陳振國(guó)，班庭輝，周鴻凱

(1.湛江市碧海灣水產(chǎn)科技有限公司，廣東 湛江 5243002；2.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

重金屬Cu2+、Cd2+對(duì)光裸方格星蟲(chóng)的急性毒性效應(yīng)

(1.湛江市碧海灣水產(chǎn)科技有限公司，廣東 湛江 5243002；2.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

為探討重金屬離子Cu2+、Cd2+對(duì)光裸方格星蟲(chóng)的急性毒性效應(yīng)，設(shè)置了6個(gè)濃度梯度和3個(gè)處理時(shí)間，觀察記錄方格星蟲(chóng)死亡情況及組織形態(tài)圖檢。結(jié)果表明：1)在具有一定Cu2+和Cd2+濃度處理中的光裸方格星蟲(chóng)均呈現(xiàn)中毒現(xiàn)象，光裸方格星蟲(chóng)的死亡率隨著重金屬離子濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，具有明顯的劑量與時(shí)間效應(yīng)。2)Cu2+對(duì)光裸方格星蟲(chóng)的毒性大于Cd2+，Cu2+對(duì)光裸星蟲(chóng)的48 h LC50和72 h LC50值分別為10.60 mg/L和4.36 mg/L，Cd2+的48 h LC50和72 h LC50分別為11.95 mg/L和5.76 mg/L。3)光裸方格星蟲(chóng)的食道及胃腸道是重金屬離子的主要侵害部位，也是較先受到毒性作用的部位。

光裸方格星蟲(chóng)；Cu2+；Cd2+；急性中毒；半致死濃度LC50

光裸方格星蟲(chóng)(Sipunculusnudus)，俗稱(chēng)沙蟲(chóng)，屬方格星蟲(chóng)綱(Sipunculidea Haschek)、方格星蟲(chóng)目(Sipunculif- ormes Cutleret Gibbs)、方格星蟲(chóng)科(Sipunculidae Quatrefages)、方格星蟲(chóng)屬(SipunculusLinnaeus)[1]，是一種非常美味的海鮮品種。其生長(zhǎng)在沿海灘涂，主要分布在泥沙質(zhì)底層，屬于取食沉積物類(lèi)型，吞噬底質(zhì)中的有機(jī)質(zhì)，主要以底質(zhì)中的有機(jī)碎屑和細(xì)菌為食。光裸方格星蟲(chóng)對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境十分敏感，水體受污染會(huì)導(dǎo)致其死亡，所以有“環(huán)境標(biāo)志生物”之稱(chēng)。

重金屬離子Hg、Cd、Pb、Cr以及類(lèi)金屬As等具有顯著的生物毒性[2]，往往能在低濃度下產(chǎn)生很高的毒性。隨著工業(yè)化進(jìn)程的加快，來(lái)自農(nóng)藥、醫(yī)藥、儀表及各類(lèi)有色金屬礦山等工業(yè)產(chǎn)生的廢水是對(duì)水體污染最嚴(yán)重的因素之一[3]，并且未經(jīng)處理就排放最終進(jìn)入海洋[4]。重金屬污染的特點(diǎn)主要有：1)污染范圍廣、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)；2)毒性強(qiáng)、危害大；3)生物放大作用；4)具有一定隱蔽性[5]。重金屬污染對(duì)動(dòng)物機(jī)體的危害主要是引起肝臟[6]、血液循環(huán)系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷；其對(duì)動(dòng)物體產(chǎn)生影響的主要方式是抑制動(dòng)物酶活性和影響動(dòng)物蛋白質(zhì)，以及影響動(dòng)物生物大分子[7]。水體環(huán)境中的重金屬污染不但影響水生生物的產(chǎn)量和質(zhì)量，而且由于重金屬性質(zhì)穩(wěn)定、不易分解、脂溶性強(qiáng)以及與蛋白質(zhì)或酶有較高的親和力等特點(diǎn)，導(dǎo)致在環(huán)境中進(jìn)行遷移時(shí)，一旦進(jìn)入食物鏈[8]，就可能因生物濃縮和生物放大作用而在生物體內(nèi)蓄積[9]。當(dāng)重金屬在生物體內(nèi)達(dá)到一定濃度時(shí)，就會(huì)對(duì)該生物體本身產(chǎn)生損傷，也會(huì)通過(guò)水生食物鏈的富集作用對(duì)人類(lèi)造成危害，從而嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的身體健康和生命安全。

