李詩淵，趙國屏，王金

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合成生物學技術的研究進展——DNA合成、組裝與基因組編輯

李詩淵1,2，趙國屏1，王金1

1 中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態(tài)研究所合成生物學重點實驗室，上海 200032 2 中國科學院大學，北京 100049

李詩淵, 趙國屏, 王金. 合成生物學技術的研究進展——DNA合成、組裝與基因組編輯. 生物工程學報, 2017, 33(3): 343–360.Li SY, Zhao GP, Wang J. Enabling technologies in synthetic biology——DNA synthesis, assembly and editing. Chin J Biotech, 2017, 33(3): 343–360.

合成生物學作為一門新興學科，其目標主要有兩點：一是利用非天然的分子使其出現(xiàn)生命的現(xiàn)象，也就是“人造生命”；二是“改造生命”，比如利用一種生命體的元件(或經(jīng)過人工改造)，組裝到另一個生命體中，使其產(chǎn)生特定功能。無論是哪種目的，對生命遺傳物質(zhì)DNA的操作都非常關鍵，其具體包括DNA的從頭合成、組裝和編輯等。同時，這些使能技術的進步也促進了合成生物學其他領域的發(fā)展。本文介紹了DNA操作相關的合成生物學使能技術的最新進展。

合成生物學，使能技術，DNA組裝，基因合成，基因組編輯

20世紀90年代開始，DNA的大量測序為合成生物學的發(fā)展打下了堅實的基礎[1]。2000年，Collins等團隊在大腸桿菌中成功構(gòu)建了撥動開關和振蕩器[2-3]；這些工作也預示著合成生物學這一新學科的正式開啟。2010年，Venter團隊利用化學合成的絲狀支原體JCVI-syn1.0基因組DNA替換了原山羊支原體的細胞，并成功實現(xiàn)了自我復制，對“人造生命”具有里程碑的意義[4]。雖然合成生物學僅經(jīng)歷十多年的發(fā)展，但已經(jīng)取得了不少進展?？梢灶A期，合成生物學將對藥物、能源、材料、環(huán)境以及人類的健康等領域產(chǎn)生重大影響[5]。

合成生物學作為一門生物學與工程學融合的學科，實際上是工程學的思維在生物學領域的應用[6]。工程學中重要的策略，標準化(Standardization)、模塊化(Modularity/decoupling)以及建模(Abstraction/modeling) 在合成生物學中同樣關鍵。另外，合成生物學家們將復雜的系統(tǒng)分解，利用工程學的思維在不同的尺度上(如元件、回路、途徑等) 進行設計、組裝構(gòu)建、測試并重新設計的循環(huán)實驗過程；其中，每一步工作都有新技術被不斷地開發(fā)出來[7]。對這些技術的開發(fā)和利用也能進一步促進合成生物學的快速發(fā)展。本文就合成生物學中DNA操作的相關技術加以介紹，其中包括DNA組裝、DNA從頭合成和基因組編輯等。

1 DNA組裝

20世紀70年代，第一次將DNA片段通過限制性內(nèi)切酶和連接酶實現(xiàn)了DNA序列的“切和連”，從而開啟了基因工程的生物技術革命[8-9]。合成生物學延續(xù)了基于重組DNA的技術，同時又加入了新的要求和思想。從大方向來說，DNA組裝技術追求兩個大的方向，一個是建立組裝的標準，實現(xiàn)其操作標準化[10]，另一個是建立更簡便、高效且能組裝更大更復雜片段的方 法[11]。BioBrick的標準是Tom Knight等在2003年提出的，是最先建立的一套DNA體外拼接標準。該方法利用了一組標準化的限制性內(nèi)切酶酶切位點，分別叫做前綴(含RⅠ、Ⅰ位點) 和后綴(含Ⅰ、Ⅰ位點) 的序列位于每一個生物元件的兩端。利用這些位點進行切割和后續(xù)的連接便形成了一個標準化的DNA拼接流程[12]。BioBrick標準目前仍然應用于合成生物學領域，特別在每年的國際遺傳工程機器大賽(iGEM) 中，很多工作的實現(xiàn)都是利用BioBrick標準。BioBrick標準對合成生物學的主要貢獻包括以下兩點：首先，兩端的內(nèi)切酶序列為單個生物元件設立了物理邊界，因此DNA的拼接可以像樂高玩具一樣，便于將來工程化的操作；其次，在整個研究群體中，標準化拼接方法的建立可以實現(xiàn)不同研究團體間DNA元件的通用，避免了重新構(gòu)建的麻煩，也實現(xiàn)了資源共享。盡管有這些優(yōu)勢，但是BioBrick最主要的局限是元件序列中不能含有前后綴中的酶切位點序列。另外，連接中會形成疤痕序列，這種疤痕序列可能會影響生物元件的功能，并且不能用此方法構(gòu)建融合蛋白。

1.1 基于內(nèi)切酶的拼接方法

針對BioBrick標準的缺陷，陸續(xù)產(chǎn)生了不少改進的標準。比如BglBrick標準中利用Ⅱ和HⅠ作為同尾酶連接，從而使得連接之后得到的疤痕序列(編碼甘氨酸-絲氨酸)，且可以實現(xiàn)兩個蛋白的融合表達[13]。另外，我們實驗室建立的iBrick標準，利用識別長序列的歸位內(nèi)切酶代替了常規(guī)的Ⅱ型限制性內(nèi)切酶，從而避免了BioBrick標準中對于DNA元件序列的要求(例如，不能含有標準中的酶切位點等)[14]。但iBrick也存在明顯的缺點，即利用iBrick標準拼接的兩個元件之間會形成一個較長的疤痕序列。最近，我們利用CRISPR相關蛋白Cpf1開發(fā)了一套C-Brick的拼接標準。由于Cpf1可以由人工設計的crRNA特異性引導切割DNA并形成5′突出的粘性末端，通過類似BioBrick的前后綴設計思路，從而實現(xiàn)DNA元件的標準化拼接。C-Brick的優(yōu)點是，不僅可以識別長的序列(26 bp左右的特定序列)，而且產(chǎn)生短的疤痕序列(編碼的氨基酸與BglBrick相同)[15]。

此外，基于限制性內(nèi)切酶的拼接方法還包括Golden Gate以及在此基礎上的改進方法。Golden Gate拼接方法利用ⅡS類(type ⅡS) 限制性內(nèi)切酶，其切割位點位于識別位點之外，因此留下一個可變的粘性末端，可以實現(xiàn)多片段一步法無縫連接[16-17]。Golden Gate雖然操作方便，其仍然受限于DNA中廣泛存在的酶切位點。為此，本實驗室建立了MASTER (Methylation-assisted tailorable ends rational) 連接法。該方法使用了甲基化依賴的JⅠ，它兼具type ⅡM和type ⅡS的性質(zhì)，即它只識別甲基化的4 bp序列mCNNR (R=A或G)，并且切割位點在識別位點之外。通過PCR或添加接頭，可以很方便地在所需連接的片段兩端加入JⅠ的識別序列，從而實現(xiàn)多個大片段的無縫拼接[18]。

1.2 位點特異性重組

位點特異性重組舍棄了限制性內(nèi)切酶，取而代之的是噬菌體整合酶。這些位點特異性整合酶可以識別不同版本的附著點(attB、attP) 序列，然后實現(xiàn)這些DNA序列之間的重組。目前，最常用的是Gateway克隆方法，其具體流程是通過λ整合酶將需克隆的DNA (兩端含正交的兩個位點attB與attP) 直接重組到載體中[19]。這個方法簡單、高效，在克隆文庫的構(gòu)建和真核表達系統(tǒng)的分析中被廣泛應用[20-21]。通過合成多個正交的att重組序列，Gateway方法也可以實現(xiàn)多個DNA片段的一步法、按順序拼接[22]。

