羅周卿，戴俊彪

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合成基因組學(xué)：設(shè)計(jì)與合成的藝術(shù)

羅周卿，戴俊彪

清華大學(xué)合成與系統(tǒng)生物學(xué)中心生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084

羅周卿, 戴俊彪. 合成基因組學(xué)：設(shè)計(jì)與合成的藝術(shù). 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(3): 331–342.Luo ZQ, Dai JB.Synthetic genomics: the art of design and synthesis. Chin J Biotech, 2017, 33(3): 331–342.

隨著基因組相關(guān)技術(shù) (測序、編輯、合成等) 和知識 (功能基因組學(xué)) 的日益成熟，合成基因組學(xué)在本世紀(jì)迎得了發(fā)展的契機(jī)。病毒、原核生物的全基因組相繼被化學(xué)合成并支持生命的存活，第1個(gè)真核生物合成基因組計(jì)劃已經(jīng)完成過半，人類基因組編寫計(jì)劃提上日程。在基因組合成的實(shí)踐過程中，研究者們不斷探索對基因組進(jìn)行重編和設(shè)計(jì)所應(yīng)遵循的規(guī)則，提高從頭合成、組裝和替換基因組的技術(shù)手段。合成基因組在工業(yè)、環(huán)境、健康和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，同時(shí)也帶來了相應(yīng)的倫理問題。結(jié)合在Sc2.0計(jì)劃中的基因組合成研究和近期合成基因組學(xué)所取得的重大進(jìn)展，本文綜述了基因組設(shè)計(jì)和合成相關(guān)的科學(xué)、技術(shù)和倫理內(nèi)容，并探討了未來發(fā)展所面對的挑戰(zhàn)。作為合成生物學(xué)最重要的領(lǐng)域之一，合成基因組學(xué)方興未艾。

合成基因組學(xué)，基因組重新設(shè)計(jì)，DNA合成，DNA組裝與替換

“基因組”這一概念最早于1920年由H. Winkler提出，用來代表一個(gè)生物體所包含的整套遺傳物質(zhì)。近十年來由于二代和三代測序技術(shù)的發(fā)展使得測序的速度、精度和深度都有了巨大的提高，成本也發(fā)生了顯著的下降，越來越多物種的基因組被測序。TALEN以及CRISPR/Cas系統(tǒng)的成功應(yīng)用極大地提高了對基因組特定位點(diǎn)的編輯能力，基因組的功能逐步被解析。隨著基因組閱讀能力 (測序) 和修改能力 (基因組編輯) 的提升，人類對基因組的認(rèn)識達(dá)到了一個(gè)前所未有的高度。研究者們開始探索：我們能否根據(jù)已有的認(rèn)知全方位改造一個(gè)基因組，甚至從頭設(shè)計(jì)與合成一個(gè)嶄新的基因組？DNA合成和組裝技術(shù)的發(fā)展，特別是基于芯片的 DNA 合成技術(shù)的成功應(yīng)用，極大降低了DNA的合成成本并同時(shí)提高了通量，使得“編寫” (化學(xué)從頭合成) 一個(gè)基因組成為可能。合成基因組學(xué)作為一個(gè)匯集DNA閱讀、修改和編寫等各方面技術(shù)的新學(xué)科領(lǐng)域呈現(xiàn)在人們的面前。

本綜述將針對合成基因組學(xué)所取得的進(jìn)展，介紹合成基因組學(xué)相關(guān)的設(shè)計(jì)理念與技術(shù)手段。與此同時(shí)，合成基因組學(xué)的后期應(yīng)用以及倫理問題也將在本綜述中進(jìn)行討論。

1 合成基因組學(xué)

合成基因組學(xué)，指的是通過一系列的技術(shù)手段從頭化學(xué)全合成整個(gè)基因組或者是基因組的大部分。它的出現(xiàn)使得同時(shí)改變一個(gè)生物的遺傳物質(zhì)的多個(gè)方面成為可能，從而成為合成生物學(xué)領(lǐng)域中對生物體復(fù)雜功能體系和全新生物體進(jìn)行合成的重要方面[1]。

