尚麗平，李武峰

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

MBP-mCTCF融合蛋白原核表達載體的構(gòu)建及表達

尚麗平，李武峰

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

為了構(gòu)建鼠的CTCF與麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）融合蛋白的原核表達載體，并進行原核誘導(dǎo)表達及鑒定，以pMXs-3Flag-mCTCF為模板，PCR擴增得到mCTCF序列，目的基因片段EcoR I，Sal I雙酶切后連接到同樣雙酶切的pMal-C2G載體上，測序鑒定。將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達，用SDS-PAGE分離檢測蛋白表達效果。經(jīng)菌液PCR、測序鑒定、雙酶切鑒定證明，得到的重組質(zhì)粒pMal-C2G-mCTCF構(gòu)建成功，且成功誘導(dǎo)出了MBP-mCTCF融合蛋白，最佳誘導(dǎo)條件為：10×10-4mol/LIPTG濃度在37℃誘導(dǎo)6 h。

CTCF；質(zhì)粒構(gòu)建；原核誘導(dǎo)表達

CCCTC-結(jié)合因子（CTCF）是一種在生物體內(nèi)廣泛表達并在進化上高度保守的蛋白，鼠的CTCF全長736個氨基酸，包括N-末端（氨基端）、C-末端（羧基端）和鋅指結(jié)構(gòu)域（CTCF-ZFs）[1]。其中，CTCF-ZFs有312個氨基酸，形成11個連續(xù)的鋅指，小鼠和人的CTCF-ZFs 100%同源[1]。CTCF通過其11個鋅指與基因組DNA的相互作用而在細胞中發(fā)揮多種生物學(xué)功能，包括基因的轉(zhuǎn)錄激活或者抑制、基因印記、染色質(zhì)絕緣、X染色體失活、染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)調(diào)控等[2]。為了更為直接地研究CTCF蛋白與DNA的結(jié)合機制，體外通過原核誘導(dǎo)表達是常用的研究方法，選擇最適的誘導(dǎo)表達條件對于CTCF的誘導(dǎo)表達和進一步功能研究至關(guān)重要。

本研究構(gòu)建了鼠的MBP-mCTCF融合蛋白表達質(zhì)粒，并優(yōu)化了原核誘導(dǎo)表達的條件，旨在誘導(dǎo)得到MBP-mCTCF融合蛋白以及最佳的蛋白誘導(dǎo)表達條件。

1 材料和方法

1.1 材料

E.coli BL21購自天根生物公司、E.coli DH5α、pMal-C2G質(zhì)粒、pMXs-3Flag-mCTCF質(zhì)粒由中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院姚紅杰實驗室制備和保存；Fermentas快速內(nèi)切酶EcoR I[3]，Sal I購自Thermo公司；Solution 1購自Takara公司，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因擴增以pMXs-3Flag-mCTCF質(zhì)粒為模板，分別用進入EcoR I和Sal I酶切位點的mCTCF正反向引物擴增鼠的CTCF片段。primermCTCF-正向引物序列為：5′-CCGGAATTCCTCGA GATGGCCTTTGTGACCA-3′，primer-mCTCF-反向引物序列為：5′-ACGCGTCGACTCAGCCATCTGGGC CAGCACAATTATC-3′。PCR反應(yīng)體系為20μL：模板pMXs-3Flag-mCTCF（40ng/μL）1μL；正向引物（1×10-5mol/L）0.3 μL；反向引物（1×10-5mol/L）0.3 μL；KOD plus 0.5 μL；10×KOD Buffer 2 μL；MgSO40.4 μL；H2O15.5 μL。擴增程序為：98℃預(yù)變性2 min；98℃30 s，58℃30 s，68℃10 min，擴增30個循環(huán)；68℃延伸10 min[4-6]。擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 表達質(zhì)粒的構(gòu)建用EcoR I，Sal I雙酶切PCR產(chǎn)物，割膠回收后連接到同樣用EcoR I，Sal I，雙酶切的pMal-C2G空載體上[7-8]，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli DH5α中，挑取單克隆進行菌液PCR，選擇條帶正確的克隆測序鑒定，確保編碼蛋白的區(qū)域沒有突變或缺失。提取質(zhì)粒EcoR I，Sal I，雙酶切鑒定，構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli BL21中，用于后續(xù)蛋白誘導(dǎo)表達。

1.2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達及條件優(yōu)化原核誘導(dǎo)表達的方法參考文獻[9-10]進行：挑取單克隆置于5 mL加Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)過夜，菌種以1∶500接種到新鮮培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)到OD260/OD280為0.6～0.8時，加入適當濃度的IPTG和ZnSO4繼續(xù)培養(yǎng)6 h[11-12]。首先，使用3個傳統(tǒng)的誘導(dǎo)溫度（16，28，37℃）和3個IPTG濃度（1×10-4mol/L，5×10-4mol/L和10×10-4mol/L）初步確定誘導(dǎo)溫度；隨后細化IPTG的濃度（1×10-4，2×10-4，3×10-4，4×10-4，5×10-4，6×10-4，7×10-4，8×10-4，9×10-4，10×10-4，11×10-4，12×10-4mol/L），確定最佳誘導(dǎo)條件。