然而，Gateway (或類似) 拼接方法會在拼接完成的DNA序列之間留下重復的疤痕序列，可能會對DNA的結(jié)構(gòu)、mRNA的折疊以及DNA的生物學功能帶來一定問題。

1.3 基于重疊序列的拼接

Gibson等開發(fā)了一種廣泛采用的拼接方法(Gibson assembly)，可以實現(xiàn)多片段體外一步法拼接[23]。這個方法通常需要一個線性化的載體和若干個PCR產(chǎn)物，在相鄰兩個DNA片段之間留有20?40 bp的重疊區(qū)。在反應階段，T5外切酶將DNA的5′端序列部分消化，形成3′突出的粘端。然后在50 ℃下使得T5外切酶失活的同時，片段之間的重疊區(qū)退火連接，然后在Phusion聚合酶的作用下，補平片段間的間隔區(qū)，最后利用DNA連接酶連接好DNA缺刻。Gibson assembly方法非常簡單，可以一次組裝5個或更多的片段，且整個反應只需1 h；組裝完成的反應物可直接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。比如，用Gibson assembly方法拼接完成了生殖支原體基因組的拼接(583 kb)[23]。Gibson方法能拼接最大片段的限制還不確定，但目前已經(jīng)有900 kb片段拼接成功的案例[23]。

基于重疊序列拼接的方法還有SLiC (Sequence and Ligase-independent Cloning)[24]，CPEC (Circular Polymerase Extension Cloning)[25]和SLiCE (Seamless Ligation Cloning Extract)[26]等。SLiC方法利用T4 DNA聚合酶處理載體和插入片段，在無dNTPs狀態(tài)下，T4 DNA呈現(xiàn)外切酶的活性。然后加入dCTP終止外切反應，然后將載體與片段混合并退火[24]。由于SLiC沒有延伸和連接，所以缺口的補平在大腸桿菌體內(nèi)完成。CEPC是一種基于PCR的連接方法，經(jīng)過變性使得載體與插入片段形成單鏈，由于兩者間有重疊序列，退火后可以互為引物進行延伸，由此可以進行連接[25]。SLiCE區(qū)別于SLiC的地方在于該反應中利用大腸桿菌細胞提取物，這樣就不需要額外的聚合酶和DNA連接酶，而且操作簡單便宜，1 h之內(nèi)即可完成[26]。

此外，一些生物技術公司也開發(fā)了簡單易用的無縫拼接試劑盒，可以實現(xiàn)單個或多個DNA片段的一步法無縫拼接，例如TaKaRa公司的In-Fusion試劑盒(50 ℃條件下反應)、上海吐露港公司的Ezmax無縫拼接試劑盒(37 ℃條件下反應) 等。這些公司的產(chǎn)品雖然效率很高，但均沒有公布具體的實驗機制或?qū)＠墨I，其具體的操作原理未知。

相比傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶方法，基于重疊序列的拼接方法最明顯的優(yōu)勢是不需要考慮片段內(nèi)部的序列限制。但必須指出的是，重復序列、短序列或容易形成二級結(jié)構(gòu)的序列都會降低這些方法的效率和成功率，因此需要盡量避免。

1.4 體內(nèi)DNA拼接

許多物種體內(nèi)具有強大的重組系統(tǒng)，例如枯草芽胞桿菌和酵母菌等。利用體內(nèi)的重組系統(tǒng)可以將兩端帶同源序列的片段通過重組的方法連接起來；該方法對于大片段DNA的拼接非常有優(yōu)勢。例如，Itaya等利用枯草芽胞桿菌，組裝了小鼠線粒體基因組和水稻葉綠體基因組[27]；Venter的團隊利用酵母系統(tǒng)拼接了的生殖道支原體JCVI-1.0基因組[28-29]和1.1 Mb的絲狀支原體基因組[4]。在實際的應用中，多個超大DNA片段同時轉(zhuǎn)化到酵母體內(nèi)有一定的技術難度；覃重軍團隊開發(fā)了CasHRA技術，利用酵母原生質(zhì)體融合，結(jié)合Cas9在體內(nèi)切割釋放出待拼接的DNA片段，然后利用酵母體內(nèi)重組系統(tǒng)將片段拼接，最后得到1.03 Mb的MGE-syn1.0最小大腸桿菌基因組[30]。

2 DNA從頭合成

盡管通過體內(nèi)體外改造天然的DNA序列可以解決很多問題，但更多的情況下，DNA的從頭合成有著許多獨特的優(yōu)勢[31]。首先，工程化改造一個新功能的DNA序列常常需要大幅度甚至是全序列的改變，因此利用從頭合成的技術是最容易實現(xiàn)目的的。第二，對于研究遺傳學機理方面，經(jīng)過人工優(yōu)化合成的序列往往要優(yōu)于天然的序列，因為這些序列可以設計并測試一些假說。第三，很多序列很難獲得天然來源的模板來進行進一步的擴增和修飾，例如，利用宏基因組數(shù)據(jù)拼接完成的序列。這里我們介紹DNA從頭合成的技術，包括從大規(guī)模的單鏈DNA的合成、進一步組裝成更長雙鏈DNA序列以及其中存在的一些問題。

2.1 寡核苷酸合成

寡核苷酸的合成可以追溯到20世紀50年代在實驗室中進行的DNA合成；接著在80年代逐漸形成了自動化和商業(yè)化；而到了90年代，基于高通量的寡核苷酸合成的方法取得了重要進展[32]。

2.1.1 柱式寡核苷酸合成

20世紀50年代，Todd等第一次成功合成寡核苷酸[33]。如今，絕大部分寡核苷酸都是利用自動化的設備通過固相亞磷酰胺化學法來進行合成。其具體過程由4步循環(huán)組成，分別是：1) 去保護；2) 偶聯(lián)；3) 加帽和4) 氧化[34]，且一個循環(huán)生成一個新的核苷酸。

這種自動化的方法通?？梢赃_到96?384條核苷酸合成通量，每一條10到100 nmol的含量。多年來，材料、自動化、加工和純化方面的進步使得合成100 nt的核苷酸大約是每核苷酸0.05?0.15美元，錯誤率在1/200甚至更低?；瘜W法合成的局限在于合成的長度和錯誤率，有以下幾個原因。首先，每一步循環(huán)的產(chǎn)量必須非常高，特別是對于生產(chǎn)長鏈的寡核苷酸。比如說，即使每一循環(huán)的產(chǎn)量達到99%，那么對于200 nt的寡核苷酸來說，最終理論上只能得到13%的全長產(chǎn)物。另外，脫嘌呤反應，特別是腺嘌呤會在合成長寡核苷酸時出現(xiàn)問題[35]。最后，即使成功合成的寡核苷酸也可能有一定概率的錯誤[36]。因此，還需要研發(fā)新的化學工藝來增加合成長度和提高質(zhì)量。

2.1.2微陣列介導的DNA合成

20世紀90年代的早期，Affymetrix公司開發(fā)了基于微陣列合成的方法[37-38]。他們運用有掩模光刻法(Mask-based photolithographic) 技術，來選擇性去保護光不穩(wěn)定核苷亞磷酰胺。如今，已有多種方法對DNA微陣列從空間上進行去保護。無掩模程序大大簡化了光刻技術，通過程序化的微鏡設備，直接用光進行化學反應[39-40]。微陣列表面進行噴墨打印核苷酸的技術(Agilent公司所用) 可以用標準亞磷酰胺法合成寡核苷酸[41-42]。另外，CustomArray公司開發(fā)了基于半導體的電化學法來選擇性去保護核酸[43]。目前，科研界使用的寡核苷酸池主要來自于Agilent和CustomArray公司；其價格要比柱式便宜2?4個數(shù)量級(根據(jù)不同長度、規(guī)模和平臺，每個核苷酸0.000 01?0.001美元)。

