王方圓，趙德華，亓磊

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基因組工程在醫(yī)學(xué)合成生物學(xué)中的應(yīng)用

王方圓1，趙德華2，亓磊2

1 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕科中美合成生物學(xué)中心，上海 200127 2 斯坦福大學(xué)生物工程系，CA 94305，美國(guó)

王方圓, 趙德華, 亓磊. 基因組工程在醫(yī)學(xué)合成生物學(xué)中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(3): 422–435.Wang FY, Zhao DH, Qi LS. Application of genome engineering in medical synthetic biology. Chin J Biotech, 2017, 33(3): 422–435.

合成生物學(xué)旨在建立一套完整的工程理論和方法，通過設(shè)計(jì)和組裝基本生物學(xué)元件，更為有效地實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，并使其完成可編程的生物學(xué)功能。近年來隨著可編程基因組元件的出現(xiàn)，特別是CRISPR和CRISPRi技術(shù)平臺(tái)的建立和完善，使得合成生物學(xué)進(jìn)入了一個(gè)全新發(fā)展的時(shí)期。本文重點(diǎn)綜述CRISPR等基因組編輯和調(diào)控技術(shù)，其在構(gòu)建可編程生物學(xué)元件和復(fù)雜基因線路的應(yīng)用以及合成生物學(xué)在醫(yī)學(xué)中 (稱為醫(yī)學(xué)合成生物學(xué)) 的發(fā)展前景。

合成生物學(xué)，基因線路，CRISPR，CRISPRi，TALEN，ZFN，基因組編程，細(xì)胞設(shè)計(jì)工廠

1 合成生物學(xué)

合成生物學(xué)是21世紀(jì)初新興的交叉學(xué)科，涉及到生物學(xué)、工程學(xué)及計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科的綜合。合成生物學(xué)旨在通過人工設(shè)計(jì)和構(gòu)建自然界中不存在的生物元件和系統(tǒng)，或重新工程化改造和優(yōu)化現(xiàn)有的生物元件和系統(tǒng)，或利用系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算模擬以及定量分析等方法來制造復(fù)雜的生物系統(tǒng)。雖然是一個(gè)新興學(xué)科，但合成生物學(xué)在多個(gè)領(lǐng)域已展現(xiàn)了重要的應(yīng)用，比如通過酵母生產(chǎn)生物能源[1-2]和制造多功能材料[3]、利用微生物凈化水源和土壤來保護(hù)環(huán)境[4-5]、或是生產(chǎn)可殺死癌細(xì)胞的免疫細(xì)胞來治療疾病[6]。發(fā)展合成生物學(xué)對(duì)于發(fā)展其他學(xué)科有重要意義。合成生物學(xué)不僅依賴于多學(xué)科的交叉和發(fā)展，同時(shí)又促進(jìn)多學(xué)科、多產(chǎn)業(yè) (如醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、環(huán)境和能源等) 的發(fā)展，因此正在成為生物工程學(xué)的核心學(xué)科，也是會(huì)帶來革命性突破的戰(zhàn)略性學(xué)科之一[7-8]?；谄鋸V泛的應(yīng)用，發(fā)展合成生物學(xué)具有重大的科學(xué)意義、經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)意義。

合成生物學(xué)的核心思想是將復(fù)雜的生物系統(tǒng)變得可編程。很多合成生物學(xué)家受到計(jì)算機(jī)科學(xué)的啟發(fā)，將一個(gè)復(fù)雜的生命系統(tǒng) (如細(xì)胞或人體) 類比于一臺(tái)計(jì)算機(jī)。那么區(qū)別在哪里？計(jì)算機(jī)中運(yùn)行的是數(shù)字化的信息程序，是人們通過編程可以控制計(jì)算機(jī)的代碼。而生命系統(tǒng)中流動(dòng)的是生命的信息，是通過上億年進(jìn)化產(chǎn)生的關(guān)于自身復(fù)制、產(chǎn)生功能和凋亡的程序。理解這種復(fù)雜的生命程序背后的意義是生物學(xué)的研究目標(biāo)，而編程、調(diào)控這一復(fù)雜生命程序則是合成生物學(xué)的研究目標(biāo)。

近年來，合成生物學(xué)研究主要包括以下內(nèi)容：大規(guī)?；蛟臉?gòu)建和定量測(cè)量、理解基因線路和系統(tǒng)的設(shè)計(jì)原理、大規(guī)模DNA合成技術(shù)的開發(fā)、基因組編輯和調(diào)控平臺(tái)的建立。

合成生物學(xué)的核心概念之一是基因線路 (Genetic circuit) 的構(gòu)造。基因線路是由基因元件構(gòu)成的，而基因元件包括編碼蛋白的基因 (如編碼酶的基因)、調(diào)控基因表達(dá)的元件 (如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、調(diào)控蛋白和RNA等) 以及可以感應(yīng)外在信號(hào)的分子 (如可以結(jié)合小分子的蛋白和RNA)?；蛘{(diào)控元件包括轉(zhuǎn)錄水平元件 (如啟動(dòng)子、終止子等調(diào)控序列) 和轉(zhuǎn)錄后水平元件 (如mRNA序列或非編碼RNA序列)[9]。而基因線路則是通過將不同的基因元件按一定邏輯規(guī)律連接在一起構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)，比如上游的基因蛋白產(chǎn)物可以調(diào)控下游的基因表達(dá)，如此環(huán)環(huán)相扣實(shí)現(xiàn)特定的生物學(xué)功能。通過在活體細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的、有功能的基因線路一直是合成生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，這不僅需要基礎(chǔ)研究來理解構(gòu)造復(fù)雜線路的基本原理，更重要的是會(huì)帶來多方面的實(shí)際應(yīng)用，如解決醫(yī)學(xué)、環(huán)境和能源行業(yè)等面臨的問題[10-11]。