為什么要合成一個(gè)基因組？除了對創(chuàng)造一個(gè)嶄新生命的原始好奇心，還包括了其他許多更加切合實(shí)際的目的。首先，盡管最近基因編輯領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)展足以令人稱奇，但是仍然需要較長的時(shí)間來進(jìn)行一項(xiàng)基因組水平的改變，比如說從大腸桿菌的基因組中去除一個(gè)密碼子[2-3]。而合成基因組學(xué)為這類問題提供了另外一種解決方案。并且，通過合成基因組學(xué)的相關(guān)研究還可以開發(fā)和完善相關(guān)的基因組編輯技術(shù)，從而實(shí)現(xiàn)良性循環(huán)。其次，通過對合成基因組的設(shè)計(jì)、合成和檢測，可以對一些之前無法或者很難很好地研究的問題提供答案。比如說，占據(jù)了人類基因組超過50%的重復(fù)序列到底有沒有功能？如果有，是什么？再次，我們對基因組的已有認(rèn)知指導(dǎo)了我們現(xiàn)階段的合成基因組學(xué)實(shí)踐。反過來，通過合成基因組的過程和對合成的基因組的研究，將有助于進(jìn)一步加深我們對基因組功能的理解 (Built to understand)。最后，在人類基因組計(jì)劃初期，人們對于是否值得花費(fèi)如此多的人力、物力和財(cái)力去進(jìn)行人類基因組測序有著廣泛的分歧[4]。而目前合成基因組學(xué)也處在這么一個(gè)類似的時(shí)期，我們并不清楚它最后具體能給我們帶來什么，但是至少目前的展望不亞于當(dāng)年的人類基因組計(jì)劃。

2 合成基因組學(xué)發(fā)展簡史

從寡核苷酸鏈的化學(xué)合成開始，第一個(gè)人工合成的基因——丙氨酸t(yī)RNA編碼基因 (77 bp)，于1970年被Khorana組成功合成[5]。2002年，第一個(gè)合成基因組——脊髓灰質(zhì)炎病毒 (Poliovirus) 基因組被成功合成并產(chǎn)生活的病毒顆粒[6]，證明了利用已有的基因組序列而不依賴于天然模板從頭化學(xué)合成基因組的可行性。2008年，自然界中已知的最小原核生物基因組—— 583 kb的生殖支原體 () 基因組被化學(xué)全合成[7]。Gibson等在2010年成功利用人工合成的，長達(dá)1.08 Mb的蕈狀支原體 () 基因組支持JCVI- syn1.0的存活，誕生了第一個(gè)由合成基因組控制的原核生物[8]。從2011年開始，來自世界上多個(gè)不同國家的研究者們在Boeke的帶領(lǐng)下開展了第一個(gè)真核生物基因組合成計(jì)劃 (Sc2.0)，目前已經(jīng)完成了2、3、5、6、10和12號染色體的合成與組裝[9-17]。就在Sc2.0進(jìn)行的過程中，Boeke于2016年提出了人類基因組編寫計(jì)劃 (HGP-Write)[18]，使合成基因組學(xué)成為大眾的焦點(diǎn) (圖1)。

圖1 合成基因組學(xué)大事記

3 合成基因組的設(shè)計(jì)

雖然現(xiàn)在我們可以很方便地進(jìn)行基因組的測序和編輯，但是我們對基因組的認(rèn)識還非常有限。以早期完成基因組測序的模式生物為例，中有大約20%的基因功能未知，釀酒酵母中有大約一半的基因功能未知[19-20]。根據(jù)對基因組的已有認(rèn)知、對一些基因和代謝通路的合成嘗試，人們探索出了一些基因組重編和設(shè)計(jì)的規(guī)則。顯而易見，這些規(guī)則目前還缺乏系統(tǒng)性。因此，目前合成基因組學(xué)主要進(jìn)行前期技術(shù)的儲備，對基因組重編的程度都比較小。2017年3月10日雜志發(fā)表了第1個(gè)專門為全基因組技術(shù)而編寫的軟件平臺——BioStudio，可以根據(jù)研究者的需要按照一定的原則進(jìn)行全基因范圍的重編[13]。相信隨著對生命現(xiàn)象了解的深入以及邊合成邊測試能力的不斷提高，這些原則將被更好地定義和理解，使得合成基因組學(xué)朝著更加可預(yù)測的方向發(fā)展。

