氣孔閉合和大量應(yīng)激反應(yīng)基因的激活，在感染后，植物會(huì)產(chǎn)生高度特異性的激素報(bào)警信號(hào)混合物，導(dǎo)致不同的攻擊者特異性免疫應(yīng)答的激活[10]。近年來(lái)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑被認(rèn)為在改善植物逆境受損方面具有一定作用，可提高作物的產(chǎn)量和質(zhì)量[11-12]。ABA參與植物生長(zhǎng)和發(fā)育許多方面的調(diào)節(jié)，包括種子發(fā)芽、胚胎成熟、葉衰老、氣孔孔徑和對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)。最近有研究表明[13]，ABA在植物防御反應(yīng)中起重要作用。

在擬南芥中，ABA響應(yīng)基因包括RD22，LTP4， LEA7基因，相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平都受到外源脫落酸的調(diào)節(jié)，并且在外源處理擬南芥42 d后，LEA7的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平是野生型的60倍，擬南芥的脫落酸響應(yīng)基因AtRD22，AtLTP4，AtLEA7蛋白序列與水稻中3種蛋白序列OsRD22，OsLTP4，OsLEA7相似度分別為33%，57%和51%。

為了分析水稻脫落酸的響應(yīng)基因，本研究選擇了OsRD22，OsLTP4，OsLEA7為目標(biāo)基因，分析了外源脫落酸對(duì)3種基因相對(duì)表達(dá)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)50 μmol/L外源脫落酸處理，可提高水稻葉片中OsRD22的表達(dá)，隨著外源脫落酸處理時(shí)間的增長(zhǎng)，OsLTP4，OsLEA7等2種基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平并沒(méi)有隨之增長(zhǎng)。利用定量PCR的方法分析水稻葉片中OsRD22的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著脫落酸處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其相對(duì)轉(zhuǎn)錄量逐漸增多，處理24 h后其相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的55.7倍；0～12 h內(nèi)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，OsLTEA7的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，但是在24 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量是0 h的12倍；隨著脫落酸處理時(shí)間的延長(zhǎng)，OsLTP4相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)的水平?jīng)]有發(fā)現(xiàn)任何規(guī)律。

OsRD22對(duì)脫落酸的相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的響應(yīng)，與擬南芥同源蛋白的表達(dá)調(diào)控一致。脫落酸在植物的生長(zhǎng)發(fā)育水平方面發(fā)揮著不可或缺的作用，參與調(diào)控植物抗生物及非生物脅迫的過(guò)程。本研究分析了外源脫落酸對(duì)3種基因（OsRD22，OsLTP4，OsLEA7）的響應(yīng)及敏感程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsRD22是脫落酸的正相關(guān)基因。因此，推測(cè)可以利用OsRD22的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平反映水稻內(nèi)源脫落酸的相對(duì)含量。

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Analysis of Abscisic Acid Response Gene in Rice

FANLingzhi，JI Keyan，PUShoucheng，SUNMeihao
（College ofChemistry＆Life Science，ZhejiangNormal University，Jinhua 321004，China）

Abscisic acid is the regulator in the plant growth and development,which plays vital roles in plant developments and dealing with biotic and abiotic stresses.To analyze rice marker genes for abscisic acid,three genes（OsRD22，OsLTP4，OsLEA7）were selected,and their relative transcription levels were studies by quantitative PCR（qPCR）using rice leaves treated with abscisic acid（50 μmol/L）.Results of qPCR demonstrated that transcription of OsLTP4 and OsLEA7 were not upregulated by abscisic acid.On the contrary,the transcription of OsRD22 was upregulated by abscisic acid.So as the result,we proposed that the relative transcription levels ofOsRD22 could be used toindicate relative levels ofactive abscisic acid in rice leaves.

abscisic acid;rice;relative transcription levels;RT-PCR

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.05.04

S511

：A

：1002-2481（2017）05-0689-04

2017-01-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31070055）；浙江省本科院校中青年學(xué)科帶頭人學(xué)術(shù)攀登項(xiàng)目（pd2013060）

樊凌志（1991-），女，山西晉中人，在讀碩士，研究方向：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能。孫梅好為通信作者。