一條典型的基因線路通常包含三部分：感應(yīng)器 (檢測(cè)接收的輸入信號(hào))、處理器 (針對(duì)輸入信號(hào)做出計(jì)算) 和執(zhí)行器 (行使細(xì)胞功能)。這些器件聯(lián)結(jié)、搭配起來，可執(zhí)行各種特定的生物學(xué)功能，如邏輯門[12-16]、基因表達(dá)開關(guān)[17-18]、記憶設(shè)備[19]和細(xì)胞內(nèi)通訊[20-21]。這些“合成型”調(diào)控元件必須是有效的 (能夠調(diào)控靶基因的表達(dá)水平到期望值)、程序性的 (能夠被調(diào)控至期望的靶點(diǎn)發(fā)揮作用)，并且可有效避免與細(xì)胞中原有的基因交互干擾反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的編程。目前，針對(duì)基因組的可編程、合成型調(diào)控元件主要包括鋅指蛋白 (Zinc finger protein，ZFP)、類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子 (Transcription activator-like effector，TALE) 和CRISPR干擾 (CRISPR interference，CRISPRi)。

2 基因組工程

基因組工程是指對(duì)細(xì)胞的基因組進(jìn)行工程性操作，包含對(duì)基因組DNA的修改、重組和編輯，從而實(shí)現(xiàn)新的、有用的生物體性狀，如細(xì)菌品種改良、提高農(nóng)作物產(chǎn)量、或是生產(chǎn)用于治療的干細(xì)胞。隨著人類基因組測(cè)序的普及，讀取基因組的信息已經(jīng)不是基因組研究的瓶頸。如何有效改寫和調(diào)控基因組的信息在近幾年隨之成為一個(gè)焦點(diǎn)。正是在這種背景下，基因組編輯技術(shù)獲得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。

至今，已有多種高效的DNA靶向內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)，如鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)[22]、類轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)[23-24]和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regulatory interspaced short palindromic Repeats，CRISPR)相關(guān)蛋白[25-26]。這些靶向內(nèi)切酶都可以結(jié)合到DNA的特定位點(diǎn)并進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂(Double-strand break，DSB)。為了修復(fù)雙鏈斷裂，細(xì)胞隨即利用自身的修復(fù)機(jī)制 (DNA repair pathway) 在該位點(diǎn)產(chǎn)生同源重組(Homology-directed recombination，HDR) 或非同源末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ)，從而實(shí)現(xiàn)靶基因編輯。如今，ZFN、TALEN和CRISPR技術(shù)已成為基因組工程學(xué)的基本工具，而它們?cè)诤铣缮飳W(xué)中的應(yīng)用也正在為合成生物學(xué)帶來新的突破。

3 CRISPR技術(shù)

3.1 CRISPR/Cas

自2013年CRISPR/Cas9技術(shù)成功用于人細(xì)胞中基因組編輯，由于其較高的編輯效率、便捷的操作方式和較低的脫靶率，CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)成為一項(xiàng)新型的基因組編輯的主流方法。其研究和應(yīng)用最近幾年也取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。

CRISPR起初是源于細(xì)菌中的發(fā)現(xiàn)，指的是細(xì)菌體內(nèi)通過序列特異性互補(bǔ)配對(duì)，以抵御噬菌體外源DNA侵染的分子機(jī)制[27]。該機(jī)制的獨(dú)特之處在于，不同于其他僅僅依靠蛋白質(zhì)分子和DNA特異性結(jié)合的識(shí)別機(jī)制 (如ZFN和TALEN)，CRISPR是通過RNA (核糖核酸) 和DNA (脫氧核糖核酸) 的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則 (即A/T或A/U互補(bǔ)，G/C互補(bǔ)) 來識(shí)別特定的DNA序列并且切割該序列。目前已被發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)有3種，分別為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型[28-29]。其中Ⅱ型系統(tǒng)CRISPR/Cas9組分最為簡(jiǎn)單，只需要一個(gè)Cas9蛋白(CRISPR-associated protein 9) 就可以實(shí)現(xiàn)DNA識(shí)別和剪切[30]。Cas9蛋白與工程化的向?qū)NA (Single guide RNA，sgRNA，向?qū)NA) 結(jié)合，在sgRNA指引下Cas9/sgRNA能夠識(shí)別與向?qū)NA中的指引序列互補(bǔ)配對(duì)的靶DNA序列，并進(jìn)行切割，形成DNA雙鏈斷裂(Double-strand breaks，DSB)，隨后DNA通過NHEJ或HDR方式進(jìn)行修復(fù)，造成基因敲除或編輯(Gene editing)[25](圖1A)。

CRISPR作為一項(xiàng)新興技術(shù)，近年來大幅度擴(kuò)展了合成生物學(xué)的基因元件庫。CRISPR/Cas9與其他元件 (RNA、蛋白質(zhì)等) 結(jié)合到一起，成為“超級(jí)合成生物學(xué)元件”。比如，CRISPR與sgRNA結(jié)合可作為感應(yīng)器感知信號(hào)，可作為處理器傳遞信號(hào)，也可作為執(zhí)行器行使功能。