3.1 對基因組編碼區(qū)域的重編和設(shè)計(jì)

生物體中的蛋白質(zhì)主要通過基因組的編碼區(qū)域進(jìn)行編碼。通過對基因編碼區(qū)域的重編和設(shè)計(jì)，可以改變蛋白的表達(dá)特性。編碼區(qū)域的重編和設(shè)計(jì)主要基于密碼子的簡并性進(jìn)行，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的綜合考慮不同的因素。這些因素包括密碼子的使用頻率 (Codon bias)[21]、密碼子上下游序列 (Codon context bias)[22]以及mRNA的二級和三級結(jié)構(gòu)等。首先，在不同的生物體中，同義密碼子的使用頻率通常并不相同。不同的密碼子頻率可以影響蛋白的翻譯速率，從而影響蛋白的表達(dá)。因此在合成基因的設(shè)計(jì)過程中通常會對其密碼子進(jìn)行優(yōu)化，尤其是在代謝工程領(lǐng)域，使其適應(yīng)新的表達(dá)環(huán)境。常用的密碼子偏好性計(jì)算方法包括以及等[23-26]。其次，密碼子上下游序列環(huán)境在基因的翻譯效率調(diào)控中也扮演了重要的角色。由于細(xì)胞中的tRNA使用完后可以重新加載氨基酸再用于同一mRNA的翻譯 (Codon reuse)，在同一個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄本的某一區(qū)域通常傾向于使用同一密碼子編碼某一種氨基酸，以便提高翻譯效率。再次，編碼區(qū)域的重編將有可能改變mRNA的二級和三級結(jié)構(gòu)，從而影響mRNA的穩(wěn)定性以及翻譯效率?；跓崃W(xué)參數(shù)和最小自由能，許多算法被開發(fā)出來用于計(jì)算RNA的結(jié)構(gòu)，包括UNAFold和ViennaRNA等[27-28]。此外，限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)在DNA的分子操作過程中發(fā)揮了重要的作用。通過同義重編，可以移除或者是引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)便于后續(xù)的研究操作。其他如序列的GC含量和隱藏的終止密碼子等也是重編過程中要考慮的因素。針對這些因素和不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模S多軟件被開發(fā)出來用于編碼區(qū)域的重編，包括Synthetic Gene Developer、Gene Designer 2.0和Codon Optimization OnLine (COOL) 等[29-31]。目前這些軟件都只考慮這些因素中的一種或者幾種?？紤]的因素越多，對計(jì)算能力的要求越大。如何定量預(yù)測密碼子同義替換對蛋白翻譯的影響將是這一領(lǐng)域未來的發(fā)展方向之一。

在最早合成的脊髓灰質(zhì)炎病毒 (Poliovirus) 基因組中，研究者們通過改變總共20個(gè)核苷酸序列引入了13個(gè)新的酶切位點(diǎn)，去除了一個(gè)I酶切位點(diǎn)[6]。在Sc2.0項(xiàng)目中，為了區(qū)別合成的和野生型的序列，根據(jù)同義密碼子原則我們引入了一系列的PCR標(biāo)簽，把TAG終止密碼子替換成TAA，并且引入或剔除某些酶切位點(diǎn)[9]。通過替換野生型序列和表型測試，我們發(fā)現(xiàn)一些基因的同義替換會對其表達(dá)和功能造成重要的影響[12,14-15,17]。通過同義密碼子替換，Church組希望能夠構(gòu)建出一個(gè)只含有57個(gè)密碼子的合成大腸桿菌。通過初期的功能測試，他們發(fā)現(xiàn)2 229個(gè)基因中有13個(gè)基因的重編不能支持大腸桿菌的存活[32]。由這些實(shí)踐可以看出目前并不能很好地預(yù)測重編帶來的影響，但是研究者們的這些嘗試將為成功預(yù)測重編帶來的影響提供大量的研究材料。

