陳振國，班庭輝，周鴻凱

(1.湛江市碧海灣水產(chǎn)科技有限公司，廣東 湛江 5243002；2.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

重金屬Cu2+、Cd2+對光裸方格星蟲的急性毒性效應(yīng)

(1.湛江市碧海灣水產(chǎn)科技有限公司，廣東 湛江 5243002；2.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

為探討重金屬離子Cu2+、Cd2+對光裸方格星蟲的急性毒性效應(yīng)，設(shè)置了6個濃度梯度和3個處理時間，觀察記錄方格星蟲死亡情況及組織形態(tài)圖檢。結(jié)果表明：1)在具有一定Cu2+和Cd2+濃度處理中的光裸方格星蟲均呈現(xiàn)中毒現(xiàn)象，光裸方格星蟲的死亡率隨著重金屬離子濃度的增加和處理時間的延長而逐漸升高，具有明顯的劑量與時間效應(yīng)。2)Cu2+對光裸方格星蟲的毒性大于Cd2+，Cu2+對光裸星蟲的48 h LC50和72 h LC50值分別為10.60 mg/L和4.36 mg/L，Cd2+的48 h LC50和72 h LC50分別為11.95 mg/L和5.76 mg/L。3)光裸方格星蟲的食道及胃腸道是重金屬離子的主要侵害部位，也是較先受到毒性作用的部位。

光裸方格星蟲；Cu2+；Cd2+；急性中毒；半致死濃度LC50

光裸方格星蟲(Sipunculusnudus)，俗稱沙蟲，屬方格星蟲綱(Sipunculidea Haschek)、方格星蟲目(Sipunculif- ormes Cutleret Gibbs)、方格星蟲科(Sipunculidae Quatrefages)、方格星蟲屬(SipunculusLinnaeus)[1]，是一種非常美味的海鮮品種。其生長在沿海灘涂，主要分布在泥沙質(zhì)底層，屬于取食沉積物類型，吞噬底質(zhì)中的有機(jī)質(zhì)，主要以底質(zhì)中的有機(jī)碎屑和細(xì)菌為食。光裸方格星蟲對生長環(huán)境十分敏感，水體受污染會導(dǎo)致其死亡，所以有“環(huán)境標(biāo)志生物”之稱。

重金屬離子Hg、Cd、Pb、Cr以及類金屬As等具有顯著的生物毒性[2]，往往能在低濃度下產(chǎn)生很高的毒性。隨著工業(yè)化進(jìn)程的加快，來自農(nóng)藥、醫(yī)藥、儀表及各類有色金屬礦山等工業(yè)產(chǎn)生的廢水是對水體污染最嚴(yán)重的因素之一[3]，并且未經(jīng)處理就排放最終進(jìn)入海洋[4]。重金屬污染的特點主要有：1)污染范圍廣、持續(xù)時間長；2)毒性強(qiáng)、危害大；3)生物放大作用；4)具有一定隱蔽性[5]。重金屬污染對動物機(jī)體的危害主要是引起肝臟[6]、血液循環(huán)系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷；其對動物體產(chǎn)生影響的主要方式是抑制動物酶活性和影響動物蛋白質(zhì)，以及影響動物生物大分子[7]。水體環(huán)境中的重金屬污染不但影響水生生物的產(chǎn)量和質(zhì)量，而且由于重金屬性質(zhì)穩(wěn)定、不易分解、脂溶性強(qiáng)以及與蛋白質(zhì)或酶有較高的親和力等特點，導(dǎo)致在環(huán)境中進(jìn)行遷移時，一旦進(jìn)入食物鏈[8]，就可能因生物濃縮和生物放大作用而在生物體內(nèi)蓄積[9]。當(dāng)重金屬在生物體內(nèi)達(dá)到一定濃度時，就會對該生物體本身產(chǎn)生損傷，也會通過水生食物鏈的富集作用對人類造成危害，從而嚴(yán)重威脅著人類的身體健康和生命安全。