2.2 基因合成

將一組寡核苷酸(通常是5?50個) 通過一定的方法組裝成更大的片段(通常200?3 000 bp)，叫做基因合成(Gene synthesis)，當然這里的基因指的是基因長度的意思。最初，Khorana研究團隊用T4 DNA連接酶將寡核苷酸連接成了80–200 bp長度的序列[44-45]。這種基于連接的方法，將互補重疊的鏈通過連接酶反應形成更長的片段。后來，將普通連接酶改成耐熱連接酶，在高溫下(50?65 ℃) 連接，從而減少了寡核苷酸鏈二級結(jié)構(gòu)的形成[46-47]。聚合酶循環(huán)組裝PCA (Polymerase cycling assembly) 的方法是目前更常用的拼接方法，這種方法利用聚合酶將片段重疊區(qū)進行延伸，形成雙鏈DNA片段[48]。連接法和PCA法通常都需要利用PCR進行進一步的擴增，并進行最終的克隆和測序確認。

兩種方法有各自的優(yōu)缺點，連接法合成降低了錯誤率的發(fā)生，這是因為錯誤的序列雜合并連接的可能性較低。然而，上下兩條鏈都需要完整地被寡核苷酸鏈覆蓋，并且5′末端需要磷酸化修飾，因此這種方法的價格更高。PCA的方法只需要在兩條寡核苷酸鏈之間有15?25 nt的重疊即可，因此相比連接法，PCA合成的寡核苷酸更少。當然，沒有雜交過程的錯誤過濾，PCA合成的錯誤率要高一些。

雖然微陣列合成寡核苷酸非常便宜，但對于基因合成還有一些挑戰(zhàn)。首先，雖然一個“pool”中合成的寡核苷酸數(shù)量非常大，但是大多數(shù)情況下單種的濃度很低。第二，微陣列合成的錯誤率通常比基于柱式合成的方法更高。最后，生產(chǎn)的寡核苷酸絕對數(shù)量在基因拼接中易導致干擾，使得很難按比例進行放大。

實際上，這些困難應該都是可以克服的。田敬東等在拼接前，利用PCR的方法擴增提高寡核苷酸的濃度，通過與反向互補鏈的雜交來降低錯誤率，然后通過設計蛋白序列結(jié)合計算來避免可能的錯誤雜交[49]。但是，這個工作一次只用了十幾到上百條寡核苷酸序列。超過1 000個寡核苷酸就很難用這個方法[50]。因此，一個寡核苷酸pool越大，價格優(yōu)勢就越明顯，但合成基因就變得越困難。另外，這種方法需要在合成的基因序列中有足夠的序列正交性，這也限制了一部分潛在的應用范圍。目前，主要采用通過將寡核苷酸分離成“subpool”的方法來避免序列的復雜性和正交性。Kosuri等用預先設計好的“條形碼”序列進行PCR擴增，這些擴增的序列參與部分拼接，并且在標準拼接之前需要將“條形碼”序列切除[51]。Quan等用噴墨合成的方法，用物理手段將寡核苷酸序列分組到分開的微孔中，然后原位擴增拼接[52]。這兩種方法都用到了更大的寡核苷酸pool (>10 000條寡核苷酸)，并通過酶法糾正錯誤序列，提高拼接準確率，從而為其將來的商業(yè)化鋪平了路。

2.3 錯誤序列的糾正

在基因序列組裝完成之后，還需要對合成的基因進行測序確認。在整個基因合成的過程中，該步驟成本高、耗時，而且很難自動化。因此，減少基因合成過程中的錯誤率，可以減少待驗證克隆的數(shù)量，從而降低工作量和合成成本。前期的方法是融合一個編碼蛋白的序列，通常是抗性蛋白或熒光蛋白[53-54]。由于單堿基的缺失會導致移碼從而使蛋白失活，通過篩選可以去除很多錯誤序列；但這種方法僅限于蛋白編碼的序列。

更常用的糾錯方法是利用酶的方法來降低錯誤率。所有這些技術都基于一個事實，就是在每個位置，大多數(shù)寡核苷酸分子序列是正確的堿基。加熱、退火可以迫使異源雜合鏈的形成，從而形成不標準的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。這種破壞可以被一些蛋白識別并作用。MutS可以結(jié)合雜合鏈，通過反向純化可以過濾掉這些錯誤鏈[55]。一些聚合酶有外切酶、內(nèi)切酶和解鏈的活性，通過切割雜合位點再重新擴增也能夠達到過濾錯誤序列的目的[36,56-58]。有些商業(yè)化公司也利用混合酶ErrASE來減少合成基因的錯誤率[51]。

最近幾年，有研究人員運用第二代測序技術(Next-generation sequencing，NGS) 篩選正確序列，可以在寡核苷酸水平或基因水平篩選正確的目標DNA序列。Matzas等利用454測序法結(jié)合機器吸取移液頭，自動化讀取序列并利用正確的序列合成基因[59]。Kim等也利用454測序，但在每個分子上標有隨機標簽，通過測序正確的序列則利用特定標簽序列進行進一步擴增[60]。兩種方法都能夠降低突變率，雖然這些方法仍然會面臨測序錯誤和更昂貴的長鏈測序的問題。Schwartz等用Illumina測序法來獲取正確序列，通過帶標簽測序的方法克服了長測序錯誤的局限，然后通過標簽引物PCR擴增(Dial PCR)[61]。這3種方法降低了錯誤率，并且隨著DNA測序技術的進步而改進。

2.4 從頭合成的大片段DNA組裝

商業(yè)機構(gòu)和學術系統(tǒng)已經(jīng)可以用高效、高正確率、高可靠性以及低成本的方法將基因長度的片段拼接成更大的片段。目前，有不少無縫拼接的方法(如前文所述)。對于大片段的拼接也可以應用這些方法，特別是Gibson和體內(nèi)酵母拼接已經(jīng)實現(xiàn)基因組大小的片段的一步拼接[23,28]。

因此，對于從頭合成的應用，合成基因大小的片段的花費和錯誤比拼接大片段DNA更為重要。

3 基因組編輯工具

基因組編輯工具在過去一段時間里得到了迅猛的發(fā)展，目前已經(jīng)有不少能夠靶向基因組特定位點的工具。最早期使用同源重組的方法進行基因組的編輯[62]，但不同系統(tǒng)的效率不一，而且通常需要引入抗性等篩選標記。后來，利用位點特異性重組酶系統(tǒng)大大提高了效率，包括Cre蛋白(Cyclization recombinase) 和與之對應的loxP序列，F(xiàn)lp-FRT系統(tǒng)，C31整合酶-att位點[63-65]。這些系統(tǒng)首先需要loxP、FRT、att序列插入到基因組上的特定位點，然后引入位點特異性重組蛋白，使得基因組DNA重排。近幾年位點特異性切割蛋白得到了迅速發(fā)展，從大型核酸酶(Meganuclease) 的應用[66-67]，到鋅指蛋白核酸酶ZFN (Zinc-finger nuclease)[68-70]、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶TALEN (Transcription activator- like)[71-72]和CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)[73-75]等。這些工具的共同點都是在細胞內(nèi)引起DNA雙鏈的斷裂(Double-strand breaks)，然后通過細胞自身的非同源末端連接引起錯誤修復，或者額外加入同源重組模板進行重組修復的精確編輯。這些方法的優(yōu)缺點對比見表1。具體來說，大型核酸酶是一類識別長序列(12?45 bp) 的核酸內(nèi)切酶，特異性高，但通常需要將這段識別序列先插入到特異位點中，因此造成一定的不便。之后，發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白可以被工程化改造為特異性識別的核酸酶ZFN，通過融合序列特異性DNA結(jié)合的鋅指蛋白串聯(lián)重復序列與Ⅰ核酸酶結(jié)構(gòu)域。另一工程化的核酸酶是TALEN，這一改造思路與鋅指蛋白類似，同樣需要融合Ⅰ核酸酶，但TALEN的特異性和效率都要優(yōu)于ZFN。ZFN和TALEN這兩個系統(tǒng)在實際切割過程中，都需要一對蛋白靶向到相鄰的兩端DNA序列上，使得Ⅰ核酸酶形成二聚體進行雙鏈DNA切割。最近幾年，來源于原核生物的CRISPR系統(tǒng)(特別是Cas9)，由于其簡便、高效而受到了廣泛的關注。此外，2015年張鋒實驗室發(fā)現(xiàn)了另一個CRISPR相關蛋白Cpf1同樣可以進行基因組編輯[76]，且擁有比Cas9更低的脫靶率，因而同樣具有很大的應用潛力[77-78]。在本綜述中，我們將重點介紹目前最具應用前景和發(fā)展?jié)摿Φ腃RISPR技術。另外，除了單個位點或少數(shù)位點的基因組編輯技術外，對于高通量基因組編輯工程也會做一簡要介紹。