Cd是生物體非必需的金屬元素[10]，而且它對(duì)生物體毒害較大。在水生生態(tài)中Cu為生物體必需的微量金屬元素，生物體的許多生理生化反應(yīng)都需要它的參與，但是Cu含量超標(biāo)也會(huì)引起生物體中毒。重金屬對(duì)生物的毒性，不與水域中金屬總濃度相關(guān)，而是主要取決于游離(水合)的金屬離子，如Cd主要取決于游離Cd2+濃度，Cu取決于游離Cu2+及其氫氧化物。鑒于重金屬污染是當(dāng)前環(huán)境污染和環(huán)境治理最為關(guān)鍵的問(wèn)題，本研究應(yīng)用水生生物毒性試驗(yàn)方法[11]，通過(guò)配制不同濃度的重金屬液構(gòu)筑方格星蟲(chóng)急性毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，借助?shù)理統(tǒng)計(jì)的方法和組織病理切片觀察，研究重金屬離子Cu2+、Cd2+對(duì)方格星蟲(chóng)的急性毒性作用和重金屬對(duì)方格星蟲(chóng)機(jī)體組織的損傷作用，為光裸方格星蟲(chóng)的后續(xù)研究提供資料。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

裸體方格星蟲(chóng)采集于北部灣的湛江近海域——“沙蟲(chóng)第一鄉(xiāng)”遂溪縣草潭鎮(zhèn)沙蟲(chóng)養(yǎng)殖場(chǎng)，重量為(10±0.5)g/條，體長(zhǎng)約5～8 cm。

1.2 主要試劑和儀器

甲醛、二甲苯、CuSO4·5H2O、CdCl2均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。組織包埋機(jī)、切片機(jī)、烤片機(jī)等均為湖北省孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2015年5月10日將體重為(10±2)g的光裸方格星蟲(chóng)帶回實(shí)驗(yàn)室后，先放置于未添加重金屬的海水中(水溫26℃、鹽度2.13%、pH7.8、溶解氧7.54 mg/L)暫養(yǎng)4 d。待其消化道內(nèi)完全排凈沙后，挑選蟲(chóng)體胞滿、體表完整、個(gè)體活動(dòng)能力正常、活力良好的個(gè)體供實(shí)驗(yàn)用。每個(gè)5 000 mL的燒杯加5 cm厚度的從養(yǎng)殖場(chǎng)帶回的海沙，然后放入10只方格星蟲(chóng)，并添加1 L含有設(shè)定濃度重金屬的海水(水溫26℃、鹽度2.13%、pH7.8、溶解氧7.54 mg/L)，每12 h換水1 次，實(shí)驗(yàn)時(shí)不投餌料，3個(gè)重復(fù)。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析，本試驗(yàn)以CuSO4·5H2O和CdCl2配制的濃度梯度為0.0、5.6、10.0、18.0、32.0、56.0 mg/L等6個(gè)梯度等級(jí)，其相應(yīng)的海水中重金屬Cu2+和Cd2+的濃度梯度分別是0.00、1.44、2.56、4.61、8.19、14.34 mg/L和0.00、3.43、6.13、11.04、19.62、34.34 mg/L。觀察兩種重金屬對(duì)光裸方格星蟲(chóng)的單一急性毒性作用。

1.3.2 死亡判定

在強(qiáng)刺激下吻不收縮、身體松軟無(wú)活力，用玻璃棒輕觸或鑷子夾取其吻部或身體，許久不做出反應(yīng)者可判定為死亡個(gè)體[12]。

1.3.3 組織形態(tài)學(xué)觀察

將光裸星蟲(chóng)置于不同濃度的Cu2+和Cd2+重金屬溶液中，觀察其機(jī)體活動(dòng)以及形態(tài)變化，并給予一定強(qiáng)度的刺激，觀察其機(jī)體活力及形態(tài)變化。在進(jìn)行重金屬染毒處理后第24 h、48 h、72 h均需對(duì)各組蟲(chóng)體進(jìn)行瀕死判定。對(duì)于瀕死個(gè)體，及時(shí)解剖并觀察其癥狀，做好相應(yīng)記錄后立即放置在10%甲醛液中進(jìn)行活體組織固定。然后，制作組織切片，觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，求得不同類(lèi)型重金屬分別在48 h和72 h內(nèi)對(duì)光裸方格星蟲(chóng)的半致死濃度(LC50)、95%置信區(qū)間及回歸方程。

2 結(jié)果分析

2.1 中毒癥狀觀察

在Cu2+和Cd2+的染毒實(shí)驗(yàn)組中，光裸方格星蟲(chóng)均出現(xiàn)了中毒現(xiàn)象，同時(shí)其機(jī)體活力發(fā)生明顯的變化。剛放入含重金屬海水中時(shí)，光裸方格星蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)劇烈，隨后出現(xiàn)吻和身體的放松，其吻的伸縮能力明顯降低，并且逐漸變細(xì)、透明度增加，觸手如果伸長(zhǎng)則成菊花狀，此時(shí)蟲(chóng)體活力很弱，對(duì)外界刺激不敏感。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，蟲(chóng)體表現(xiàn)為肌肉極柔軟，直至吻和身體完全舒張，呈松弛狀態(tài)，對(duì)外界刺激不再做出任何反應(yīng)，即死亡。死亡后可見(jiàn)蟲(chóng)體吸水膨脹，也有個(gè)別蟲(chóng)體重金屬中毒后會(huì)吐出體腔液，光裸方格星蟲(chóng)死亡時(shí)在多數(shù)蟲(chóng)體吻端可見(jiàn)紫色團(tuán)狀物，蟲(chóng)體肛門(mén)處外翻且顏色較深。通過(guò)組織切片觀察可見(jiàn)，中毒死亡蟲(chóng)體的纖毛脫食道結(jié)構(gòu)毀壞，肌肉組織損傷等現(xiàn)象。