Cd是生物體非必需的金屬元素[10]，而且它對生物體毒害較大。在水生生態(tài)中Cu為生物體必需的微量金屬元素，生物體的許多生理生化反應(yīng)都需要它的參與，但是Cu含量超標(biāo)也會引起生物體中毒。重金屬對生物的毒性，不與水域中金屬總濃度相關(guān)，而是主要取決于游離(水合)的金屬離子，如Cd主要取決于游離Cd2+濃度，Cu取決于游離Cu2+及其氫氧化物。鑒于重金屬污染是當(dāng)前環(huán)境污染和環(huán)境治理最為關(guān)鍵的問題，本研究應(yīng)用水生生物毒性試驗方法[11]，通過配制不同濃度的重金屬液構(gòu)筑方格星蟲急性毒性實驗?zāi)Ｐ?，借助?shù)理統(tǒng)計的方法和組織病理切片觀察，研究重金屬離子Cu2+、Cd2+對方格星蟲的急性毒性作用和重金屬對方格星蟲機(jī)體組織的損傷作用，為光裸方格星蟲的后續(xù)研究提供資料。

1 材料方法

1.1 試驗動物

裸體方格星蟲采集于北部灣的湛江近海域——“沙蟲第一鄉(xiāng)”遂溪縣草潭鎮(zhèn)沙蟲養(yǎng)殖場，重量為(10±0.5)g/條，體長約5～8 cm。

1.2 主要試劑和儀器

甲醛、二甲苯、CuSO4·5H2O、CdCl2均為國產(chǎn)分析純試劑。組織包埋機(jī)、切片機(jī)、烤片機(jī)等均為湖北省孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 試驗設(shè)計

2015年5月10日將體重為(10±2)g的光裸方格星蟲帶回實驗室后，先放置于未添加重金屬的海水中(水溫26℃、鹽度2.13%、pH7.8、溶解氧7.54 mg/L)暫養(yǎng)4 d。待其消化道內(nèi)完全排凈沙后，挑選蟲體胞滿、體表完整、個體活動能力正常、活力良好的個體供實驗用。每個5 000 mL的燒杯加5 cm厚度的從養(yǎng)殖場帶回的海沙，然后放入10只方格星蟲，并添加1 L含有設(shè)定濃度重金屬的海水(水溫26℃、鹽度2.13%、pH7.8、溶解氧7.54 mg/L)，每12 h換水1 次，實驗時不投餌料，3個重復(fù)。通過預(yù)實驗的結(jié)果分析，本試驗以CuSO4·5H2O和CdCl2配制的濃度梯度為0.0、5.6、10.0、18.0、32.0、56.0 mg/L等6個梯度等級，其相應(yīng)的海水中重金屬Cu2+和Cd2+的濃度梯度分別是0.00、1.44、2.56、4.61、8.19、14.34 mg/L和0.00、3.43、6.13、11.04、19.62、34.34 mg/L。觀察兩種重金屬對光裸方格星蟲的單一急性毒性作用。

1.3.2 死亡判定

在強(qiáng)刺激下吻不收縮、身體松軟無活力，用玻璃棒輕觸或鑷子夾取其吻部或身體，許久不做出反應(yīng)者可判定為死亡個體[12]。

1.3.3 組織形態(tài)學(xué)觀察

將光裸星蟲置于不同濃度的Cu2+和Cd2+重金屬溶液中，觀察其機(jī)體活動以及形態(tài)變化，并給予一定強(qiáng)度的刺激，觀察其機(jī)體活力及形態(tài)變化。在進(jìn)行重金屬染毒處理后第24 h、48 h、72 h均需對各組蟲體進(jìn)行瀕死判定。對于瀕死個體，及時解剖并觀察其癥狀，做好相應(yīng)記錄后立即放置在10%甲醛液中進(jìn)行活體組織固定。然后，制作組織切片，觀察。