表1 不同內(nèi)切酶系統(tǒng)比較

3.1 CRISPR技術

3.1.1CRIPSR的免疫機理

CRISPR系統(tǒng)是許多細菌和大多數(shù)古菌的獲得性免疫系統(tǒng)。這些含有CRISPR系統(tǒng)的菌株會首先從侵染它們的噬菌體或質(zhì)粒上獲得一些DNA片段，并轉(zhuǎn)錄成crRNAs (CRISPR RNAs)。在同樣的外源核酸再次侵染時，crRNAs會引導Cas蛋白切割再次侵染的RNA或DNA，從而幫助宿主獲得了對該外源核酸的免疫[79-80]。

一般來說，CRISPR系統(tǒng)響應外源侵染的DNA分為3個階段[81]。第一個階段也被稱為獲取階段，宿主獲取侵染的質(zhì)粒或噬菌體的DNA片段(叫做protospacers) 并插入到CRISPR基因座的重復序列中。第二個階段，Cas蛋白表達，含有spacer的CRISPR序列轉(zhuǎn)錄成前體crRNA (pre-crRNA)，接著前體crRNA被加工成成熟的crRNA。加工完成的crRNA起引導作用，通過Cas蛋白和其他RNA組分靶向侵染的基因組[82]。在typeⅡ的CRISPR系統(tǒng)中，非編碼的tracrRNA與crRNA的重復序列結(jié)合，這對crRNA的加工、Cas9蛋白的結(jié)合和Cas9介導的靶向切割非常重要。在第3個階段，Cas蛋白在crRNA的介導下，識別特定的靶標序列并切割靶標序列，從而達到宿主細胞預防侵染的作用。另外，許多CRISPR系統(tǒng)需要在靶標臨近存在短的PAM (Protospacer Adjacent Motif) 序列[83]。在Cas蛋白中，目前研究得最為清楚的就是Cas9和Cpf1，下面將從其結(jié)構(gòu)、應用等多方面對其進行詳細闡述。

3.1.2Cas9的結(jié)構(gòu)

Cas9完成識別和切割有3個成員參與了這一過程，包括被切割的雙鏈DNA，起引導作用的sgRNA和切開雙鏈作用的Cas9蛋白[84-85]。

在Cas9/sgRNA/DNA復合體中，組分雙鏈DNA中必須含有PAM序列，這段短的序列緊挨著sgRNA識別序列，對Cas9的結(jié)合與有效切割起著重要作用。比如，最常用的來源于釀膿鏈球菌SpCas9的PAM是NGG[74]。第2個組分sgRNA實際上是人工改造過的crRNA，即將天然狀態(tài)下的crRNA和tracrRNA通過一段接頭連成了1個RNA，叫做sgRNA (Single guide RNA)，具有同樣的活性功能[74]。sgRNA可分為3個部分，第1個部分是20 nt左右的序列與靶標DNA互補配對；第2個部分是repeat-antirepeat序列，這段序列本身是tracrRNA互補結(jié)合crRNA的部分，同時一部分也對Cas9的活性發(fā)揮作用；第3個部分是3個loop結(jié)構(gòu)，這段序列對于sgRNA與Cas9的結(jié)合非常關鍵。一部分研究顯示去掉第3個loop在體外也能很好地發(fā)揮活性[74]，但有些研究顯示完整的sgRNA在體內(nèi)的活性更高[86]。Cas9蛋白及其與DNA和sgRNA組成的復合體都已解析了晶體結(jié)構(gòu)[83-84]。從整體看，Cas9由內(nèi)切酶部分(NUC) 和α-螺旋識別部分(REC) 組成。其中，NUC包含HNH內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域、RuvC-like內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域、PAM相互作用結(jié)構(gòu)域(PI) 和1個進化上趨異的楔形結(jié)構(gòu)域(WED)。RuvC和HNH結(jié)構(gòu)域分別切割雙鏈DNA中的一條鏈；PI結(jié)構(gòu)域與DNA上的PAM序列通過堿基的相互作用，對Cas9的特異性起到非常重要的作用。WED結(jié)構(gòu)域識別sgRNA骨架，不同來源的Cas9的WED差異大，同時它與PAM序列的骨架也有相互作用。螺旋REC部分不同的Cas9差異較大，它包含負責識別sgRNA和靶標DNA雜合體的區(qū)域，同時也特異性識別sgRNA的骨架。另外，生化實驗和結(jié)構(gòu)研究也表明，Cas9作用于DNA并切割的過程中，構(gòu)象發(fā)生了一系列的變化。

3.1.3Cas9的應用

Cas9介導的基因組編輯需要兩個步驟：DNA的切割和DNA的修復。sgRNA引導Cas9與特定的DNA結(jié)合，并切割引起DNA雙鏈的斷裂(DSB)[80]。雙鏈斷裂后，主要會引發(fā)體內(nèi)兩套修復系統(tǒng)的修復，一種是錯誤傾向的非同源末端連接修復(NHEJ)，另一種是精確的同源重組修復(HR)。當然也有研究表明，有些情況下存在MMEJ (Microhomology-mediated end joining) 的修復方式[87]。NHEJ修復方式存在于真核細胞中，少數(shù)原核細胞有不同于真核的較簡單的NHEJ。NHEJ會在雙鏈斷裂的位置附近引起隨機的插入或缺失突變，會導致基因的敲出(例如引起移碼突變或關鍵位置編碼蛋白的變化)。HR的修復方式需要加入一段供體DNA作為模板，利用同源重組原理，進行精確的修復。這種修復方式可以進行基因的敲出、突變、插入或者基因的修正。值得一提的是，雖然大多數(shù)原核生物(包括大腸桿菌) 沒有NHEJ系統(tǒng)，但是可以通過利用Cas9切割后，額外加入重組的模板序列，這樣的做法可以提高原核生物中基因編輯的效率和成功率。

基于Cas9的基因編輯技術已經(jīng)得到了廣泛的應用，例如對特定基因的研究，疾病模型的建立，以及遺傳和感染性疾病治療的研究[80,88]。通過引入多個sgRNA，Cas9可以同時切割多個位點，因而可以應用于大規(guī)模的染色體重排[89]。

3.1.4 Cpf1的發(fā)現(xiàn)與應用

2013年開始，通過生物信息學的分析發(fā)現(xiàn)了另外一種Class 2類型的CRISPR系統(tǒng)，這種假定的type V的系統(tǒng)包含1個約1 300個氨基酸的大蛋白，被稱為Cpf1[90]。2015年，張鋒實驗室研究發(fā)現(xiàn)，Cpf1與Cas9一樣都是RNA介導的DNA內(nèi)切酶，但在許多特性上又不同于Cas9蛋白[76]。首先，Cpf1只需要crRNA即可引導切割，而不需要tracrRNA；它識別的PAM是富含T的序列。另外，Cpf1切割雙鏈DNA后，留下1個5′突出的粘性末端。張鋒團隊測試了16個Cpf1家族的蛋白，鑒定了來源于氨基酸球菌屬和毛螺菌屬的2個Cpf1能在人類細胞中發(fā)揮切割活性[76]。