3.2 CRISPR/Cas9優(yōu)勢(shì)

CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于其特異性、有效性和便利性。一方面，堿基互補(bǔ)配對(duì)原則使得CRISPR/Cas9幾乎可以識(shí)別任何DNA序列，實(shí)現(xiàn)了整個(gè)基因組范圍內(nèi)的識(shí)別，同時(shí)大大簡(jiǎn)化了sgRNA的設(shè)計(jì)、克隆和功能測(cè)試。另一方面，CRISPR/Cas9在不同物種中都展現(xiàn)了功能。已發(fā)表的研究工作顯示CRISPR系統(tǒng)可以高效且特異地識(shí)別多種物種的基因組，包括細(xì)菌[31]、酵母[32]、果蠅[33]、線蟲[34]、斑馬魚[35]、水稻[36]、小鼠[37-38]、大鼠[39]、豬[40]以及人的細(xì)胞[41]，另外CRISPR/Cas9技術(shù)也在HeLa和K562[42]等多種癌細(xì)胞、小鼠胚胎干細(xì)胞、人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人成纖維細(xì)胞和人誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞 (Induced pluripotent stem cells，iPS) 以及iPS細(xì)胞分化的神經(jīng)干細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因敲除、基因敲入和基因突變等編輯[43]。

圖1 CRISPR工具箱。(A) Cas9核酸酶和序列特異的向?qū)NA (sgRNA) 可以特異識(shí)別基因組的序列并切割基因組。這允許人們對(duì)基因組的特異序列進(jìn)行編輯 (Gene editing)。(B) 核酸酶失活的Cas9 (dCas9)和序列特異的sgRNA可以特異結(jié)合基因組的序列并產(chǎn)生基因調(diào)控功能。在原核生物中，dCas9和sgRNA直接結(jié)合到基因組可以直接阻斷基因轉(zhuǎn)錄；在真核生物中，dCas9和KRAB蛋白域的融合蛋白可以更有效地抑制下游基因的表達(dá)。(C) dCas9融合蛋白和序列特異的sgRNA可以特異地結(jié)合基因組的序列并激活基因表達(dá)。第一代激活技術(shù)基于dCas9和VP64的直接融合，但是效率欠佳；第二代激活技術(shù)，包括Suntag、VPR、SAM等系統(tǒng)可以大大提高基因激活的效率。(D) dCas9和表觀遺傳學(xué)因子的融合蛋白可以允許人們對(duì)基因組進(jìn)行表觀遺傳學(xué)修飾編輯。

CRISPR/Cas9技術(shù)的另一大優(yōu)勢(shì)是，除了基因編輯，還能夠在原技術(shù)基礎(chǔ)上，對(duì)Cas9蛋白進(jìn)行改造，實(shí)現(xiàn)序列特異的、精準(zhǔn)的基因表達(dá)調(diào)控。我們?cè)谶^去的工作中首次發(fā)明了核酸酶失活的Cas9 (Deactivated Cas9或dCas9) (圖1B)，使Cas9蛋白失去剪切DNA序列的功能，但仍具有sgRNA導(dǎo)向的序列特異結(jié)合功能。這種技術(shù)稱為CRISPR干擾 (CRISPR interference，CRISPRi)，是指通過dCas9 “占位”阻擋了RNA聚合酶結(jié)合到啟動(dòng)子，或者RNA聚合酶的“前進(jìn)”，或者RNA聚合酶與其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合等，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種物種基因表達(dá)抑制的調(diào)控[44]。關(guān)于dCas9的基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)在下面會(huì)詳細(xì)討論。

4 CRISPR技術(shù)在合成生物學(xué)中的應(yīng)用

4.1 基于CRISPR/Cas9的調(diào)控工具

通過將dCas9與多種不同調(diào)控因子融合，目前我們已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了基因組范圍內(nèi)的定向抑制基因表達(dá)，激活基因表達(dá)，在同一細(xì)胞內(nèi)的雙向調(diào)控和較大DNA區(qū)域上表觀遺傳學(xué)修飾的改變 (表1)。將dCas9與轉(zhuǎn)錄抑制因子 (KRAB) (圖1B) 融合，可以沉默內(nèi)源基因如干性基因OCT4、NANOG、SOX2等的表達(dá)，且可被抑制到精準(zhǔn)的表達(dá)量[44]；將dCas9與轉(zhuǎn)錄激活因子 (VP16、p65等) (圖1C) 融合，可以激活內(nèi)源基因表達(dá)[45]。使用基于dCas9抑制元件和激活元件，可精準(zhǔn)確定基因被抑制或激活的水平，以揭示影響生物功能的基因活性變化的程度。另外，將dCas9與人乙酰轉(zhuǎn)移酶p300核心結(jié)構(gòu)域融合 (圖1D)，使靶基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的組蛋白H3第27位賴氨酸均被乙?；?(H3K27ac)，可實(shí)現(xiàn)靶基因的表觀遺傳學(xué)修飾[46]?；赿Cas9基因工程表達(dá)調(diào)控元件還可以方便地進(jìn)行多位點(diǎn)的調(diào)控。因?yàn)橹恍枰磉_(dá)多個(gè)不同的gRNA，同一個(gè)dCas9即可靶向不同基因。最近一項(xiàng)研究顯示，向細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染10個(gè)gRNA，可同時(shí)激活這10個(gè)gRNA靶向的基因，盡管激活效率比這10個(gè)基因分別被單個(gè)gRNA激活低[47]。

