陳振國，班庭輝，周鴻凱

(1.湛江市碧海灣水產科技有限公司，廣東 湛江 5243002；2.廣東海洋大學農學院，廣東 湛江 524088)

重金屬Cu2+、Cd2+對光裸方格星蟲的急性毒性效應

(1.湛江市碧海灣水產科技有限公司，廣東 湛江 5243002；2.廣東海洋大學農學院，廣東 湛江 524088)

為探討重金屬離子Cu2+、Cd2+對光裸方格星蟲的急性毒性效應，設置了6個濃度梯度和3個處理時間，觀察記錄方格星蟲死亡情況及組織形態(tài)圖檢。結果表明：1)在具有一定Cu2+和Cd2+濃度處理中的光裸方格星蟲均呈現(xiàn)中毒現(xiàn)象，光裸方格星蟲的死亡率隨著重金屬離子濃度的增加和處理時間的延長而逐漸升高，具有明顯的劑量與時間效應。2)Cu2+對光裸方格星蟲的毒性大于Cd2+，Cu2+對光裸星蟲的48 h LC50和72 h LC50值分別為10.60 mg/L和4.36 mg/L，Cd2+的48 h LC50和72 h LC50分別為11.95 mg/L和5.76 mg/L。3)光裸方格星蟲的食道及胃腸道是重金屬離子的主要侵害部位，也是較先受到毒性作用的部位。

光裸方格星蟲；Cu2+；Cd2+；急性中毒；半致死濃度LC50

光裸方格星蟲(Sipunculusnudus)，俗稱沙蟲，屬方格星蟲綱(Sipunculidea Haschek)、方格星蟲目(Sipunculif- ormes Cutleret Gibbs)、方格星蟲科(Sipunculidae Quatrefages)、方格星蟲屬(SipunculusLinnaeus)[1]，是一種非常美味的海鮮品種。其生長在沿海灘涂，主要分布在泥沙質底層，屬于取食沉積物類型，吞噬底質中的有機質，主要以底質中的有機碎屑和細菌為食。光裸方格星蟲對生長環(huán)境十分敏感，水體受污染會導致其死亡，所以有“環(huán)境標志生物”之稱。

重金屬離子Hg、Cd、Pb、Cr以及類金屬As等具有顯著的生物毒性[2]，往往能在低濃度下產生很高的毒性。隨著工業(yè)化進程的加快，來自農藥、醫(yī)藥、儀表及各類有色金屬礦山等工業(yè)產生的廢水是對水體污染最嚴重的因素之一[3]，并且未經處理就排放最終進入海洋[4]。重金屬污染的特點主要有：1)污染范圍廣、持續(xù)時間長；2)毒性強、危害大；3)生物放大作用；4)具有一定隱蔽性[5]。重金屬污染對動物機體的危害主要是引起肝臟[6]、血液循環(huán)系統(tǒng)和神經系統(tǒng)的損傷；其對動物體產生影響的主要方式是抑制動物酶活性和影響動物蛋白質，以及影響動物生物大分子[7]。水體環(huán)境中的重金屬污染不但影響水生生物的產量和質量，而且由于重金屬性質穩(wěn)定、不易分解、脂溶性強以及與蛋白質或酶有較高的親和力等特點，導致在環(huán)境中進行遷移時，一旦進入食物鏈[8]，就可能因生物濃縮和生物放大作用而在生物體內蓄積[9]。當重金屬在生物體內達到一定濃度時，就會對該生物體本身產生損傷，也會通過水生食物鏈的富集作用對人類造成危害，從而嚴重威脅著人類的身體健康和生命安全。

Cd是生物體非必需的金屬元素[10]，而且它對生物體毒害較大。在水生生態(tài)中Cu為生物體必需的微量金屬元素，生物體的許多生理生化反應都需要它的參與，但是Cu含量超標也會引起生物體中毒。重金屬對生物的毒性，不與水域中金屬總濃度相關，而是主要取決于游離(水合)的金屬離子，如Cd主要取決于游離Cd2+濃度，Cu取決于游離Cu2+及其氫氧化物。鑒于重金屬污染是當前環(huán)境污染和環(huán)境治理最為關鍵的問題，本研究應用水生生物毒性試驗方法[11]，通過配制不同濃度的重金屬液構筑方格星蟲急性毒性實驗模型，借助數(shù)理統(tǒng)計的方法和組織病理切片觀察，研究重金屬離子Cu2+、Cd2+對方格星蟲的急性毒性作用和重金屬對方格星蟲機體組織的損傷作用，為光裸方格星蟲的后續(xù)研究提供資料。