根據(jù)基因的功能進(jìn)行重編是合成基因組設(shè)計(jì)的另外一個(gè)方面。在合成的JCVI-1.0基因組中，基因被抗生素基因破壞，從而去除致病性，并且給合成的基因組提供了一個(gè)篩選標(biāo)記[7]。在Sc2.0計(jì)劃中，所有tRNA編碼基因都將被轉(zhuǎn)移到一條新的染色體上[9]。在合成12號染色體的過程中，我們發(fā)現(xiàn)tRNA拷貝數(shù)的下降會導(dǎo)致細(xì)胞周期在G2/M轉(zhuǎn)化過程中的延遲[17]。對于已有基因組序列的分析顯示：在進(jìn)化過程中具有類似功能或者表達(dá)的基因通常傾向于聚集在一起，而且基因的排序也不是隨機(jī)的[33-34]。利用合成基因組學(xué)的手段改變基因的排序?qū)檠芯窟@一問題提供新的材料。

基因的冗余性是基因組的特征之一，冗余基因的敲除通常不會帶來大的表型變化。除此之外，基因組中還有許多的非必需基因，這些基因的敲除將有助于簡化基因組。最小基因組的構(gòu)建將有助于優(yōu)化細(xì)胞對目的代謝途徑的物質(zhì)和能量投入。利用改造的Tn5轉(zhuǎn)座子，的基因組可以被減小200 kb[35]。通過設(shè)計(jì)、合成、表型測試的循環(huán)，Venter組在2016年成功將基因組從1.08 Mb縮小到531 kb。這一基因組比自然界中已知的任何基因組都要小。他們總共刪除了428個(gè)基因，在剩下的473個(gè)基因中仍然還有149個(gè)基因功能未知[36]。這一最小基因組將為研究基因組中的核心功能以及探索如何從頭合成一個(gè)有功能的基因組提供一個(gè)通用的平臺。

3.2 對基因組其他區(qū)域的重編和設(shè)計(jì)

相對于編碼區(qū)域，基因組其他區(qū)域的重編和設(shè)計(jì)目前還處于比較初級的狀態(tài)。在合成的基因組中，一些“watermark”被插入到基因組中的基因間區(qū)。為了減少對基因組生物功能的可能影響，他們選擇了一些耐受轉(zhuǎn)座子插入的位置作為插入位點(diǎn)[7]。類似的策略也被用于合成基因組的設(shè)計(jì)[8]。在Sc2.0計(jì)劃中，基因組內(nèi)所有的轉(zhuǎn)座子、長末端重復(fù)序列和亞端粒末端重復(fù)序列都被刪去，以期能獲得更加穩(wěn)定的基因組和探索這些元件在進(jìn)化上對于基因組的意義[9]。

基因組的非編碼區(qū)域有很大一部分是基因的啟動(dòng)子和終止子。通過對這些元件的描述 (Characterization) 和模塊化 (Modularization)，使其擁有更加可控的輸出和適配性能，一直是代謝工程和合成生物學(xué)的一個(gè)重要方面。目前在合成基因組學(xué)領(lǐng)域并沒有相關(guān)的研究報(bào)道這部分內(nèi)容的重編與設(shè)計(jì)。在Sc2.0計(jì)劃中，研究者們在每個(gè)非必需基因的3′末端引入了一個(gè)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了介導(dǎo)的合成染色體重組和修飾進(jìn)化系統(tǒng) (Synthetic chromosome recombination and modification by loxP-mediated evolution，簡稱SCRaMbLE)。通過SCRaMbLE將有可能改變這些基因的啟動(dòng)子和終止子，從而為研究它們的功能提供材料[9,37-38]。通過對12號染色體的染色體啟動(dòng)SCRaMbLE，我們發(fā)現(xiàn)的3′UTR對于其mRNA的穩(wěn)定性至關(guān)重要 (未發(fā)表數(shù)據(jù))。