除將dCas9以融合蛋白的方法改造成調(diào)控因子，改造sgRNA成為效應(yīng)因子招募序列，為調(diào)控基因提供了更多的工具。在sgRNA 3′-末端增加效應(yīng)因子招募序列，形成CRISPR RNA支架 (Scaffold RNA，scRNA) (圖1C，如SAM系統(tǒng))。scRNA不僅具有普通gRNA的靶向DNA結(jié)合序列能力，還可以通過招募序列 (稱為aptamer) 與其他蛋白質(zhì)相互作用，使效應(yīng)因子 (轉(zhuǎn)錄激活子或抑制子) 結(jié)合到sgRNA。因此，一個(gè)scRNA招募一種轉(zhuǎn)錄因子如VP64到一個(gè)基因來調(diào)控該基因，而另一個(gè)scRNA可同時(shí)招募同種類型轉(zhuǎn)錄因子到另一個(gè)基因，也可招募不同類型轉(zhuǎn)錄因子如KRAB轉(zhuǎn)錄抑制子到另一個(gè)基因 (dCas9不變)，于是使得同時(shí)上調(diào)多個(gè)基因、或同時(shí)下調(diào)多個(gè)基因、或在上調(diào)某一 (些) 基因的同時(shí)下調(diào)另一 (些) 基因 (雙向調(diào)控)，得以實(shí)現(xiàn)[48]。值得一提的是，CRISPR也可與其他合成型調(diào)控工具 (如RNAi、miRNA、shRNA等) 整合到一起，組成一個(gè)工具箱，從而發(fā)揮復(fù)雜的程序性調(diào)控作用[49]。

最近另一項(xiàng)對(duì)sgRNA進(jìn)行改造的研究發(fā)現(xiàn)，縮短sgRNA中向?qū)蛄械拈L(zhǎng)度到16個(gè)核苷酸，盡管Cas9的核酸酶活性大大降低，但它仍然可以與DNA相互作用識(shí)別靶DNA；非常有趣的是，進(jìn)一步將Cas9與轉(zhuǎn)錄激活因子VPR融合，Cas9-VPR與縮短的sgRNA結(jié)合，卻不僅與Cas9具有相同的核酸酶活性，而且能夠同時(shí)激活下游報(bào)告基因的表達(dá)。這使得CRISPR/Cas9-VPR成為能同時(shí)發(fā)揮基因編輯和轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的多能工具，使同時(shí)調(diào)控DNA和RNA成為現(xiàn)實(shí)[50]。

表1 基于Cas9的基因編輯和基于dCas9的基因調(diào)控

但是，在CRISPR/Cas9應(yīng)用于人的細(xì)胞時(shí)，由于RNA聚合酶Ⅱ表達(dá)的RNA會(huì)被運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)，而sgRNA需要在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合到基因組DNA，因此sgRNA只能由RNA聚合酶Ⅲ表達(dá)。然而RNA聚合酶Ⅲ只占RNA聚合酶中的一小部分，且很多組織及誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)只能利用RNA聚合酶Ⅱ，這大大限制了CRISPR/Cas技術(shù)在基因調(diào)控和基因組工程上的應(yīng)用。研究表明，應(yīng)用RNA三螺旋 (RNA-Triple-Helix) 結(jié)構(gòu)和結(jié)合并切割RNA的Csy4組合成的復(fù)合體 (Triplex/Csy4)，可實(shí)現(xiàn)通過RNA聚合酶Ⅱ表達(dá)gRNA[49]，大大增加了CRISPR人工轉(zhuǎn)錄因子和CRISPR基因線路 (CRISPR/Cas-based circuits) 的應(yīng)用范圍，提高了調(diào)控效率。

在現(xiàn)有的CRISPR/Cas9技術(shù)中，基于化膿性鏈球菌sp.的Cas9的基因編輯和調(diào)控工具應(yīng)用得最為廣泛。但是在一種細(xì)胞中，基于同一種Cas9的多基因調(diào)控并不是平行的和獨(dú)立的正交控制系統(tǒng)。利用來源于不同種細(xì)菌的Cas9蛋白和與其共軛的sgRNA，可以實(shí)現(xiàn)基于CRIPSR/Cas9的正交調(diào)控。使用一整套Cas9同源體 (Cas9 orthologs)，它們分別來源于化膿性鏈球菌、嗜熱鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌和齒垢密螺旋體，不僅可以在細(xì)胞中 (細(xì)菌或人) 同時(shí)地、獨(dú)立地、互不干擾地介導(dǎo)基因編輯和基因調(diào)控，而且可以同時(shí)調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制[51]。

利用CRISPR人工轉(zhuǎn)錄因子 (CRISPR/Cas transcription factors，CRISPR-TF) 和設(shè)計(jì)sgRNA得到新的調(diào)控元件，可以輕松實(shí)現(xiàn)同時(shí)調(diào)控多個(gè)基因和復(fù)雜的基因線路。與基于CRIPSR/Cas9的正交調(diào)控結(jié)合，為構(gòu)建大規(guī)模合成型基因線路，對(duì)天然調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重新組合以及模擬天然狀態(tài)下的基因網(wǎng)絡(luò)提供了特別豐富的工具。

4.2 基于CRISPR/Cas9的基因線路

合成生物學(xué)中，構(gòu)建復(fù)雜基因調(diào)控線路的一個(gè)重要原則是：上游元件的輸出信號(hào)可以作為下游元件的輸入信號(hào)。例如，經(jīng)改造后，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中上游sgRNA與dCas9的復(fù)合物可調(diào)控下游sgRNA的表達(dá)，而下游sgRNA隨即調(diào)控?zé)晒獾鞍椎谋磉_(dá)[49]，如此環(huán)環(huán)相扣。