最近，有研究證明Cpf1的體內(nèi)脫靶率遠低于Cas9[77-78]，這對研究應用和臨床應用具有巨大的潛力。此外，Cpf1又有不同于Cas9的特性，比如切割成粘性末端[76]，同時具有切割DNA和RNA的能力等[91]，可以改造成其他有用工具的潛力。

3.1.5有待改進問題

盡管CRISPR/Cas9的研究在近些年進展飛快，而且在研究和醫(yī)療的應用上具有巨大潛力，但有3個方面還有待改進，包括提高特異性、效率以及時空控制[92]。

特異性：常用的SpCas9系統(tǒng)的脫靶效應非常明顯，因為靶標序列的長度是20 bp加上3 bp的PAM序列，基因組上其他位置存在相似的序列就有可能也發(fā)生切割[93-94]。目前已經(jīng)有不少策略來降低脫靶的可能，比如：優(yōu)化sgRNA的設計，從序列信息上選擇與基因組上其他位置相似度低的序列；運用一對nCas9 (nickase Cas9) 或者一對dCas9-FokI核酸酶來切割[95-96]；縮短sgRNA的長度(17?18 bp) 或者在sgRNA的5′端加2個不配對的G[97-98]；或者降低Cas9-sgRNA復合體的濃度或者降低在細胞內(nèi)的活性時間；另外，通過突變Cas9的幾個位點，使得Cas9蛋白降低對非完全匹配序列的親和力[99]。雖然這些策略在一定程度上大大提高了特異性，但通常以降低效率為代價。不僅如此，如果將來用于醫(yī)療領域，任何一點點的脫靶都可能帶來意想不到的后果[100]。

效率：另一個主要的挑戰(zhàn)是提高精確切割的效率，雖然目前已經(jīng)有不少基于實驗和生物信息學分析得到的不同sgRNA的效率，但是仍然沒有找到非常明確的規(guī)律[101]。另外，為了進行精確的基因組編輯，需要提高同源重組修復的效率，且同時要降低NHEJ引發(fā)的錯誤修復。為了實現(xiàn)這個目的，科學家開發(fā)出了一些調(diào)節(jié)HDR與NHEJ比率的策略，包括添加調(diào)節(jié)DNA修復的小分子物質(zhì)，同步細胞周期，或優(yōu)化轉(zhuǎn)染時間和方法等[102-104]。但是，HDR的效率相對來說仍然較低，而且不同細胞株系間差異非常大，提高HDR效率仍有很大的空間。

時空控制：如果嚴謹?shù)卣{(diào)控Cas9的表達和活性很可能可以降低Cas9的脫靶效應，這也是將來應用于臨床的前提條件。可以通過轉(zhuǎn)錄時或轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，結(jié)合化學或光誘導系統(tǒng)來精確控制Cas9的表達與活性[105]。在轉(zhuǎn)錄水平，可以通過強力霉素誘導的啟動子在細胞或小鼠中，控制Cas9或nCas9的表達，雖然這些啟動子在許多類型的細胞中存在滲漏表達的情況[106]。在轉(zhuǎn)錄后的水平，Davis等構(gòu)建了內(nèi)含肽-Cas9融合蛋白，在滲透性的配體存在下融合蛋白可以產(chǎn)出有活性的Cas9[107]。這個系統(tǒng)中，化學響應的內(nèi)含肽插入到Cas9中來干擾活性。除了化學添加，通過光進行調(diào)節(jié)Cas9的活性，不僅可以實現(xiàn)快速調(diào)節(jié)，而且可以即時開啟和關閉Cas9的活性。這個光誘導系統(tǒng)的實現(xiàn)得益于Cas9結(jié)構(gòu)中的兩個部分(DNA識別區(qū)和內(nèi)切酶活性區(qū)) 可以將它們分開，然后分別融合pMag和nMag，在470 nm藍光的誘導下，Cas9蛋白的兩個部分重新結(jié)合，從而又發(fā)揮Cas9的活性，一旦移除光，Cas9的兩個部分分開而失去活性[108]。

目前，時空控制的這些還是探索性階段，還有很多發(fā)展空間。另外，除了Cas9蛋白的控制，sgRNA也需要調(diào)節(jié)和控制。

3.2 其他基因組編輯酶

由于CRISPR/Cas系統(tǒng)的簡便高效，才發(fā)展起來的ZFN和TALEN技術似乎正逐漸被淘汰。當然，還有一些科學家，也在尋找不同于CRISRP系統(tǒng)的新型基因組編輯技術。

最近，韓春雨團隊發(fā)現(xiàn)了來源于格氏嗜鹽堿桿菌的Argonaute蛋白可以利用磷酸化的ssDNA引導切割特定的雙鏈DNA，并且能在哺乳動物細胞中發(fā)揮活性，從而與CRISPR一樣，可以進行基因組編輯操作[109]。從已發(fā)表的結(jié)果來看，在一些方面可能比Cas9更有優(yōu)勢。比如，不需要PAM序列，24 nt的靶向序列，突變3個堿基就無法切割，這可能比Cas9的脫靶效應更低(由于很多情況下Cas9配對17 nt仍能切割)。然而，該技術目前正面臨著是否可以被重復的困擾。

南京大學團隊，最近開發(fā)了一種由結(jié)構(gòu)引導的內(nèi)切酶FEN1 (Flap endonuclease-1) 基因組編輯系統(tǒng)[110]。FEN1由識別3′flap結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域FokⅠ融合而成。向?qū)NA (gDNA) 與靶標序列形成的3′flap結(jié)構(gòu)，從而引導特異性的切割。這種方法的優(yōu)點在于不受序列的限制。

隨著研究的不斷進步，相信還會有越來越多的新技術被不斷開發(fā)出來。當然，這些新技術能不能替代CRISPR技術在基因組編輯方面的應用，還需要更多的檢驗。

3.3 高通量基因組工程

高通量基因組工程的策略與“自下而上”的從頭合成相反，其通過對宿主原有的基因組進行大規(guī)模改造來實現(xiàn)目的。比如，近期在大腸桿菌中開發(fā)了多重自動基因組改造MAGE (Multiplex automated genome engineering)[111]，“coselection” MAGE (CoS-MAGE)[112]和接合組裝基因組工程CAGE (Conjugative assembly genome engineering)[113]等，都屬于基因組規(guī)模的快速靶向工程化改造技術。MAGE方法利用短的合成的單鏈DNA寡核苷酸文庫，靶向到基因組中[111]。MAGE的方法對于改變小于4 bp的大腸桿菌DNA序列非常有效，但是對于超過20 bp的突變效率則非常低(<2%)。CoS-MAGE用了一個共篩選標記，增加了寡核苷酸加入的效率[112]。CAGE的方法可以在不影響大腸桿菌生長狀態(tài)的情況下，將其密碼子序列替換。通過大規(guī)模將TAG終止密碼子替換成TAA，可以將TAG這個密碼子引入非天然的氨基酸[113]。

除了TAG終止密碼子的替換，用MAGE、CAGE和CoS-MAGE方法也可以取代編碼基因中的密碼子。例如，Church團隊成功地去除了大腸桿菌中42個高表達必需基因中的13個稀有密碼子，證明了在全基因組范圍內(nèi)利用該方法替換編碼基因的密碼子是可行的[114]。除了大腸桿菌的高通量基因組工程，在真核細胞釀酒酵母中也用了MAGE類似的方法，稱為YOGE (Yeast oligo-mediated genome engineering)[115]。

4 總結(jié)與展望

合成生物學經(jīng)過十多年的發(fā)展，我們看到了很多突破性進展。綜上，合成生物學仍然處于初期階段，這個類似于20世紀60年代的計算機科學，可能到很多年以后，人們才能體會到合成生物學對人類生活的巨大改變作用。