1 材料方法

1.1 試驗動物

裸體方格星蟲采集于北部灣的湛江近海域——“沙蟲第一鄉(xiāng)”遂溪縣草潭鎮(zhèn)沙蟲養(yǎng)殖場，重量為(10±0.5)g/條，體長約5～8 cm。

1.2 主要試劑和儀器

甲醛、二甲苯、CuSO4·5H2O、CdCl2均為國產分析純試劑。組織包埋機、切片機、烤片機等均為湖北省孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司生產。

1.3 實驗方法

1.3.1 試驗設計

2015年5月10日將體重為(10±2)g的光裸方格星蟲帶回實驗室后，先放置于未添加重金屬的海水中(水溫26℃、鹽度2.13%、pH7.8、溶解氧7.54 mg/L)暫養(yǎng)4 d。待其消化道內完全排凈沙后，挑選蟲體胞滿、體表完整、個體活動能力正常、活力良好的個體供實驗用。每個5 000 mL的燒杯加5 cm厚度的從養(yǎng)殖場帶回的海沙，然后放入10只方格星蟲，并添加1 L含有設定濃度重金屬的海水(水溫26℃、鹽度2.13%、pH7.8、溶解氧7.54 mg/L)，每12 h換水1 次，實驗時不投餌料，3個重復。通過預實驗的結果分析，本試驗以CuSO4·5H2O和CdCl2配制的濃度梯度為0.0、5.6、10.0、18.0、32.0、56.0 mg/L等6個梯度等級，其相應的海水中重金屬Cu2+和Cd2+的濃度梯度分別是0.00、1.44、2.56、4.61、8.19、14.34 mg/L和0.00、3.43、6.13、11.04、19.62、34.34 mg/L。觀察兩種重金屬對光裸方格星蟲的單一急性毒性作用。

1.3.2 死亡判定

在強刺激下吻不收縮、身體松軟無活力，用玻璃棒輕觸或鑷子夾取其吻部或身體，許久不做出反應者可判定為死亡個體[12]。

1.3.3 組織形態(tài)學觀察

將光裸星蟲置于不同濃度的Cu2+和Cd2+重金屬溶液中，觀察其機體活動以及形態(tài)變化，并給予一定強度的刺激，觀察其機體活力及形態(tài)變化。在進行重金屬染毒處理后第24 h、48 h、72 h均需對各組蟲體進行瀕死判定。對于瀕死個體，及時解剖并觀察其癥狀，做好相應記錄后立即放置在10%甲醛液中進行活體組織固定。然后，制作組織切片，觀察。

1.4 統(tǒng)計分析

應用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析處理，求得不同類型重金屬分別在48 h和72 h內對光裸方格星蟲的半致死濃度(LC50)、95%置信區(qū)間及回歸方程。

2 結果分析

2.1 中毒癥狀觀察

在Cu2+和Cd2+的染毒實驗組中，光裸方格星蟲均出現(xiàn)了中毒現(xiàn)象，同時其機體活力發(fā)生明顯的變化。剛放入含重金屬海水中時，光裸方格星蟲運動劇烈，隨后出現(xiàn)吻和身體的放松，其吻的伸縮能力明顯降低，并且逐漸變細、透明度增加，觸手如果伸長則成菊花狀，此時蟲體活力很弱，對外界刺激不敏感。隨著實驗時間的延長，蟲體表現(xiàn)為肌肉極柔軟，直至吻和身體完全舒張，呈松弛狀態(tài)，對外界刺激不再做出任何反應，即死亡。死亡后可見蟲體吸水膨脹，也有個別蟲體重金屬中毒后會吐出體腔液，光裸方格星蟲死亡時在多數(shù)蟲體吻端可見紫色團狀物，蟲體肛門處外翻且顏色較深。通過組織切片觀察可見，中毒死亡蟲體的纖毛脫食道結構毀壞，肌肉組織損傷等現(xiàn)象。

2.2 急性毒性作用試驗結果

從表1、表2可以看出，光裸方格星蟲的平均死亡率隨著這兩種重金屬濃度梯度的增高和處理時間的延長而增加，即重金屬對光裸方格星蟲的毒性作用具有明顯的劑量和時間效應。蟲體發(fā)生中毒反應的速度隨重金屬離子濃度的不同而變化，在接觸含重金屬Cd2+試液約12 h后，56.0 mg/L組首先出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，短時間內就出現(xiàn)死亡；而在低濃度或短時間內，有些蟲體中毒反應相對較緩慢，要經過較長時間才會出現(xiàn)死亡，有的個體呈“假死”狀態(tài)，長時間無活動，但在強烈的刺激下，仍可見緩慢收縮現(xiàn)象。

表1 CuSO4·5H2O對光裸方格星蟲的急性毒性作用結果

注：各項目的測試數(shù)據(jù)為平均值±標準差(n=3)。下表同此。

Notes：The test data for each item was the mean±standard deviation(n=3).The same in the following tables.