近年來的一些研究逐步發(fā)現(xiàn)基因組的三維結(jié)構(gòu)對于基因組的功能和調(diào)控起著重要的作用。莊小威組成功利用高分辨成像技術(shù)觀測了染色體的高級結(jié)構(gòu)域，分辨率可達(dá)kbp到Mbp的水平[39-40]。如何將基因組的三維結(jié)構(gòu)和表觀遺傳狀態(tài)考慮到基因組的重編和設(shè)計(jì)中來，將是合成基因組學(xué)發(fā)展中的重要方向。鑒于目前的合成基因組都是建立在已有基因組的基礎(chǔ)上，我們期望能夠通過不斷的嘗試，找到一些普遍的規(guī)律，逐步增大重編的程度，最終完全從頭設(shè)計(jì)一個(gè)新的基因組。

4 基因組的合成、組裝與替換

DNA合成技術(shù)的進(jìn)展使得在較短的時(shí)間內(nèi)以可承受的價(jià)格獲得足量的DNA成為可能，這也促使了合成基因組學(xué)時(shí)代的真正到來。對于計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)好的基因組序列，如何快速合成、組裝并替換原有的野生型基因組，是合成基因組學(xué)在實(shí)踐過程中必須要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題。這一部分將結(jié)合已有的基因組合成實(shí)踐，介紹如何從化學(xué)合成的寡聚核苷酸鏈開始，到最后組裝成一個(gè)有功能的基因組 (圖2)。

圖2 化學(xué)從頭合成基因組

4.1 基因組DNA的從頭合成

目前在寡鏈核苷酸從頭合成中使用最多的是固相亞磷酰胺化學(xué)合成法。該法通過去保護(hù)、聯(lián)結(jié)、加帽和氧化四步反應(yīng)的循環(huán)在反應(yīng)柱中逐步合成寡核苷酸鏈[41]。由于化學(xué)反應(yīng)效率隨著寡核苷酸鏈的增長而降低，DNA合成的完整性、精確度和產(chǎn)量隨長度的增長而發(fā)生下降，合成的DNA長度一般不超過200 bp[42]。微陣列介導(dǎo)的DNA合成技術(shù)的出現(xiàn)極大降低了合成的成本，提高了通量。由于邊緣效應(yīng)、去嘌呤反應(yīng)等原因，微陣列合成的DNA相較于柱合成的DNA擁有較高的突變率。近年來，微陣列介導(dǎo)的DNA合成技術(shù)在合成的質(zhì)量、效率和自動(dòng)化程度上都有了顯著提高。通過對反應(yīng)過程的優(yōu)化，微陣列合成的寡鏈核苷酸現(xiàn)在也可以達(dá)到和柱合成類似的長度 (最長可達(dá)200 bp) 和精確度 (錯(cuò)誤率在1/600左右)[42-43]。將二代測序與芯片合成有機(jī)結(jié)合起來，利用二代測序鑒定并回收序列正確的DNA片段，成為提高合成精確度的一個(gè)有效手段[44]。

4.2 基因組DNA的組裝

化學(xué)合成的寡核苷酸鏈長度有限，并不能滿足基因和基因組合成的需求，需要進(jìn)一步組裝變成更長的DNA片段?，F(xiàn)有的體外酶促DNA拼接技術(shù)主要包括限制性內(nèi)切酶依賴的拼接技術(shù) (BioBrickstTM、BglBricks 和 Golden gate等) 和同源序列依賴的拼接技術(shù) (In-FusionTM、SLIC和Gibson恒溫組裝等)。Golden gate拼接利用Ⅱ型限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)在識別序列外部的特點(diǎn)，通過設(shè)計(jì)切割后的4 bp懸掛序列來實(shí)現(xiàn)DNA片段的無縫順序拼接[45]?；贕olden gate的原理，本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了YeastFab和EcoExpress兩個(gè)系統(tǒng)用于代謝工程的優(yōu)化和蛋白的表達(dá)，DNA拼接的效率可達(dá)90%以上[46-47]。Gibson assembly利用5′外切酶、DNA聚合酶和耐熱DNA連接酶的混合物實(shí)現(xiàn)DNA片段之間的無痕連接[48]。一步恒溫反應(yīng)減少了大片段DNA分子在操作過程中的斷裂風(fēng)險(xiǎn)，較高的連接溫度 (50 ℃) 也減少了二級結(jié)構(gòu)的形成。但是該方法酶的價(jià)格較高，限制了其大規(guī)模的應(yīng)用。