在合成生物學建立初期，它的一個特點是標準化。標準化的好處在于：1) 便于提取與應用生物學元件；2) 便于定性、定量檢測元件的活力/功能；3) 便于開發(fā)與簡化工程化應用[116]。就像組裝計算機一樣，每個元件都是標準化的生產(chǎn)、開發(fā)。例如，Zhao等近期就標準化在天然產(chǎn)物合成生物學中的重要性進行了綜述[117]。在這種背景下，標準化的拼接技術也孕育而生[10]。除了前文介紹應用較廣的BioBrick等，其他標準化拼接方法的建立，如MoClo (Modular cloning)系統(tǒng)[118]、GoldenBraid[17]、MODAL (Modular overlap-directed assembly with linkers)[119]和PaperClip[120]等，其目的都是方便或簡化組裝流程，并幫助不同研究組間交換模塊化的DNA片段。但是，隨著更簡便拼接技術的發(fā)展，以及從頭合成DNA價格的逐漸下降，傳統(tǒng)的標準化拼接方法，比如BioBrick等應用率正逐步下降。Endy等在2013年調(diào)查了合成生物學中使能技術應用情況，在拼接技術應用上，過去應用較多的是BioBrick、BglBrick和Gateway等標準化的拼接方法，而近期Gibson拼接和從頭合成已經(jīng)趕超[121]。相信就今后的發(fā)展趨勢來說，從頭合成DNA將占據(jù)更重要的地位，可能就如同工程學中如今興起的3D打印技術。

CRISPR技術在2012年鑒定了Cas9的體外切割特性[74-75]。近幾年，已經(jīng)得到了廣泛應用，并且已有用于臨床實驗的計劃。在原核生物，Cas9和同源重組的結(jié)合應用，提高了傳統(tǒng)的基因敲除、替換和插入等的效率[122]，甚至是100 kb以上大片段替換[123]。除了用于基因組編輯，Cas9也被改造成能識別并結(jié)合特定DNA序列但失去切割活性的dCas9 (dead Cas9)，經(jīng)過融合特定功能的蛋白，可用于DNA定位[124]、基因調(diào)控[125-126]和特異位點修飾等[92,127-128]。

合成生物學將對化學品的生產(chǎn)、人類的健康和環(huán)境等領域具有廣闊的前景。而合成生物學的使能技術的發(fā)展，必將加速合成生物學的發(fā)展。

[1] Cameron DE, Bashor CJ, Collins JJ. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol, 2014, 12(5): 381–390.

[2] Gardner TS, Cantor CR, Collins JJ. Construction of a genetic toggle switch in. Nature, 2000, 403(6767): 339–342.

[3] Elowitz MB, Leibler S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature, 2000, 403(6767): 335–338.

[4] Gibson DG, Glass JI, Lartigue C, et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science, 2010, 329(5987): 52–56.

[5] Khalil AS, Collins JJ. Synthetic biology: applications come of age. Nat Rev Genet, 2010, 11(5): 367–379.

[6] Andrianantoandro E, Basu S, Karig DK, et al. Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline. Mol Syst Biol, 2006, 2(1): 2006.0028.

[7] Kelwick R, MacDonald JT, Webb AJ, et al. Developments in the tools and methodologies of synthetic biology. Front Bioeng Biotechnol, 2014, 2: 60.

[8] Cohen SN, Chang ACY, Boyer HW, et al. Construction of biologically functional bacterial plasmids. Proc Natl Acad Sci USA, 1973, 70(11): 3240–3244.

[9] Lobban PE, Kaiser AD. Enzymatic end-to end joining of DNA molecules. J Mol Biol, 1973, 78(3): 453–471.

[10] Casini A, Storch M, Baldwin GS, et al. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol, 2015, 16(9): 568–576.

[11] Ellis T, Adie T, Baldwin GS. DNA assembly for synthetic biology: from parts to pathways and beyond. Integr Biol (Camb), 2011, 3(2): 109–118.

[12] Knight T. Idempotent vector design for standard assembly of biobricks. Massachusetts: MIT Synthetic Biology Working Group, 2003: 1–11.

[13] Anderson JC, Dueber JE, Leguia M, et al. BglBricks: a flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng, 2010, 4: 1.

[14] Liu JK, Chen WH, Ren SX, et al. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS ONE, 2014, 9(10): e110852.

[15] Li SY, Zhao GP, Wang J. C-Brick: a new standard for assembly of biological parts using Cpf1. ACS Synth Biol, 2016, doi: 10.1021/acssynbio.6b00114.

[16] Engler C, Gruetzner R, Kandzia R, et al. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS ONE, 2009, 4(5): e5553.

[17] Sarrion-Perdigones A, Falconi EE, Zandalinas SI, et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS ONE, 2011, 6(7): e21622.

[18] Chen WH, Qin ZJ, Wang J, et al. The MASTER (methylation-assisted tailorable ends rational) ligation method for seamless DNA assembly. Nucleic Acids Res, 2013, 41(8): e93.

[19] Hartley JL, Temple GF, Brasch MA. DNA cloning usingsite-specific recombination. Genome Res, 2000, 10(11): 1788–175.

[20] Marsischky G, LaBaer J. Many paths to many clones: a comparative look at high-throughput cloning methods. Genome Res, 2004, 14(10b): 2020–2028.

[21] Alberti S, Gitler AD, Lindquist S. A suite of Gateway?cloning vectors for high-throughput genetic analysis in. Yeast, 2007, 24(10): 913–919.

[22] Sasaki Y, Sone T, Yoshida S, et al. Evidence for high specificity and efficiency of multiple recombination signals in mixed DNA cloning by the multisite gateway system. J Biotechnol, 2004, 107(3): 233–243.

[23] Gibson DG, Young L, Chuang RY, et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods, 2009, 6(5): 343–345.

[24] Li MZ, Elledge SJ. Harnessing homologous recombinationto generate recombinant DNASLIC. Nat Methods, 2007, 4(3): 251–256.

[25] Quan JY, Tian JD, Ho PL. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways. PLoS ONE, 2009, 4(7): e6441.

[26] Zhang YW, Werling U, Edelmann W. SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method. Nucleic Acids Res, 2012, 40(8): e55.

[27] Itaya M, Fujita K, Kuroki A, et al. Bottom-up genome assembly using thegenome vector. Nat Methods, 2008, 5(1): 41–43.

[28] Gibson DG, Benders GA, Andrews-Pfannkoch C, et al. Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of agenome. Science, 2008, 319(5867): 1215–1220.

[29] Gibson DG, Benders GA, Axelrod KC, et al. One-step assembly in yeast of 25 overlapping DNA fragments to form a complete syntheticgenome. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(51): 20404–20409.

[30] Zhou JT, Wu RH, Xue XL, et al. CasHRA (9-facilitatedomologousecombinationssembly) method of constructing megabase-sized DNA. Nucleic Acids Res, 2016, 44(14): e124.

[31] Kosuri S, Church GM. Large-scaleDNA synthesis: technologies and applications. Nat Methods, 2014, 11(5): 499–507.

[32] Roy S, Caruthers M. Synthesis of DNA/RNA and their analogsphosphoramidite and H-phosphonate chemistries. Molecules, 2013, 18(11): 14268–14284.

[33] Michelson AM, Todd AR. Nucleotides part XXXII. Synthesis of a dithymidine dinucleotide containing a 3′: 5′-internucleotidic linkage. J Chem Soc, 1955: 2632–2638.

[34] Beaucage SL, Caruthers MH. Deoxynucleoside phosphoramidites—a new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. Tetrahedron Lett, 1981, 22(20): 1859–1862.

[35] LeProust EM, Peck BJ, Spirin K, et al. Synthesis of high-quality libraries of long (150 mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process. Nucleic Acids Res, 2010, 38(8): 2522–2540.

[36] Binkowski BF, Richmond KE, Kaysen J, et al. Correcting errors in synthetic DNA through consensus shuffling. Nucleic Acids Res, 2005, 33(6): e55.