CRISPR/Cas9已經(jīng)被用來構(gòu)建多種應(yīng)用型的基因線路。最近一項(xiàng)研究表明，CRISPR/Cas9可用于構(gòu)造新型“分子信號(hào)傳導(dǎo)器” (CRISPR- Cas9-based ‘signal conductor’)，有效感知、處理和操控生物信號(hào)，指導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信息傳遞，調(diào)控內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄[52]。該研究使用帶適配器 (感知信號(hào)) 的加長(zhǎng)型sgRNA，以及可識(shí)別信號(hào)的核糖開關(guān) (Riboswitch)，這兩個(gè)看似毫不相關(guān)的分子結(jié)合到一起，也組成一個(gè)RNA支架 (圖2A)。當(dāng)環(huán)境中不存在特異性信號(hào)時(shí)，sgRNA與其反義鏈結(jié)合，不能結(jié)合到DNA靶點(diǎn)；當(dāng)出現(xiàn)特異性信號(hào)A (或B) 時(shí)，A結(jié)合到sgRNA的適配器上，造成RNA支架構(gòu)象發(fā)生變化，sgRNA隨即與DNA靶點(diǎn)結(jié)合，影響信號(hào)B (或A) 的轉(zhuǎn)錄。該裝置不僅可用于構(gòu)建所有類型的布爾邏輯門 (Boolean logic gates) 等，也可通過構(gòu)建一些偶聯(lián)不同信號(hào)通路的合成型結(jié)點(diǎn)，用于重新排列、組織細(xì)胞信號(hào)通路；最重要的是，該裝置通過調(diào)控雙向 (ON-OFF) 基因轉(zhuǎn)錄，能夠重新組織癌基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，使癌細(xì)胞發(fā)生重編程甚至逆轉(zhuǎn)。

CRISPR邏輯與門 (AND gate) 的構(gòu)建可用于篩選膀胱癌細(xì)胞，用于臨床治療[53]。此基因線路由腫瘤細(xì)胞特異的啟動(dòng)子 () 驅(qū)動(dòng)、靶向基因的sgRNA (sgRNA-) 和膀胱細(xì)胞特異的啟動(dòng)子 () 驅(qū)動(dòng)的dCas9組成，當(dāng)sgRNA和dCas9都表達(dá)時(shí)，基因 (編碼轉(zhuǎn)錄抑制因子lacⅠ) 被阻遏，lacⅠ介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制過程被緩解，其下游信號(hào)通路表達(dá)，即有信號(hào)輸出 (圖2B)。因此，只有在那些和都表達(dá)的細(xì)胞，即膀胱癌細(xì)胞中，才有下游信號(hào)輸出。下游信號(hào)可連接與治療相關(guān)的基因，如(編碼前凋亡因子)、(編碼抗增殖因子) 和(編碼細(xì)胞遷移抑制因子)，即可發(fā)揮治療作用。

CRISPR轉(zhuǎn)錄邏輯門 (Transcriptional logic gates) 可調(diào)控大腸桿菌的基因表達(dá)[54]。小分子輸入信號(hào)誘導(dǎo)啟動(dòng)子表達(dá)sgRNA，sgRNA招募dCas9到合成型啟動(dòng)子，阻止RNA聚合酶 (RNAP) 結(jié)合到該合成型啟動(dòng)子，阻止了輸出基因信號(hào)的表達(dá)。因此，只有缺失輸入信號(hào)時(shí)，才有輸出基因信號(hào)的表達(dá)和相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，此即“非門” (NOT gate)。重要的是，“非門”和“或門”可以層層排列，搭建“也非門”及“與門”，擴(kuò)增邏輯調(diào)控的數(shù)量。這些基因線路的輸出信號(hào)既可以是編碼某蛋白的基因，也可以是靶向大腸桿菌內(nèi)源性基因的gRNA，能夠操控各種各樣的細(xì)菌表型變化，如生物膜形成、代謝和細(xì)菌耐藥性。

最近通過使用不同的小分子誘導(dǎo)招募不同的轉(zhuǎn)錄因子，我們構(gòu)建了一個(gè)基于多正交dCas9，誘導(dǎo)型，多基因平行上調(diào)和下調(diào)的技術(shù)平臺(tái) (圖2C)[55]。通過將來自植物的脫落酸(Abscisic acid，ABA) 誘導(dǎo)的雙聚物蛋白體系或是來自植物的赤霉素(Gibberellin，GA) 誘導(dǎo)的雙聚物蛋白體系與不同來源的dCas9進(jìn)行融合，我們可以使用小分子來誘導(dǎo)招募轉(zhuǎn)錄激活因子或轉(zhuǎn)錄抑制因子。如果把兩種雙聚物蛋白體系串聯(lián)融合到dCas9蛋白上，則構(gòu)成了一個(gè)與門 (AND gate)，即只有當(dāng)兩個(gè)小分子都存在時(shí)才會(huì)誘導(dǎo)dCas9的相關(guān)功能 (圖2D)；如果把兩種雙聚物蛋白體系平行融合到同一個(gè)dCas9蛋白上來招募同一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子 (比如VP64)，則構(gòu)成了一個(gè)或門 (OR gate)，即任何一個(gè)小分子的存在都會(huì)誘導(dǎo)dCas9的相關(guān)功能 (圖2E)；如果在或門中招募的是兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄因子，比如一個(gè)是激活的，而另一個(gè)是抑制的，那么這就構(gòu)成了一個(gè)雙向開關(guān)器件 (Diametric device) (圖2F)。這個(gè)平臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)在于通過簡(jiǎn)單的蛋白組裝就能實(shí)現(xiàn)預(yù)期的邏輯器件和轉(zhuǎn)錄線路。