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析處理，求得不同類型重金屬分別在48 h和72 h內(nèi)對光裸方格星蟲的半致死濃度(LC50)、95%置信區(qū)間及回歸方程。

2 結(jié)果分析

2.1 中毒癥狀觀察

在Cu2+和Cd2+的染毒實驗組中，光裸方格星蟲均出現(xiàn)了中毒現(xiàn)象，同時其機(jī)體活力發(fā)生明顯的變化。剛放入含重金屬海水中時，光裸方格星蟲運動劇烈，隨后出現(xiàn)吻和身體的放松，其吻的伸縮能力明顯降低，并且逐漸變細(xì)、透明度增加，觸手如果伸長則成菊花狀，此時蟲體活力很弱，對外界刺激不敏感。隨著實驗時間的延長，蟲體表現(xiàn)為肌肉極柔軟，直至吻和身體完全舒張，呈松弛狀態(tài)，對外界刺激不再做出任何反應(yīng)，即死亡。死亡后可見蟲體吸水膨脹，也有個別蟲體重金屬中毒后會吐出體腔液，光裸方格星蟲死亡時在多數(shù)蟲體吻端可見紫色團(tuán)狀物，蟲體肛門處外翻且顏色較深。通過組織切片觀察可見，中毒死亡蟲體的纖毛脫食道結(jié)構(gòu)毀壞，肌肉組織損傷等現(xiàn)象。

2.2 急性毒性作用試驗結(jié)果

從表1、表2可以看出，光裸方格星蟲的平均死亡率隨著這兩種重金屬濃度梯度的增高和處理時間的延長而增加，即重金屬對光裸方格星蟲的毒性作用具有明顯的劑量和時間效應(yīng)。蟲體發(fā)生中毒反應(yīng)的速度隨重金屬離子濃度的不同而變化，在接觸含重金屬Cd2+試液約12 h后，56.0 mg/L組首先出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，短時間內(nèi)就出現(xiàn)死亡；而在低濃度或短時間內(nèi)，有些蟲體中毒反應(yīng)相對較緩慢，要經(jīng)過較長時間才會出現(xiàn)死亡，有的個體呈“假死”狀態(tài)，長時間無活動，但在強(qiáng)烈的刺激下，仍可見緩慢收縮現(xiàn)象。

表1 CuSO4·5H2O對光裸方格星蟲的急性毒性作用結(jié)果

注：各項目的測試數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。下表同此。

Notes：The test data for each item was the mean±standard deviation(n=3).The same in the following tables.

表2 CdCl2對光裸方格星蟲的急性毒性作用結(jié)果

表3 Cd2+、Cu2+對光裸方格星蟲的急性毒性作用的回歸分析

表3的回歸分析表明，CuSO4·5H2O在48 h和72 h的LC50分別為41.4 mg /L和16.7 mg/L，即 Cu2+在48 h和72 h的LC50分別為10.60 mg /L和4.36mg/L；CdCl2在48 h、72 h對光裸方格星蟲的LC50分別為19.5 mg/L和9.4 mg/L，即Cd2+在48 h、72 h對光裸方格星蟲的LC50分別為11.95 mg/L和5.76 mg/L，表現(xiàn)為在48 h和72 h內(nèi)，Cu2+對光裸方格星蟲的毒性均強(qiáng)于Cd2+。

2.3 重金屬中毒后光裸方格星蟲的組織形態(tài)學(xué)變化

由圖1-A可見，光裸方格星蟲纖毛(CI)、食道皺襞(EF)等結(jié)構(gòu)均完整，細(xì)胞大小正常，而圖1-B可見纖毛等結(jié)構(gòu)已經(jīng)脫落、皺襞中上皮黏膜層(EMF)大部分已經(jīng)嚴(yán)重脫落；圖1-C可見只剩肌層及外膜(LM)，其余部分均已脫落；圖1-D為正常方格星蟲肌肉組織橫切可見角質(zhì)層(C)、上皮(E)、結(jié)締組織層(MF)、環(huán)肌層(RML)、縱肌層(LML)等結(jié)構(gòu)均完整；圖E可見只剩肌層及外膜，其余部分均已脫落；圖F可見其角質(zhì)層(C)及上皮(E)部分破損，環(huán)肌層肌(RML)也可見部分肌纖維損傷。