對于芯片合成的DNA，其復(fù)雜程度使得整個(gè)組裝過程更加具有挑戰(zhàn)性。利用核苷酸選擇性雜交的原則設(shè)計(jì)“block oligos”，可以將錯(cuò)誤的序列排除在最終的組裝序列之外[49-50]。在合成酵母12號染色體的過程中，我們通過引入“oligo block”可以成功地將5個(gè)左右的1.6 kb片段一次拼接成10 kb的片段[17]。其他的一些方法，比如寡核苷酸庫的選擇性擴(kuò)增、芯片分區(qū)和基于單鏈DNA缺口和鏈替換的原位基因合成，也被開發(fā)出來提高芯片合成DNA的組裝效率和準(zhǔn)確率[51-52]。錯(cuò)配剪切 (Mismatch-cleavage) 等手段也可用來進(jìn)一步降低最終組裝產(chǎn)物的錯(cuò)誤率。

宿主體內(nèi)的同源重組系統(tǒng)也可以用來進(jìn)行大片段DNA的組裝。Itaya等將3.5 Mb的PCC6803基因組通過迭代替換的方法克隆到了的基因組中，變成一個(gè)7.7 Mb的融合基因組[53]。的同源重組系統(tǒng)非常高效，可以同時(shí)組裝多個(gè)帶有重疊序列的DNA片段，是目前利用合成DNA片段組裝基因組的最佳選擇。Gibson等通過轉(zhuǎn)化輔助的重組技術(shù)可以將25個(gè)24 kb左右的DNA片段在酵母體內(nèi)一次性組裝成整個(gè)的基因組[54]。此外，酵母對外源DNA的承載能力很強(qiáng)，目前已報(bào)道的最大承載是 1.8 Mb的的基因組[55]，并且承載的上限并不清楚。需要注意的是，外源基因組中的毒性基因的表達(dá)會對酵母的存活產(chǎn)生較大的影響。比如說基因組中的一個(gè)內(nèi)切酶編碼基因必須被失活以使得其可以在酵母中克隆[56]。另外，酵母基因組中的復(fù)制起始位點(diǎn)通常擁有較低的GC含量，并且每隔大概150 kb就需要一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)以保證染色體的穩(wěn)定。2.7 Mb的基因組擁有55%的GC含量，在酵母體內(nèi)克隆大于200 kb的基因組片段需要插入酵母內(nèi)源的復(fù)制起始位點(diǎn)才能成功。

4.3 基因組DNA的移植和替換

將DNA組裝成較大的DNA片段甚至是全基因組后，需要用這些合成的序列替換掉原有的野生型序列，并保持原有細(xì)胞的存活。對于擁有小型基因組的病毒如Poliovirus，合成的基因組cDNA可通過RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄成病毒RNA，然后就可以體外在細(xì)胞提取液中進(jìn)行翻譯和復(fù)制，組裝成一個(gè)有功能的病毒顆粒[6]。對于基因組較大的原核生物和真核生物，基因組替換的過程要困難許多。對于在酵母中組裝完成的基因組 (和JCVI-syn3.0最小基因組)，可以通過原生質(zhì)體融合來實(shí)現(xiàn)酵母和其他生物間基因組的快速轉(zhuǎn)移，并同時(shí)減少機(jī)械剪切力對基因組DNA大片段的損傷[7-8,36]。而對于酵母自身基因組的合成，我們采用了基于同源重組的逐步替換的方法。每條酵母染色體被分為幾個(gè)到幾十個(gè)30 kb的片段 (Megachunk)，每個(gè)megachunk帶有一個(gè)營養(yǎng)缺陷型或者標(biāo)記基因。通過和的交互循環(huán)替代最終將整條染色體變成合成的序列。為了加快整條染色體替換的速度和及早發(fā)現(xiàn)存在于合成序列中的可能問題，我們組在合成酵母12號染色體的過程中建立了基于酵母減數(shù)分裂的快速組裝辦法 (Meiotic recombination based assembly，MRA)[17]。對于酵母以外的生物，直接依賴于自身的同源重組系統(tǒng)并不能夠滿足快速進(jìn)行基因組替換的需求?；讦?Red噬菌體單鏈DNA結(jié)合蛋白β的MAGE和CAGE的出現(xiàn)，使得快速多位點(diǎn)編輯的基因組成為可能[2,57]。CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)的出現(xiàn)，使得對高等生物細(xì)胞的編輯變得更加高效[58-60]。這些基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)將有助于在不同的生物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)像酵母一樣的原位合成基因組替換。