表2 CdCl2對光裸方格星蟲的急性毒性作用結果

表3 Cd2+、Cu2+對光裸方格星蟲的急性毒性作用的回歸分析

表3的回歸分析表明，CuSO4·5H2O在48 h和72 h的LC50分別為41.4 mg /L和16.7 mg/L，即 Cu2+在48 h和72 h的LC50分別為10.60 mg /L和4.36mg/L；CdCl2在48 h、72 h對光裸方格星蟲的LC50分別為19.5 mg/L和9.4 mg/L，即Cd2+在48 h、72 h對光裸方格星蟲的LC50分別為11.95 mg/L和5.76 mg/L，表現(xiàn)為在48 h和72 h內，Cu2+對光裸方格星蟲的毒性均強于Cd2+。

2.3 重金屬中毒后光裸方格星蟲的組織形態(tài)學變化

由圖1-A可見，光裸方格星蟲纖毛(CI)、食道皺襞(EF)等結構均完整，細胞大小正常，而圖1-B可見纖毛等結構已經脫落、皺襞中上皮黏膜層(EMF)大部分已經嚴重脫落；圖1-C可見只剩肌層及外膜(LM)，其余部分均已脫落；圖1-D為正常方格星蟲肌肉組織橫切可見角質層(C)、上皮(E)、結締組織層(MF)、環(huán)肌層(RML)、縱肌層(LML)等結構均完整；圖E可見只剩肌層及外膜，其余部分均已脫落；圖F可見其角質層(C)及上皮(E)部分破損，環(huán)肌層肌(RML)也可見部分肌纖維損傷。

圖1 光裸方格星蟲組織切片觀察結果

注：CI：纖毛；EF：食道皺襞；EMF：皺襞中上皮黏膜層；AD：外膜；LM：肌肉層；C：角質層；E：上皮；MF：結締組織層；LML：縱肌層肌；RML：環(huán)肌層肌。

Notes：CI indicated cilium；EF indicated esophageal folds；EMF indicated epithelial mucosa folds；AD indicated adventitia；LM indicated lamina muscularis；C indicated corneum；E indicatad epithelium；MF indicated muscle fibre；LML indicated longitudinal muscular layer；RML indicated connective tissue layer.

3 討論

正常的光裸方格星蟲食道橫切面由內到外清晰可見有黏膜[13]、黏膜下層和外膜等結構，其中黏膜層為單層柱狀纖毛上皮細胞，細胞核近基部，呈圓形，食道黏膜縱行褶皺呈長指狀，黏膜下層為疏松結締組織。光裸方格星蟲蟲體壁呈半透明狀，由外到內依次可分為角質層、上皮、結締組織層、環(huán)肌層、縱肌層和壁體腔膜等6個部分[14]，這與本試驗中的對照組結構類似。

重金屬的毒性主要取決于游離(水合)的金屬離子濃度[15]，如Cd主要取決于游離Cd2+濃度，Cu取決于游離Cu2+及其氫氧化物的量。而重金屬的化學形態(tài)則取決于它的來源及其進入水體后與水中其他物質能夠發(fā)生的相互作用，因而水體中的重金屬形態(tài)會隨環(huán)境條件的不同而變化。重金屬對生物組織的急性毒性作用機理為[16]對動物酶的活性的影響包括誘導和抑制、對生物大分子、動物蛋白質和核酸的影響如破壞他們的結構等。近年來也研究發(fā)現(xiàn)[17]，重金屬除可導致蛋白質化學損傷作用外，亦可誘導生物機體內一些功能蛋白生成，如應激蛋白和金屬硫蛋白。但當重金屬在生物體內累積量超過體內金屬硫蛋白的合成速度時，多余的重金屬離子就會與體內的其他生物分子，包括酶和核酸等生物大分子相互作用，從而引起中毒現(xiàn)象。光裸方格星蟲循環(huán)系統(tǒng)的功能由體腔液擔任，而且其體液是個開放的組織系統(tǒng)，對于任何酶活性的變化都會給整個系統(tǒng)帶來影響，因此其機體對外界環(huán)境變化的敏感性強。本研究表明，一定劑量的重金屬Cd2+和Cu2+即可導致光裸方格星蟲表現(xiàn)出明顯的中毒反應甚至死亡，同時也導致星蟲體壁的滲透平衡被破壞，其身體吸水膨脹。這是由于一定劑量的重金屬離子可抑制水生生物酶的活性[10，16]，當劑量加大而超過生物自身的解毒能力時，則表現(xiàn)出明顯的中毒反應甚至死亡。