圖2 基于CRISPRi的邏輯門和基因線路。(A)使用加長(zhǎng)型sgRNA，以及可識(shí)別信號(hào)的核糖開關(guān)(Riboswitch)，可以在有小分子配體存在下造成RNA支架構(gòu)象發(fā)生變化成為基因開關(guān)。(B)由腫瘤細(xì)胞特異的啟動(dòng)子 (hTERT)和膀胱細(xì)胞特異的啟動(dòng)子 (hUPII) 驅(qū)動(dòng)，CRISPRi可以允許人們構(gòu)造基因線路用于篩選膀胱癌細(xì)胞和臨床治療。(C)通過使用不同的小分子配體誘導(dǎo)招募不同的轉(zhuǎn)錄因子，我們構(gòu)建了一個(gè)誘導(dǎo)型、正交dCas9系統(tǒng)，用于可編程模式的多基因平行上調(diào)和下調(diào)。(D) 當(dāng)把兩種雙聚物蛋白體系串聯(lián)到dCas9蛋白上，這構(gòu)成了一個(gè)與門 (AND gate)。(E) 當(dāng)把兩種雙聚物蛋白體系并聯(lián)到dCas9蛋白上來招募同一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(比如VP64)，這構(gòu)成了一個(gè)或門 (OR gate)。(F)如果在或門中招募的是兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄因子：一個(gè)是激活的，而另一個(gè)是抑制的，這就構(gòu)成了一個(gè)雙向開關(guān)器件(Diametric device)。

此外，將生物光學(xué)感應(yīng)系統(tǒng)與CRISPR/ dCas9系統(tǒng)相結(jié)合，也是CRISPR在合成生物學(xué)應(yīng)用的重要進(jìn)展之一。研究人員構(gòu)建了由藍(lán)光激活的CRISPR/Cas9效應(yīng)因子 (Light-activated CRISPR/Cas9 effector，LACE) 系統(tǒng)。首先分別將dCas9和CIB1融合，CRY2與VP64融合；當(dāng)有藍(lán)光照射時(shí)，dCas9-CIB1和CRY2-VP64融合形成異源二聚體，dCas9與VP64靠近，組成轉(zhuǎn)錄激活子，激活內(nèi)源靶基因的表達(dá)[56]。

4.3 CRISPR/Cas9用于細(xì)胞底盤制造和其他應(yīng)用

CRISPR/Cas9為細(xì)胞底盤制造提供了有力的工具。例如多位點(diǎn)的目標(biāo)DNA的刪除。可用于移植的器官的匱乏使得許多人類疾病的治療處于瓶頸。豬器官是目前可供人體移植的來源之一，但是豬體內(nèi)的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒一旦整合到人基因組，可能增加人類患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，因此抑制或清除豬內(nèi)源性病毒成為突破“豬器官移植到人”技術(shù)瓶頸的重要部分。利用CRISPR/Cas9人們可以清除豬腎上皮細(xì)胞系PK15的所有內(nèi)源性病毒PERVs，為臨床移植提供了重要支持[57]。

“CRISPR展示” (CRISPR-Disp) 法是使用各種可結(jié)合蛋白的RNA結(jié)構(gòu)域修飾gRNA (與scRNA類似)，使sgRNA在不同靶點(diǎn)時(shí)，細(xì)胞執(zhí)行不同的功能[58]。使用該方法分別共表達(dá)sgRNA與VP64以及gRNA與熒光蛋白，可以激活一個(gè)位點(diǎn)的同時(shí)成像另一個(gè)位點(diǎn)[58]。此外，CRISP-Disp平臺(tái)能夠招募長(zhǎng)鏈非編碼RNA到特異基因組位點(diǎn)，成為研究RNA功能的強(qiáng)大工具。

4.4 其他基因組工程技術(shù)在合成生物學(xué)的 應(yīng)用

真核生物中，ZFPs是由一系列識(shí)別DNA序列的鋅指蛋白 (Cys2-His2) 串聯(lián) (一般3–4個(gè)) 而成的小結(jié)構(gòu)域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成；每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基，隨后內(nèi)切酶對(duì)該位點(diǎn)的DNA雙鏈進(jìn)行切割，DNA片段與供體 (Donor) 通過同源重組修復(fù)方式相互連接，供體片段完成插入。工程化鋅指蛋白核酸酶(ZFN)對(duì)大鼠內(nèi)源性基因和的敲除效率可達(dá)25%–100%[59]。對(duì)人細(xì)胞中基因的X染色體相關(guān)性重度聯(lián)合免疫缺陷 (X-linked severe combined immune deficiency，SCID) 突變?cè)O(shè)計(jì)相應(yīng)的鋅指內(nèi)切酶，結(jié)果基因發(fā)生改變的細(xì)胞占18%，兩條X染色體的基因均發(fā)生改變的細(xì)胞占7%，說明改造后、工程化的鋅指內(nèi)切酶可用于臨床治療[60]。