[37] Fodor SP, Read JL, Pirrung MC, et al. Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science, 1991, 251(4995): 767–773.

[38] Pease AC, Solas D, Sullivan EJ, et al. Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(11): 5022–5026.

[39] Gao XL, LeProust E, Zhang H, et al. A flexible light-directed DNA chip synthesis gated by deprotection using solution photogenerated acids. Nucleic Acids Res, 2001, 29(22): 4744–4750.

[40] Singh-Gasson S, Green RD, Yue YJ, et al. Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array. Nat Biotechnol, 1999, 17(10): 974–978.

[41] Saaem I, Ma KS, Marchi AN, et al.synthesis of DNA microarray on functionalized cyclic olefin copolymer substrate. ACS Appl Mater Interfaces, 2010, 2(2): 491–497.

[42] Hughes TR, Mao M, Jones AR, et al. Expression profiling using microarrays fabricated by an ink-jet oligonucleotide synthesizer. Nat Biotechnol, 2001, 19(4): 342–347.

[43] Ghindilis AL, Smith MW, Schwarzkopf KR, et al. CombiMatrix oligonucleotide arrays: genotyping and gene expression assays employing electrochemical detection. Biosens Bioelectron, 2007, 22(9/10): 1853–1860.

[44] Khorana HG. Total synthesis of the gene for an alanine transfer ribonucleic acid from yeast. Pure Appl Chem, 1971, 25(1): 91–118.

[45] Sekiya T, Takeya T, Brown EL, et al. Total synthesis of a tyrosine suppressor transfer RNA gene. XVI. Enzymatic joinings to form the total 207-base pair-long DNA. The J Biol Chem, 1979, 254(13): 5787–5801.

[46] Au LC, Yang FY, Yang WJ, et al. Gene synthesis by a LCR-based approach: high-level production of leptin-L54 using synthetic gene in. Biochem Biophysl Res Commun, 1998, 248(1): 200–203.

[47] Smith HO, Hutchison III CA, Pfannkoch C, et al. Generating a synthetic genome by whole genome assembly: φX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(26): 15440–15445.

[48] Stemmer WPC, Crameri A, Ha KD, et al. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene, 1995, 164(1): 49–53.

[49] Tian JD, Gong H, Sheng NJ, et al. Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips. Nature, 2004, 432(7020): 1050–1054.

[50] Borovkov AY, Loskutov AV, Robida MD, et al. High-quality gene assembly directly from unpurified mixtures of microarray-synthesized oligonucleotides. Nucleic Acids Res, 2010, 38(19): e180.

[51] Kosuri S, Eroshenko N, LeProust EM, et al. Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips. Nat Biotechnol, 2010, 28(12): 1295–1299.

[52] Quan JY, Saaem I, Tang N, et al. Parallel on-chip gene synthesis and application to optimization of protein expression. Nat Biotechnol, 2011, 29(5): 449–452.

[53] Allert M, Cox JC, Hellinga HW. Multifactorial determinants of protein expression in prokaryotic open reading frames. J Mol Biol, 2010, 402(5): 905–918.

[54] Kim H, Han H, Shin D, et al. A fluorescence selection method for accurate large-gene synthesis. Chembiochem, 2010, 11(17): 2448–2452.

[55] Carr PA, Park JS, Lee YJ, et al. Protein-mediated error correction forDNA synthesis. Nucleic Acids Res, 2004, 32(20): e162.

[56] Fuhrmann M, Oertel W, Berthold P, et al. Removal of mismatched bases from synthetic genes by enzymatic mismatch cleavage. Nucleic Acids Res, 2005, 33(6): e58.

[57] Young L, Dong QH. Two-step total gene synthesis method. Nucleic Acids Res, 2004, 32(7): e59.

[58] Smith J, Modrich P. Removal of polymerase- produced mutant sequences from PCR products. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(13): 6847–6850.

[59] Matzas M, St?hler PF, Kefer N, et al. High-fidelity gene synthesis by retrieval of sequence-verified DNA identified using high-throughput pyrosequencing. Nat Biotechnol, 2010, 28(12): 1291–1294.

[60] Kim H, Han H, Ahn J, et al. “Shotgun DNA synthesis” for the high-throughput construction of large DNA molecules. Nucleic Acids Res, 2012, 40(18): e140.

[61] Schwartz JJ, Lee C, Shendure J. Accurate gene synthesis with tag-directed retrieval of sequence- verified DNA molecules. Nat Methods, 2012, 9(9): 913–915.

[62] West SC. Enzymes and molecular mechanisms of genetic recombination. Annu Rev Biochem, 1992, 61(1): 603–640.

[63] Sauer B, Henderson N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85(14): 5166–5170.

[64] Sadowski PD. The Flp recombinase of th 2-μm plasmid of. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1995, 51: 53–91.

[65] Thyagarajan B, Olivares EC, Hollis RP, et al. Site-specific genomic integration in mammalian cells mediated by phage φC31 integrase. Mol Cell Biol, 2001, 21(12): 3926–3934.

[66] Chevalier BS, Stoddard BL. Homing endonucleases: structural and functional insight into the catalysts of intron/intein mobility. Nucleic Acids Res, 2001, 29(18): 3757–3774.

[67] Paques F, Duchateau P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Curr Gene Ther, 2007, 7(1): 49–66.

[68] Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(3): 1156–1160.

[69] Kim HJ, Lee HJ, Kim H, et al. Targeted genome diting in human cells with zinc finger nucleases constructedmodular assembly. Genome Res, 2009, 19(7): 1279–1288.

[70] Urnov FD, Rebar EJ, Holmes MC, et al. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet, 2010, 11(9): 636–646.

[71] Christian M, Cermak T, Doyle EL, et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics, 2010, 186(2): 757–761.

[72] Miller JC, Tan SY, Qiao GJ, et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol, 2011, 29(2): 143–148.

[73] Ran FA, Hsu PD, Wright J, et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc, 2013, 8(11): 2281–2308.

[74] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 2012, 337(6096): 816–821.

[75] Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, et al. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(39): E2579–E2586.

[76] Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell, 2015, 163(3): 759–771.

[77] Kim D, Kim J, Hur JK, et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nat Biotechnol, 2016, 34(8): 863–868.

[78] Kleinstiver BP, Tsai SQ, Prew MS, et al. Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells. Nat Biotechnol, 2016, 34(8): 869–874.

[79] Garneau JE, Dupuis Mè, Villion M, et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature, 2010, 468(7320): 67–71.

[80] Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell, 2014, 157(6): 1262–1278.

[81] Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, et al. CRISPR RNA maturation by-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature, 2011, 471(7340): 602–607.

[82] Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, et al. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology, 2005, 151(8): 2551–2561.

[83] Nishimasu H, Ran FA, Hsu PD, et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell, 2014, 156(5): 935–949.

[84] Jiang FG, Zhou KH, Ma LL, et al. Structural biology. A Cas9-guide RNA complex preorganized for target DNA recognition. Science, 2015, 348(6242): 1477–1481.

[85] Mulepati S, Héroux A, Bailey S. Structural biology. Crystal structure of a CRISPR RNA-guided surveillance complex bound to a ssDNA target. Science, 2014, 345(6203): 1479–1484.

[86] Dang Y, Jia GX, Choi J, et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biol, 2015, 16: 280.

[87] Symington LS, Gautier J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annu Rev Genet, 2011, 45(1): 247–271.

[88] Lu XJ, Xue HY, Ke ZP, et al. CRISPR-Cas9: a new and promising player in gene therapy. J Med Genet, 2015, 52(5): 289–296.

[89] Blasco RB, Karaca E, Ambrogio C, et al. Simple and rapidgeneration of chromosomal rearrangements using CRISPR/Cas9 technology. Cell Rep, 2014, 9(4): 1219–1227.

[90] Schunder E, Rydzewski K, Grunow R, et al. First indication for a functional CRISPR/Cas system in. Int J Med Microbiol, 2013, 303(2): 51–60.