5 合成基因組的應(yīng)用與倫理

合成基因組學(xué)的發(fā)展不僅展示了人類在基因組水平合成生命系統(tǒng)的能力，同時(shí)在這過程中所發(fā)展的各種技術(shù)將從全新的角度，引領(lǐng)生命科學(xué)各領(lǐng)域的顛覆性創(chuàng)新。比如大片段DNA分子的組裝技術(shù)將有助于復(fù)雜代謝途徑的構(gòu)建和優(yōu)化，從而生產(chǎn)全新的藥物分子和生物能源物質(zhì)。又比如合成基因組的過程，通過重編、合成和表型測試的實(shí)踐提供了一個(gè)“自下而上”研究基因組中所有編碼和非編碼序列功能的嶄新的手段。并且，合成的基因組可以引入某些生物學(xué)特性，使得合成的生物體有著更加廣闊的應(yīng)用前景。合成的無毒力病毒可用于相關(guān)病毒疫苗的研發(fā)[61]，最小基因組將為代謝工程提供優(yōu)良的底盤細(xì) 胞[36]，擁有57個(gè)密碼子的大腸桿菌將和其他細(xì)菌產(chǎn)生遺傳隔離從而阻斷基因的水平轉(zhuǎn)移[32]。在Sc2.0計(jì)劃中，合成的基因組包含了一個(gè)可誘導(dǎo)的自動(dòng)進(jìn)化系統(tǒng)SCRaMbLE。通過誘導(dǎo)SCRaMbLE可以產(chǎn)生多種多樣的基因組，從而加速菌株的進(jìn)化，優(yōu)化代謝工程的底盤細(xì)胞[38]。

作為一個(gè)嶄新的研究領(lǐng)域，合成基因組學(xué)對傳統(tǒng)生命觀念所帶來的沖擊是巨大的，而且充滿了不確定性。就像一把雙刃劍，合成基因組學(xué)在帶來社會效益的同時(shí)也有可能帶來損害。所有的合成基因組學(xué)研究者都必須深刻認(rèn)識到這里面將可能涉及的倫理和政策問題，包括合成基因組學(xué)所帶來的知識產(chǎn)權(quán)、生物安全以及自我管控能力建設(shè)等問題。合成有機(jī)體如果進(jìn)入到自然環(huán)境中，將有可能會對環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面的影響，污染自然基因庫。因此，一些合成生物控制系統(tǒng)同時(shí)被研究出來防止合成生物的逃逸[62-63]。我們所有的研究都必須要以益處最大化和可能帶來的風(fēng)險(xiǎn)最小化為準(zhǔn)繩，開展有責(zé)任的創(chuàng)新。為了管控DNA重組和合成技術(shù)可能帶來的生物安全問題，NIH制定了相應(yīng)的指導(dǎo)性原則 (NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules)，并根據(jù)研究進(jìn)展保持更新。2010年5月，瑞士聯(lián)邦非人類生物技術(shù)倫理委員會 (Federal ethics committee on non-human biotechnology，ECNH)發(fā)布了題為《合成生物學(xué)——倫理問題》的報(bào)告。同年12月，美國生物倫理研究委員會發(fā)表了題為《新方向：合成生物學(xué)和新出現(xiàn)技術(shù)的倫理》的報(bào)告。為了更好地處理這些問題，合成基因組學(xué)的研究者們應(yīng)該加強(qiáng)自我監(jiān)管，建立開放的跨學(xué)科討論平臺，與社會學(xué)家和哲學(xué)家們合作，在研究的早期階段公開討論項(xiàng)目的倫理問題。

6 結(jié)語與展望

進(jìn)入21世紀(jì)以來，合成基因組學(xué)獲得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。原核生物基因組被不斷成功合成，第一個(gè)真核生物基因組已經(jīng)合成過半，人類基因組的合成也提上了議事日程。但是，目前的合成基因組學(xué)還處于起步發(fā)展階段，許多方面都尚未成熟。