TALEN蛋白家族來自一類植物病原體——黃單胞桿菌 (spp.)，可通過識(shí)別特異DNA序列調(diào)控宿主植物內(nèi)源基因的表達(dá)[61]。TALEN蛋白中部包含一段長(zhǎng)串聯(lián)重復(fù)序列，具有特異性識(shí)別、結(jié)合特異DNA序列的特性，可以根據(jù)需要進(jìn)行改造，靶向特異性位點(diǎn)。若與轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子 (如VP64或KRAB) 連接，則可發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[62-65]；若與內(nèi)切酶連接，則可進(jìn)行位點(diǎn)特異性基因組編輯[60,66]。使用GoldyTALEN支架可在斑馬魚的體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中進(jìn)行高度精準(zhǔn)的位點(diǎn)特異性修飾，某些位點(diǎn)的修飾效率可達(dá)100%[67]。由于TALE包含大量重復(fù)的結(jié)構(gòu)域，增加了合成新變體的難度。利用密碼子稀缺性特點(diǎn)和Ⅱ型核酸酶發(fā)明了一系列連接子的同源體用于連接每個(gè)重復(fù)單體，可實(shí)現(xiàn)根據(jù)級(jí)別合成、定制重復(fù)結(jié)構(gòu)域，并用此方法成功合成了17個(gè)特異調(diào)控人細(xì)胞內(nèi)源性和基因的TALE[64]。最新研究利用TALE轉(zhuǎn)錄抑制子文庫 (Transcription activator-like effector repressors，TALERs)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行模塊化拼裝，以合成基因線路的研究方法[68]。TALERRs由26種正交、可逆的TALE轉(zhuǎn)錄抑制子組成，與新設(shè)計(jì)的、可與之搭配的啟動(dòng)子結(jié)合后，阻擋轉(zhuǎn)錄起始因子的組裝，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄。通過計(jì)算輸入/輸出轉(zhuǎn)移函數(shù)，可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)TALER介導(dǎo)的基因級(jí)聯(lián)線路和基因開關(guān)線路功能。該研究是哺乳動(dòng)物合成生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)一項(xiàng)突破性技術(shù)進(jìn)展。

5 總結(jié)和展望

基于CRISPR的基因調(diào)控為合成生物學(xué)在大規(guī)?；罴?xì)胞基因線路調(diào)控上提供了新的機(jī)遇和無限的可能。盡管目前已經(jīng)取得較大的進(jìn)展和成績(jī)，但是合成生物學(xué)發(fā)展的步伐仍需加速，其中一個(gè)限制因素就是不能有效地設(shè)計(jì)、合成以特定的序列為靶點(diǎn)、高度特異性的轉(zhuǎn)錄元件，并且有效地調(diào)控靶基因?；贑RISPR方法操作的簡(jiǎn)便性及調(diào)控的高效性，使用該方法獲得合成型轉(zhuǎn)錄元件無疑是合成生物學(xué)的一個(gè)重要突破，也使科研人員能投入更多時(shí)間和精力到整體基因線路的設(shè)計(jì)上。

如前所述，利用dCas9與不同元件融合，不僅可實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的干擾或沉默 (CRISPR interference，CRISPRi)[44]，還有基因表達(dá)的激活 (CRISPR activation，CRISPRa)[45]和基因的表觀遺傳學(xué)修飾 (Epigenetic editing)[69]，甚至對(duì)全基因組進(jìn)行調(diào)控(激活和/或抑制)[70]、對(duì)多基因進(jìn)行“平行”調(diào)控[48]，以及在人iPS細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[71]。CRISPR/Cas技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，以其可大規(guī)模、高精度操作和低成本的特點(diǎn)，克服了一般合成生物學(xué)技術(shù)的瓶頸，大大促進(jìn)了合成生物學(xué)的進(jìn)步。

將來，充分利用CRISPR的優(yōu)勢(shì)會(huì)使合成生物學(xué)取得更加迅速、長(zhǎng)足的發(fā)展。合成生物學(xué)的發(fā)展不僅促進(jìn)基礎(chǔ)科學(xué)研究，更具有廣泛的實(shí)用性[72-73]，包括合成生物燃料、商業(yè)化合物，檢測(cè)環(huán)境，利用微生物凈化有毒廢物場(chǎng)或受污染水域等生物治理以及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)治療[74-75]。CRISPR技術(shù)允許調(diào)控多個(gè)基因組內(nèi)源基因，可以最大程度上模擬細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)、復(fù)雜的狀態(tài)，如細(xì)胞分化的機(jī)制[76]，以揭示生物體各種復(fù)雜表型的分子學(xué)機(jī)制；另外，表達(dá)的多個(gè)向?qū)NA與多種CRISPR轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合到一起，組合搭配成更多的調(diào)控元件，可用于建立更大規(guī)模、更高級(jí)別的基因合成線路。由于可以方便地設(shè)計(jì)向?qū)NA以激活或抑制微生物合成路徑中的多個(gè)基因，微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量將得到優(yōu)化，同時(shí)又可利用dCas9抑制細(xì)菌或病原菌中抗生素耐藥基因的表達(dá)[77]，這將促使微生物代謝工程學(xué)的發(fā)展加速前進(jìn)。

合成生物學(xué)正在加速滲透到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，正在對(duì)現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)生深刻的影響。目前普通的基因治療只能靶向一個(gè)基因，因此只適用于單基因遺傳病。而合成生物學(xué)的發(fā)展可以允許我們采用“基因線路療法”，即通過CRISPR方法精準(zhǔn)地調(diào)控多個(gè)基因，使得治療多基因疾病成為可能。

而合成生物學(xué)在腫瘤免疫治療領(lǐng)域也在飛速崛起。將合成生物學(xué)原理應(yīng)用于腫瘤治療使得科學(xué)家可以進(jìn)行免疫細(xì)胞的設(shè)計(jì)。比如通過設(shè)計(jì)生產(chǎn)特異靶向的CAR-T細(xì)胞(Chimeric antigen receptor T cells)，正在開展的臨床試驗(yàn)證明CAR-T對(duì)于治療慢性淋巴白血病 (Chronic lymphocytic leukemia，CLL) 有較好的療效[78]。而這一技術(shù)的核心是免疫細(xì)胞的設(shè)計(jì)，就是依據(jù)合成生物學(xué)的理念設(shè)計(jì)開發(fā)的。