圖1 光裸方格星蟲組織切片觀察結(jié)果

注：CI：纖毛；EF：食道皺襞；EMF：皺襞中上皮黏膜層；AD：外膜；LM：肌肉層；C：角質(zhì)層；E：上皮；MF：結(jié)締組織層；LML：縱肌層肌；RML：環(huán)肌層肌。

Notes：CI indicated cilium；EF indicated esophageal folds；EMF indicated epithelial mucosa folds；AD indicated adventitia；LM indicated lamina muscularis；C indicated corneum；E indicatad epithelium；MF indicated muscle fibre；LML indicated longitudinal muscular layer；RML indicated connective tissue layer.

3 討論

正常的光裸方格星蟲食道橫切面由內(nèi)到外清晰可見有黏膜[13]、黏膜下層和外膜等結(jié)構(gòu)，其中黏膜層為單層柱狀纖毛上皮細(xì)胞，細(xì)胞核近基部，呈圓形，食道黏膜縱行褶皺呈長指狀，黏膜下層為疏松結(jié)締組織。光裸方格星蟲蟲體壁呈半透明狀，由外到內(nèi)依次可分為角質(zhì)層、上皮、結(jié)締組織層、環(huán)肌層、縱肌層和壁體腔膜等6個部分[14]，這與本試驗中的對照組結(jié)構(gòu)類似。

重金屬的毒性主要取決于游離(水合)的金屬離子濃度[15]，如Cd主要取決于游離Cd2+濃度，Cu取決于游離Cu2+及其氫氧化物的量。而重金屬的化學(xué)形態(tài)則取決于它的來源及其進(jìn)入水體后與水中其他物質(zhì)能夠發(fā)生的相互作用，因而水體中的重金屬形態(tài)會隨環(huán)境條件的不同而變化。重金屬對生物組織的急性毒性作用機(jī)理為[16]對動物酶的活性的影響包括誘導(dǎo)和抑制、對生物大分子、動物蛋白質(zhì)和核酸的影響如破壞他們的結(jié)構(gòu)等。近年來也研究發(fā)現(xiàn)[17]，重金屬除可導(dǎo)致蛋白質(zhì)化學(xué)損傷作用外，亦可誘導(dǎo)生物機(jī)體內(nèi)一些功能蛋白生成，如應(yīng)激蛋白和金屬硫蛋白。但當(dāng)重金屬在生物體內(nèi)累積量超過體內(nèi)金屬硫蛋白的合成速度時，多余的重金屬離子就會與體內(nèi)的其他生物分子，包括酶和核酸等生物大分子相互作用，從而引起中毒現(xiàn)象。光裸方格星蟲循環(huán)系統(tǒng)的功能由體腔液擔(dān)任，而且其體液是個開放的組織系統(tǒng)，對于任何酶活性的變化都會給整個系統(tǒng)帶來影響，因此其機(jī)體對外界環(huán)境變化的敏感性強(qiáng)。本研究表明，一定劑量的重金屬Cd2+和Cu2+即可導(dǎo)致光裸方格星蟲表現(xiàn)出明顯的中毒反應(yīng)甚至死亡，同時也導(dǎo)致星蟲體壁的滲透平衡被破壞，其身體吸水膨脹。這是由于一定劑量的重金屬離子可抑制水生生物酶的活性[10，16]，當(dāng)劑量加大而超過生物自身的解毒能力時，則表現(xiàn)出明顯的中毒反應(yīng)甚至死亡。