本研究結果表明，Cu2+和Cd2+均對光裸方格星蟲有很強的毒性作用，其致死和半致死起始濃度有所差異，方格星蟲對這兩種重金屬離子吸收和耐受能力不同。這種差異表明了Cd作為生物非必需元素，對光裸方格星蟲表現(xiàn)出較強的毒性，這可能與星蟲體內Cd硫蛋白的結合能力有關。然而，Cu2+在最初反應不太明顯，在48 h內中低濃度組中毒死亡現(xiàn)象相對較少，但在72 h后，死亡數(shù)突然增加，光裸方格星蟲對低濃度重金屬離子Cu2+短期內的調節(jié)作用可能與其體內的解毒貯存功能有關，當其體內重金屬離子積累一定濃度后，將會使得其體內蛋白與重金屬離子結合而減輕其毒性；但是隨著暴露時間的增加，體內累積重金屬離子濃度增加，這時蛋白質與離子結合達到飽和，解毒作用減弱，導致死亡率增加。本研究中，在Cu2+的24 h組的實驗中，死亡率并未隨著處理濃度的升高而增加，但在CuSO4·5H2O處理梯度為18 mg/L 時而突然增加，其原因可能是由于當時并未意識到“假死”現(xiàn)象，后來通過查閱相關資料已經避免類似情況發(fā)生。

隨著Cu2+和Cd2+濃度增加，星蟲死亡率呈上升趨勢。當Cu2+濃度為1.43 mg/L時，光裸方格星蟲24 h內的死亡率為0；當Cu2+濃度>4.61 mg /L時，48 h和72 h內星蟲的死亡率均明顯增加。當Cd2+濃度>6.13 mg /L 時，光裸方格星蟲48 h和72 h內的死亡率明顯增加。Cu2+在48 h對光裸方格星蟲的LC50為10.60 mg /L，Cd2+在48 h的LC50為11.95 mg/L。

此次實驗中的重金屬離子主要是隨著方格星蟲采食而進入其機體內，所以食道及胃腸道是重金屬離子的主要侵害部位，也是較先受到毒性作用的部位，Michel等[18]在研究光裸方格星蟲的消化道結構時認為，其消化酶的分泌主要在下行腸中進行，而營養(yǎng)的吸收則全部發(fā)生在上行腸的中上段，所以重金屬離子對蟲體消化道的損傷作用在消化道的中上段更為明顯。也有研究認為[19]，細胞損傷的機理主要是有毒物質與膜蛋白相互作用于ATP酶控制的Na+-K+離子的分布，從而造成膜通透性改變，而毒物對酶的抑制為不可逆性的抑制，因此造成生物體的細胞損傷。

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Acute toxicity effect of heavy metal Cu2+and Cd2+onSipunculusnudusCHEN

Zhenguo1，BANTinghui1，ZHOUHongkai2*

(1.Bihaiwan Aquatic Science and Technology Co.Ltd.in Zhanjiang，Zhanjiang 524300，China；2.College of Agronomy，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China)

In order to explore the acute toxicity effect of heavy metal ions(Cu2+and Cd2+)onSipunculusnudus，we set six concentration gradients and three processing time to observe mortality and histological test ofSipunculusnudus.The results showed that：1)Sipunculusnuduswere poisoned in certain concentrations of Cu2+and Cd2+.The mortality rate ofSipunculusnudusincreased with the increasing of heavy metal ions concentration and the extension of processing time，which had the obvious dosage and time effect.(2)The Cu2+function of toxicity was greater than that of Cd2+inSipunculusnudus.The LC50values of Cu2+at 48 h and 72 h were 10.60 mg/L and 4.36 mg/L，respectively，and the LC50values of Cd2+at 48 h and 72 h were 11.95 mg/L and 5.76 mg/L,respectively.3)The esophagus and gastrointestinal were the mainly and first part poisoned inSipunculusnudusof heavy metals.

Sipunculusnudus；Cu2+；Cd2+；acute toxicity；median lethal concentration( LC50)

2016-12-02 資助項目：國家自然科學基金(41073059)；湛江市科技招標項目(編號：2011C0102).

陳振國(1986-)，男，本科，研究方向：海水養(yǎng)殖.E-mail:597255767@qq.com

周鴻凱(1962-)，男，教授，研究方向：生態(tài)環(huán)境安全相關研究. E-mail: 897961801@qq.com

S968.9

A

1006-5601(2017)02-00090-07

陳振國，班庭輝，周鴻凱.重金屬Cu2+、Cd2+對光裸方格星蟲的急性毒性效應[J].漁業(yè)研究，2017，39(2)：90-96.