1.2.4 融合蛋白檢測用12%的SDS-PAGE分離蛋白后，用考馬斯亮藍染色，觀察蛋白表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段擴增

以pMXs-3Flag-mCTCF質(zhì)粒為模板PCR擴增的鼠的CTCF片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，得到的條帶與預(yù)期大小相符，mCTCF的長度為2 211 bp（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒鑒定

質(zhì)粒重組后，轉(zhuǎn)化、涂板培養(yǎng)過夜后，挑取克隆進行菌液PCR，結(jié)果如圖2所示。5，6，7，8，10號克隆在2 000 bp附近有一條帶，選擇這幾個克隆測序，測序正確后提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期相符（圖3）。

2.3 融合蛋白誘導(dǎo)表達

將含表達質(zhì)粒的E.coli BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，用SDS-PAGE分析誘導(dǎo)前后的蛋白表達情況，蛋白分子量小于170 kDa時，出現(xiàn)明顯的差異性誘導(dǎo)表達的融合蛋白條帶（圖4，5）。首先對誘導(dǎo)溫度和IPTG誘導(dǎo)濃度進行初步優(yōu)化，確定了最適的誘導(dǎo)溫度為37℃（圖4）。

隨后對IPTG濃度進行優(yōu)化，IPTG的濃度從1×10-4mol/L增加到12×10-4mol/L，SDS-PAGE分離后，考馬斯亮藍染色的結(jié)果顯示，最佳的IPTG濃度為10×10-4mol/L（圖5）。因此，最終確定融合蛋白MBP-mCTCF最適誘導(dǎo)表達條件為：10×10-4mol/L IPTG濃度在37℃誘導(dǎo)6 h。

3 討論與結(jié)論

CTCF作為一個多功能的轉(zhuǎn)錄因子，主要通過與基因組DNA的結(jié)合作用而行使功能。CTCF在基因組上的結(jié)合位點研究是從雞的c-Myc基因開始[13-14]，隨后的研究中又發(fā)現(xiàn)了一系列的CTCF結(jié)合序列，這些序列的長度從十幾個堿基到幾十個堿基不等[1]。隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，人們關(guān)于CTCF結(jié)合位點的認識更為清晰。KIM等[15]通過ChIP-seq，ChIP-ChIP等方法研究得出，過去由體外試驗得到的CTCF結(jié)合位點基本都含有同一段19～21個堿基的核心序列，這段核心序列被定義為M1（CTCF結(jié)合Motif1）。在M1和下游約5～6個堿基的位置發(fā)現(xiàn)了一個新的CTCF結(jié)合的序列，這段區(qū)域的核心序列為9～11個堿基，把這個核心序列定義為M2（CTCF結(jié)合Motif 2）[16-17]。CTCF與DNA的結(jié)合并非需要11個鋅指全部參與，而是通過幾個鋅指與DNA作用而發(fā)揮功能[9]。研究發(fā)現(xiàn)，包含M1的CTCF結(jié)合序列主要結(jié)合CTCF的4～8號鋅指，而包含M2的CTCF結(jié)合序列主要結(jié)合CTCF的7～ 11號鋅指[9，18-19]。

CTCF作為一個轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控基因表達中發(fā)揮重要功能，CTCF可以通過鋅指與DNA的結(jié)合調(diào)控許多癌基因的表達。也有報道發(fā)現(xiàn)，在許多癌細胞中，CTCF與其靶位點結(jié)合異常，包括白血病、宮頸癌和Wilms′腫瘤[20]。因此，推測CTCF結(jié)合異常，比如結(jié)合位點突變、鋅指氨基酸突變都可能與腫瘤等疾病的發(fā)生相關(guān)[21，22]。在本研究中，通過原核誘導(dǎo)表達得到了MBP-mCTCF融合蛋白，再進行純化，獲得足量的蛋白后，可進行PULL-DOWN，EMSA等試驗，進一步研究CTCF與DNA結(jié)合的機制。

總之，本研究成功構(gòu)建了鼠的CTCF的原核表達質(zhì)粒pMal-C2G-mCTCF，優(yōu)化了原核誘導(dǎo)表達的條件，并對原核誘導(dǎo)表達的目的蛋白進行了鑒定，為下一步CTCF蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］OHLSSON R，RENKAWITZ R，LOBANENKOV V.CTCF is a uniquely versatile transcription regulator linked to epigenetics and disease[J].Trends in Genetics，2001，17（9）：520.

［2］PHILLIPS J E，CORCES V G.CTCF：master weaver of the genome [J].Cell，2009，137（7）：1194-1211.

［3］余美華，張姝芳，倪曉敏，等.MCL-1原核表達載體構(gòu)建及重組蛋白表達[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（18）：7742-7744.

［4］王曉梅，張鐘文，楊楠.辣椒疫霉病無毒基因RXLR128001克隆與蛋白表達純化[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2016，47（1）：25-29.

［5］張微，孫紅，裴丹，等.小麥自噬相關(guān)基因ATG4和ATG8的原核表達及蛋白純化[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，20（5）：19-22.