本研究結(jié)果表明，Cu2+和Cd2+均對光裸方格星蟲有很強(qiáng)的毒性作用，其致死和半致死起始濃度有所差異，方格星蟲對這兩種重金屬離子吸收和耐受能力不同。這種差異表明了Cd作為生物非必需元素，對光裸方格星蟲表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性，這可能與星蟲體內(nèi)Cd硫蛋白的結(jié)合能力有關(guān)。然而，Cu2+在最初反應(yīng)不太明顯，在48 h內(nèi)中低濃度組中毒死亡現(xiàn)象相對較少，但在72 h后，死亡數(shù)突然增加，光裸方格星蟲對低濃度重金屬離子Cu2+短期內(nèi)的調(diào)節(jié)作用可能與其體內(nèi)的解毒貯存功能有關(guān)，當(dāng)其體內(nèi)重金屬離子積累一定濃度后，將會使得其體內(nèi)蛋白與重金屬離子結(jié)合而減輕其毒性；但是隨著暴露時間的增加，體內(nèi)累積重金屬離子濃度增加，這時蛋白質(zhì)與離子結(jié)合達(dá)到飽和，解毒作用減弱，導(dǎo)致死亡率增加。本研究中，在Cu2+的24 h組的實驗中，死亡率并未隨著處理濃度的升高而增加，但在CuSO4·5H2O處理梯度為18 mg/L 時而突然增加，其原因可能是由于當(dāng)時并未意識到“假死”現(xiàn)象，后來通過查閱相關(guān)資料已經(jīng)避免類似情況發(fā)生。

隨著Cu2+和Cd2+濃度增加，星蟲死亡率呈上升趨勢。當(dāng)Cu2+濃度為1.43 mg/L時，光裸方格星蟲24 h內(nèi)的死亡率為0；當(dāng)Cu2+濃度>4.61 mg /L時，48 h和72 h內(nèi)星蟲的死亡率均明顯增加。當(dāng)Cd2+濃度>6.13 mg /L 時，光裸方格星蟲48 h和72 h內(nèi)的死亡率明顯增加。Cu2+在48 h對光裸方格星蟲的LC50為10.60 mg /L，Cd2+在48 h的LC50為11.95 mg/L。

此次實驗中的重金屬離子主要是隨著方格星蟲采食而進(jìn)入其機(jī)體內(nèi)，所以食道及胃腸道是重金屬離子的主要侵害部位，也是較先受到毒性作用的部位，Michel等[18]在研究光裸方格星蟲的消化道結(jié)構(gòu)時認(rèn)為，其消化酶的分泌主要在下行腸中進(jìn)行，而營養(yǎng)的吸收則全部發(fā)生在上行腸的中上段，所以重金屬離子對蟲體消化道的損傷作用在消化道的中上段更為明顯。也有研究認(rèn)為[19]，細(xì)胞損傷的機(jī)理主要是有毒物質(zhì)與膜蛋白相互作用于ATP酶控制的Na+-K+離子的分布，從而造成膜通透性改變，而毒物對酶的抑制為不可逆性的抑制，因此造成生物體的細(xì)胞損傷。

[1]陳細(xì)香，林秀雁，盧昌義，等.方格星蟲屬動物的研究進(jìn)展[J].海洋科學(xué)，2008，32(6)：66-70.

[2]劉靜宜，任安璞，彭安，等.環(huán)境化學(xué)[M].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，1987.

[3]Rainbow P S.Copper，cadmium and zinc concentrations in oceanic amphipod and euphausiid crustaceans，as a source of heavy metals to pelagic seabirds[J].Mar.Biol，1989，103(4)：513-518.

[4]國家海洋局.2006年中國海洋環(huán)境公報[J].海洋世界，2007，(2)：4-5.

[5]肖安東，匡光偉.重金屬對畜產(chǎn)品安全的危害與對策[J].中國獸藥雜志，2011，45(4)：49-51.

[6]朱映川，劉雯，周遺品，等.水體重金屬污染現(xiàn)狀及其治理方法研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，(8)：143-146.