[91] Fonfara I, Richter H, Bratovi? M, et al. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature, 2016, 532(7600): 517–521.

[92] Wang HF, La Russa M, Qi LS. CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond. Annu Rev Biochem, 2016, 85(1): 227–264.

[93] Fu YF, Foden JA, Khayter C, et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol, 2013, 31(9): 822–826.

[94] Pattanayak V, Lin S, Guilinger JP, et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol, 2013, 31(9): 839–843.

[95] Ran FA, Hsu PD, Lin CY, et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell, 2013, 154(6): 1380–1389.

[96] Tsai SQ, Wyvekens N, Khayter C, et al. Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. Nat Biotechnol, 2014, 32(6): 569–576.

[97] Fu YF, Sander JD, Reyon D, et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol, 2014, 32(3): 279–284.

[98] Cho SW, Kim S, Kim Y, et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA- guided endonucleases and nickases. Genome Res, 2014, 24(1): 132–141.

[99] Kleinstiver BP, Pattanayak V, Prew MS, et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature, 2016, 529(7587): 490–495.

[100] Tsai SQ, Joung JK. Defining and improving the genome-wide specificities of CRISPR-Cas9 nucleases. Nat Rev Genet, 2016, 17(5): 300–312.

[101] Moreno-Mateos MA, Vejnar CE, Beaudoin JD, et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting. Nat Methods, 2015, 12(10): 982–988.

[102] Chu VT, Weber T, Wefers B, et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol, 2015, 33(5): 543548.

[103] Maruyama T, Dougan SK, Truttmann MC, et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nat Biotechnol, 2015, 33(5): 538–542.

[104] Lin S, Staahl BT, Alla RK, et al. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife, 2014, 3: e04766.

[105] Nu?ez JK, Harrington LB, Doudna JA. Chemical and biophysical modulation of Cas9 for tunable genome engineering. ACS Chem Biol, 2016, 11(3): 681–688.

[106] Zetsche B, Volz SE, Zhang F. A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation. Nat Biotechnol, 2015, 33(2): 139–142.

[107] Truong DJJ, Kühner K, Kühn R, et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res, 2015, 43(13): 6450–6458.

[108] Nihongaki Y, Kawano F, Nakajima T, et al. Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing. Nat Biotechnol, 2015, 33(7): 755–760.

[109] Gao F, Shen XZ, Jiang F, et al. DNA-guided genome editing using theargonaute. Nat Biotechnol, 2016, 34(7): 768–773.

[110] Xu S, Cao S, Zou B, et al. An alternative novel tool for DNA editing without target sequence limitation: the structure-guided nuclease. Genome Biol, 2016, 17: 186.

[111] Wang HH, Isaacs FJ, Carr PA, et al. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution. Nature, 2009, 460(7257): 894–898.

[112] Wang HH, Kim H, Cong L, et al. Genome-scale promoter engineering by coselection MAGE. Nat Methods, 2012, 9(6): 591–593.

[113] Isaacs FJ, Carr PA, Wang HH, et al. Precise manipulation of chromosomesenables genome-wide codon replacement. Science, 2011, 333(6040): 348–353.

[114] Lajoie MJ, Kosuri S, Mosberg JA, et al. Probing the limits of genetic recoding in essential genes. Science, 2013, 342(6156): 361–363.

[115] DiCarlo JE, Conley AJ, Penttil? M, et al. Yeast oligo-mediated genome engineering (YOGE). ACS Synth Biol, 2013, 2(12): 741–749.

[116] Canton B, Labno A, Endy D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol, 2008, 26(7): 787–793.

[117] Zhao HM, Medema MH. Standardization for natural product synthetic biology. Nat Prod Rep, 2016, 33(8): 920–924.

[118] Weber E, Engler C, Gruetzner R, et al. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE, 2011, 6(2): e16765.

[119] Casini A, MacDonald JT, De Jonghe J, et al. One-pot DNA construction for synthetic biology: the modular overlap-directed assembly with linkers (MODAL) strategy. Nucleic Acids Res, 2014, 42(1): e7.

[120] Trubitsyna M, Michlewski G, Cai YZ, et al. PaperClip: rapid multi-part DNA assembly from existing libraries. Nucleic Acids Res, 2014, 42(20): e154.

[121] Kahl LJ, Endy D. A survey of enabling technologies in synthetic biology. J Biol Eng, 2013, 7: 13.

[122] Choi KR, Lee SY. CRISPR technologies for bacterial systems: current achievements and future directions. Biotechnol Adv, 2016, 34(7): 1180–1209.

[123] Wang KH, Fredens J, Brunner SF, et al. Defining synonymous codon compression schemes by genome recoding. Nature, 2016, 539(7627): 59–64.

[124] Chen BH, Gilbert LA, Cimini BA, et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell, 2013, 155(7): 1479–1491.

[125] Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell, 2013, 154(2): 442–451.

[126] Gilbert LA, Horlbeck MA, Adamson B, et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell, 2014, 159(3): 647–661.

[127] Sternberg SH, Doudna JA. Expanding the biologist's toolkit with CRISPR-Cas9. Mol Cell, 2015, 58(4): 568–574.

[128] Wright AV, Nu?ez JK, Doudna JA. Biology and applications of CRISPR systems: harnessing nature's toolbox for genome engineering. Cell, 2016, 164(1/2): 29–44.

(本文責編 陳宏宇)

趙國屏 中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態(tài)研究所研究員，博士生導師，中國科學院院士。主持過若干微生物基因組和功能基因組研究，完成對重要致病菌——問號鉤端螺旋體的全基因組測序和注釋，鑒定過若干關鍵代謝途徑和基因功能，為深入研究致病機理提供新的思路。同時，完成了SARS分子流行病學和SARS冠狀病毒進化研究，為認識該病毒的動物源性及其從動物間傳播到人間傳播過程中基因組、特別是關鍵基因的變異規(guī)律奠定了基礎。目前，主要聚焦于合成生物學研究方向，曾主持合成生物學973項目“新功能人造生物器件的構(gòu)建及集成”。

王金 中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態(tài)研究所副研究員，碩士生導師。主要研究方向是放線菌氮代謝調(diào)控的分子機制以及合成生物學使能技術的開發(fā)。在代謝調(diào)控方面，系統(tǒng)鑒定了放線菌氮代謝全局調(diào)控蛋白GlnR的調(diào)控網(wǎng)絡，并初步闡釋了“硝酸鹽效應”的分子機制——硝酸鹽同時增強利福霉素生物合成基因簇的表達和促進其前體的大量供給，從而大幅度提高利福霉素的產(chǎn)量。在合成生物學使能技術方面，成功開發(fā)了多項DNA體外拼接技術和拼接標準。

Enabling technologies in synthetic biology——DNA synthesis, assembly and editing

Shiyuan Li1,2, Guoping Zhao1, and Jin Wang1

1 Key Laboratory of Synthetic Biology, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Synthetic biology is an emerging discipline, which aims at creating artificial lives or remolding the present organisms to generate new features. To achieve these goals, synthetic biologists need to design and synthesize new genes, pathways, modules or even whole genomes. As these enabling technologies (gene synthesis, DNA assembly and genome editing) are very important for the progress of synthetic biology, we will focus on the development of these technologies in this review.

synthetic biology, enabling technology, DNA assembly, gene synthesis, genome editing

November 1, 2016; Accepted:December 8, 2016

Jin Wang. Tel: +86-21-54971125; Fax: +86-21-54971127; E-mail: jinwang@sibs.ac.cn

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB721102), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31421061, 31430004, 31300031), the Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences (No. XDB19040200).

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃) (No. 2012CB721102)，國家自然科學基金(Nos. 31421061, 31430004, 31300031)，中國科學院戰(zhàn)略性先導科技專項(No. XDB19040200) 資助。

2016-12-27

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20161227.1439.002.html