［6］朱莉，劉剛，ZHULI，等.小鼠生精相關(guān)基因pQE/Dnajb13重組載體的構(gòu)建和蛋白表達[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013（12）：1757-1760.

［7］胡喬木，王凱琳，陳松林.半滑舌鰨Dmrt1蛋白表達、純化及功能[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2013（6）：1132-1138.

［8］秦艷紅，喬奇，張德勝，等.甘薯褪綠矮化病毒外殼蛋白基因的克隆及在大腸桿菌中的表達[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42（6）：85-87.

［9］RENDA M，BAGLIVO I，BURGESSBEUSSE B，et al.Critical DNA bindinginteractions ofthe insulator protein CTCF：a small number of zinc fingers mediate strong binding,and a single finger-DNA interaction controls binding at imprinted loci[J].Journal of Biological Chemistry，2007，282（46）：33336-33345.

［10］YAO H，BRICK K，EVRARD Y，et al.Mediation of CTCF transcriptional insulation by DEAD-box RNA-binding protein p68 and steroid receptor RNAactivator SRA[J].Genes&Development，2010，24（22）：2543-2555.

［11］肖瑩，劉君，劉曉穎，等.栽培小麥Brock中轉(zhuǎn)錄因子基因WRKY的克隆與表達分析[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，21（2）：1-4.

［12］劉永暉，張改平，喬松林，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒nsp7蛋白的表達與純化[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（5）：141-144.

［13］LOBANENKOV V V，NICOLAS R H，ADLER V V，et al.A novel sequence-specific DNA binding protein which interacts with three regularly spaced direct repeats of the CCCTC-motif in the 5′-flanking sequence of the chicken c-myc gene[J].Oncogene，1990，5（12）：1743-1753.

［14］KLENOVA E M，NICOLAS R H，PATERSON H F，et al.CTCF，a conserved nuclear factor required for optimal transcriptional activityof the chicken c-myc gene,is an 11-Zn-finger protein differentiallyexpressed in multiple forms[J].Molecular&Cellular Biology，1993，13（12）：7612-7624.

［15］KIM T H，ABDULLAEV Z K，SMITH A D，et al.Analysis of the vertebrate insulator protein CTCF binding sites in the human genome[J].Cell，2007，128（6）：1231-1245.

［16］NAKAHASHI H，KWON K R，RESCH W，et al.A genome-wide

map of CTCF multivalency redefines the CTCF code[J].Cell Reports，2013，3（5）：1678-1689.

［17］SCHMIDT D，SCHWALIE P C，WILSON M D，et al.Waves of retrotransposon expansion remodel genome organization and CTCF bindingin multiple mammalian lineages[J].Cell，2012，148（1/2）：335-348.

［18］XIAO T，WONGTRAKOONGATE P，TRAINOR C，et al.CTCF recruits centromeric protein CENP-E to the pericentromeric/centromeric regions of chromosomes through unusual CTCF-binding sites[J].Cell Reports，2011，12（10）：1704.

［19］GHIRLANDO R，F(xiàn)ELSENFELD G.CTCF:making the right connections[J].Genes&Development，2016，30（8）：881.

［20］劉芳，張沖，王寅彪，等.豬偽狂犬病毒gD蛋白抗原表位的克隆及表達[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，45（4）：122-125.

［21］NETWORK C G A，KANDOTH C，SCHULTZ N,et al.Integrated genomic characterization of endometrial carcinoma[J].Nature，2013，497：67.

［22］FIORENTINO F P，GIORDANO A.The tumor suppressor role of CTCF[J].Journal ofcellular physiology，2012，227（2）：479-492.

Construction of Prokaryotic Expression Vector and Expression of MBP-mCTCF Fusion Protein

SHANGLiping，LI Wufeng
（College ofLife Science，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

To construct the prokaryotic expression vector of pMal-C2G-mCTCF and induce the expression of fusion protein,DNA fragments encoding the mouse CTCF were generated by PCR using the plasmid pMXs-3Flag-mCTCF as a template,PCR products were digested with the restriction enzyme EcoR I and Sal I and cloned into pMal-C2G expression vector.The plasmids were sequenced to confirm that there were no point mutations in the coding sequences.The constructed plasmids were transformed into E.coli BL21 to induce the expression ofMBP-mCTCF fusion protein.The fusion protein was analyzed by SDS-PAGE and Coomassie blue staining.The prokaryotic expression plasmids pMal-C2G-mCTCF were successfullyconstructed,which were testified bybacterial PCR,gene sequence and double restriction enzyme digestion analysis.We alsogot the suitable conditions for inducingfusion protein expression.The optimized induction condition was 37℃with 10×10-4mol/LIPTGfor 6 hours toinduce higher amount ofMBP-mCTCF fusion protein.

CTCF;construction ofvectors;prokaryotic expression

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.05.01

Q51

：A

：1002-2481（2017）05-0677-04

2017-03-06

尚麗平（1990-），女，山西神池人，在讀碩士，研究方向：動物遺傳育種。李武峰為通信作者。