一方面，由于目前對基因組各部分序列的功能了解得尚不夠清楚，基因組的重編程度仍然較低。如何合成一個(gè)功能可預(yù)知、可控制的基因組是當(dāng)前合成基因組學(xué)需要解決的一個(gè)重大問題。為解決這一問題，需要將基因組的各部分元件標(biāo)準(zhǔn)化、模塊化，使其變得更加可控；也需要建立各部分元件的功能的標(biāo)準(zhǔn)化表征體系，用以衡量合成細(xì)胞的各個(gè)輸出；更需要在系統(tǒng)生物學(xué)、定量生物學(xué)等層面深入理解各元件之間的輸入和輸出關(guān)系，提高對合成基因組的預(yù)知能力。通過“設(shè)計(jì)-合成-測試”這樣的循環(huán)發(fā)展，合成基因組學(xué)必將大幅加深我們對基因組的序列與功能對應(yīng)關(guān)系的理解。

另外一方面，基因組合成的成本目前仍然相對較高，DNA的合成、組裝和替換技術(shù)各方面都有著很大的降價(jià)空間。開發(fā)新的DNA合成策略，降低合成成本，加快合成速度，實(shí)現(xiàn)合成基因組學(xué)的工程化、經(jīng)濟(jì)化將是未來幾年內(nèi)合成基因組學(xué)走向?qū)嶋H應(yīng)用的必經(jīng)之路。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

戴俊彪 博士，現(xiàn)任中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院研究員。1997年本科畢業(yè)于南京大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)科教學(xué)強(qiáng)化部，2000年碩士畢業(yè)于清華大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)系。2006年于美國愛荷華州立大學(xué)分子、細(xì)胞及發(fā)育生物學(xué)專業(yè)獲得博士學(xué)位。2006?2011年在美國約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院從事博士后研究。2011?2017年任清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員。主要從事合成生物學(xué)研究，開發(fā)基因合成、組裝及全基因組設(shè)計(jì)與合成技術(shù)，是國際合成酵母基因組計(jì)劃的主要成員。已在、、、、等刊物上發(fā)表學(xué)術(shù)論文30多篇，申請／授權(quán)專利8項(xiàng)。2011年獲得美國約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院頒發(fā)的Albert Lehninger研究獎(jiǎng)，同年入選中組部首批青年“千人計(jì)劃”。

Synthetic genomics: the art of design and synthesis

Zhouqing Luo, and Junbiao Dai

School of Life Sciences, Center for Synthetic and Systems Biology, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Benefited from the rapid development of high-throughput sequencing, genome editing, DNA synthesis and functional genomics, synthetic genomics gains the momentum in this century. The entire genomes of several viruses and one prokaryote have been chemically synthesized and applied to drive normal cellular processes. The first eukaryotic genome synthesis project (Sc2.0) is on-going and about half of the genome has been synthesized and functionally tested. The Human Genome Project-Write (HGP-Write) was proposed in 2016, which pushes the tide of synthetic genomics to a position we have never seen before. Technologies on genome-scale design and DNA synthesis have been rapidly developed, aiming to construct a more predictable and controllable genome at reasonable cost. The generation of synthetic organisms not only has promising applications for industry, environment, healthy and basic researches, but also raises ethic and policy concerns. This review presents the development of synthetic genomics, with emphasis on technologies for whole genome design, synthesis and assembly. We also discussed ethics, prospective and challenge in synthetic genomics. As one of the major branches in synthetic biology, synthetic genomics is still at its infant stage. A lot of excitement will come in the next few years.

synthetic genomics, genome redesign, DNA synthesis, DNA assembly and genome construction

October 30, 2016; Accepted: December 9, 2016

Junbiao Dai. Tel: +86-10-62796190; E-mail: jbdai@tsinghua.edu.cn

Supported by: Funding from Young Thousand Talent Program, Tsinghua University Initiatives (No. 20161080088).

青年千人計(jì)劃，清華大學(xué)自主科研項(xiàng)目(No. 20161080088) 資助。