展望未來，我們相信合成生物學(xué)的發(fā)展會(huì)允許我們將細(xì)胞作為藥物來加以使用。工程化的細(xì)胞將成為獨(dú)立于小分子藥物和生物制藥 (如抗體等) 以外的新藥物。將工程化細(xì)胞作為藥物有很多優(yōu)點(diǎn)：比如可以在細(xì)胞中編程復(fù)雜的邏輯，讓其識(shí)別更多樣的外部信號(hào)組合，并根據(jù)這些信號(hào)作出判斷以指導(dǎo)功能輸出 (比如殺死癌細(xì)胞)。而這一整套從感應(yīng)器到處理器再到執(zhí)行器的系統(tǒng)功能恰好是化合物小分子等藥物無法實(shí)現(xiàn)的。通過改造、設(shè)計(jì)細(xì)胞使其具有新的功能，為治療癌癥、阿茲海默癥和自免疫系統(tǒng)疾病帶來希望，而這也將催生出一個(gè)新的產(chǎn)業(yè)，我們稱為“細(xì)胞設(shè)計(jì)工廠”?？梢韵胂?，未來的醫(yī)學(xué)是依賴于“細(xì)胞設(shè)計(jì)工廠”來精準(zhǔn)治療復(fù)雜的疾病。在精準(zhǔn)醫(yī)療的框架下，醫(yī)生可以制定有針對(duì)性的、多樣化的細(xì)胞治療策略。而“細(xì)胞設(shè)計(jì)工廠”則將醫(yī)療策略通過編程、設(shè)計(jì)細(xì)胞的方法，將其轉(zhuǎn)化為可以用于治療的細(xì)胞產(chǎn)品。而這一產(chǎn)業(yè)鏈則可以最大可能地實(shí)現(xiàn)高效、安全、通用、低成本的未來醫(yī)學(xué)理念，也是我們預(yù)期未來醫(yī)學(xué)合成生物學(xué)發(fā)展的關(guān)系到國(guó)計(jì)民生的一個(gè)重要方向。

致謝：感謝斯坦福大學(xué)生物工程系亓磊教授實(shí)驗(yàn)室全體成員，尤其是博士后王海峰在圖片制作過程中提供了幫助。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

亓磊 國(guó)際知名的生物工程專家，在醫(yī)學(xué)合成生物學(xué)領(lǐng)域和基因組編輯領(lǐng)域作出重要的貢獻(xiàn)，目前在斯坦福大學(xué)任助理教授。畢業(yè)于清華大學(xué)，在美留學(xué)期間，師從美國(guó)第12任能源部部長(zhǎng)朱棣文教授，并在加州大學(xué)伯克利分校獲得生物工程學(xué)博士學(xué)位。由于成績(jī)顯著，畢業(yè)后即被加州大學(xué)舊金山醫(yī)學(xué)院聘為研究員。近年來先后作為第一作者和通訊作者在、及其子刊等國(guó)際頂尖學(xué)術(shù)期刊上多次發(fā)表重要成果，引用超過1 500次，在國(guó)際上有重要影響力。并在、等多家刊物任審稿人。參加過多項(xiàng)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的課題研究，擁有多項(xiàng)專利。同時(shí)還是美國(guó)多家協(xié)會(huì)(包括生物工程學(xué)學(xué)會(huì)、合成生物學(xué)學(xué)會(huì))的會(huì)員，組織了多項(xiàng)重要的學(xué)術(shù)會(huì)議。

趙德華 美國(guó)斯坦福大學(xué)生物工程系研究科學(xué)家。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)博士，加州大學(xué)伯克利分校博士后，先后在加州大學(xué)舊金山分校和麻省理工大學(xué)從事合成生物學(xué)研究工作。主要研究方向是基因編輯方法的開發(fā)及其在工程化免疫細(xì)胞生產(chǎn)中的應(yīng)用。美國(guó)生物化學(xué)和分子生物學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)員。在、、、等國(guó)際學(xué)術(shù)期刊發(fā)表研究論文 10余篇。

Application of genome engineering in medical synthetic biology

Fangyuan Wang1, Dehua Zhao2, and Lei Stanley Qi2

1-,,,,,200127,Department of BioengineeringStanford UniversityCAUSA

Synthetic biology aims to establish a complete set of engineering principles, theories, and methods,the rational design and assembly of basic biological parts, for the goal of effective implementation of complex biological systems with programmable functions. In recent years, with emerging novel classes of programmable genetic parts, in particular, the establishment and optimization of CRISPR and CRISPRi technology platforms, synthetic biology is entering a new era. This review summarizes recent advances on CRISPR genome editing and gene regulation technologies, their applications in constructing programmable biological parts, and their roles in building sophisticated gene circuits. We also provide a future vision on how synthetic biology can transform medicine (named medical synthetic biology, MSB) and therapeutics.

synthetic biology, gene circuit, CRISPR, CRISPRi, TALEN, ZFN, genome editing, cell design lab

November 2, 2016; Accepted: February 7, 2017

Dehua Zhao. E-mail: dehuazhao@gmail.com

Lei Stanley Qi. Tel: +1-(650)498-9986; E-mail: Stanley.qi@stanford.edu

Supported by:National Institutes of Health (No. DP5 OD017887), Renji Hospital affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine.

2017-02-16

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170228.0916.001.html

美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院 (No. DP5 OD017887)，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院資助。