[7]孔繁翔.環(huán)境生物學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2000.

[8]Eisler R.Trace metal concentrations in marine organisms[M].New York：Pergamon Press，1981.

[9]Rainbow P S.海洋生物對重金屬的積累及意義[J].海洋環(huán)境科學(xué)，1992，11(1)：44-52.

[10]賀亮，范必威.海洋環(huán)境中的重金屬及其對海洋生物的影響[J].廣州化學(xué)，2006，(3)：63-69.

[11]周永欣，章宗涉.水生生物毒性試驗方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1989.

[12]李俊輝，王忠維.重金屬離子對裸體方格星蟲的急性毒性試驗[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(3)：1482-1483.

[13]吳鵬飛，王嫣，顧志峰，等.光裸方格星蟲消化道的形態(tài)和組織學(xué)觀察[J].漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2010，31(1)：74-79.

[14]鄧中日，黃勃，方再光.裸體方格星蟲體壁形態(tài)和組織學(xué)結(jié)構(gòu)[J].湖南城市學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)，2007，16(1)：62-65.

[15]曾燦星，陳靜生.研究不同金屬形態(tài)的毒性效應(yīng)在探討重金屬水環(huán)境容量中的作用[J].環(huán)境化學(xué)，1986，5(5)：1-11.

[16]趙紅霞，詹勇，許梓榮.重金屬對水生動物毒性的研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)雜志，2004，28(4)：13-18.

[17]Roesijadi G.Metallothioneins in metal regulation and toxicity in aquatic animals[J].Toxicol.，1992，22(2)：81-114.

[18]Brown C L，Michel C，Devillez E J.Structural and biochemical observations on the ipunculid digestive tract[J].American zoologist，1979， 19(3)：908.

[19]郭永燦，王振中，張友梅，等.重金屬對蚯蚓胃腸道上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷的研究[J].生態(tài)學(xué)報，1997，17(3)：282-287.

Acute toxicity effect of heavy metal Cu2+and Cd2+onSipunculusnudusCHEN

Zhenguo1，BANTinghui1，ZHOUHongkai2*

(1.Bihaiwan Aquatic Science and Technology Co.Ltd.in Zhanjiang，Zhanjiang 524300，China；2.College of Agronomy，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China)

In order to explore the acute toxicity effect of heavy metal ions(Cu2+and Cd2+)onSipunculusnudus，we set six concentration gradients and three processing time to observe mortality and histological test ofSipunculusnudus.The results showed that：1)Sipunculusnuduswere poisoned in certain concentrations of Cu2+and Cd2+.The mortality rate ofSipunculusnudusincreased with the increasing of heavy metal ions concentration and the extension of processing time，which had the obvious dosage and time effect.(2)The Cu2+function of toxicity was greater than that of Cd2+inSipunculusnudus.The LC50values of Cu2+at 48 h and 72 h were 10.60 mg/L and 4.36 mg/L，respectively，and the LC50values of Cd2+at 48 h and 72 h were 11.95 mg/L and 5.76 mg/L,respectively.3)The esophagus and gastrointestinal were the mainly and first part poisoned inSipunculusnudusof heavy metals.

Sipunculusnudus；Cu2+；Cd2+；acute toxicity；median lethal concentration( LC50)

2016-12-02 資助項目：國家自然科學(xué)基金(41073059)；湛江市科技招標(biāo)項目(編號：2011C0102).

陳振國(1986-)，男，本科，研究方向：海水養(yǎng)殖.E-mail:597255767@qq.com

周鴻凱(1962-)，男，教授，研究方向：生態(tài)環(huán)境安全相關(guān)研究. E-mail: 897961801@qq.com

S968.9

A

1006-5601(2017)02-00090-07

陳振國，班庭輝，周鴻凱.重金屬Cu2+、Cd2+對光裸方格星蟲的急性毒性效應(yīng)[J].漁業(yè)研究，2017，39(2)：90-96.