2.2 急性毒性作用試驗(yàn)結(jié)果

從表1、表2可以看出，光裸方格星蟲(chóng)的平均死亡率隨著這兩種重金屬濃度梯度的增高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，即重金屬對(duì)光裸方格星蟲(chóng)的毒性作用具有明顯的劑量和時(shí)間效應(yīng)。蟲(chóng)體發(fā)生中毒反應(yīng)的速度隨重金屬離子濃度的不同而變化，在接觸含重金屬Cd2+試液約12 h后，56.0 mg/L組首先出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，短時(shí)間內(nèi)就出現(xiàn)死亡；而在低濃度或短時(shí)間內(nèi)，有些蟲(chóng)體中毒反應(yīng)相對(duì)較緩慢，要經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間才會(huì)出現(xiàn)死亡，有的個(gè)體呈“假死”狀態(tài)，長(zhǎng)時(shí)間無(wú)活動(dòng)，但在強(qiáng)烈的刺激下，仍可見(jiàn)緩慢收縮現(xiàn)象。

表1 CuSO4·5H2O對(duì)光裸方格星蟲(chóng)的急性毒性作用結(jié)果

注：各項(xiàng)目的測(cè)試數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。下表同此。

Notes：The test data for each item was the mean±standard deviation(n=3).The same in the following tables.

表2 CdCl2對(duì)光裸方格星蟲(chóng)的急性毒性作用結(jié)果

表3 Cd2+、Cu2+對(duì)光裸方格星蟲(chóng)的急性毒性作用的回歸分析

表3的回歸分析表明，CuSO4·5H2O在48 h和72 h的LC50分別為41.4 mg /L和16.7 mg/L，即 Cu2+在48 h和72 h的LC50分別為10.60 mg /L和4.36mg/L；CdCl2在48 h、72 h對(duì)光裸方格星蟲(chóng)的LC50分別為19.5 mg/L和9.4 mg/L，即Cd2+在48 h、72 h對(duì)光裸方格星蟲(chóng)的LC50分別為11.95 mg/L和5.76 mg/L，表現(xiàn)為在48 h和72 h內(nèi)，Cu2+對(duì)光裸方格星蟲(chóng)的毒性均強(qiáng)于Cd2+。

2.3 重金屬中毒后光裸方格星蟲(chóng)的組織形態(tài)學(xué)變化

由圖1-A可見(jiàn)，光裸方格星蟲(chóng)纖毛(CI)、食道皺襞(EF)等結(jié)構(gòu)均完整，細(xì)胞大小正常，而圖1-B可見(jiàn)纖毛等結(jié)構(gòu)已經(jīng)脫落、皺襞中上皮黏膜層(EMF)大部分已經(jīng)嚴(yán)重脫落；圖1-C可見(jiàn)只剩肌層及外膜(LM)，其余部分均已脫落；圖1-D為正常方格星蟲(chóng)肌肉組織橫切可見(jiàn)角質(zhì)層(C)、上皮(E)、結(jié)締組織層(MF)、環(huán)肌層(RML)、縱肌層(LML)等結(jié)構(gòu)均完整；圖E可見(jiàn)只剩肌層及外膜，其余部分均已脫落；圖F可見(jiàn)其角質(zhì)層(C)及上皮(E)部分破損，環(huán)肌層肌(RML)也可見(jiàn)部分肌纖維損傷。

圖1 光裸方格星蟲(chóng)組織切片觀察結(jié)果

注：CI：纖毛；EF：食道皺襞；EMF：皺襞中上皮黏膜層；AD：外膜；LM：肌肉層；C：角質(zhì)層；E：上皮；MF：結(jié)締組織層；LML：縱肌層??；RML：環(huán)肌層肌。

Notes：CI indicated cilium；EF indicated esophageal folds；EMF indicated epithelial mucosa folds；AD indicated adventitia；LM indicated lamina muscularis；C indicated corneum；E indicatad epithelium；MF indicated muscle fibre；LML indicated longitudinal muscular layer；RML indicated connective tissue layer.

3 討論

正常的光裸方格星蟲(chóng)食道橫切面由內(nèi)到外清晰可見(jiàn)有黏膜[13]、黏膜下層和外膜等結(jié)構(gòu)，其中黏膜層為單層柱狀纖毛上皮細(xì)胞，細(xì)胞核近基部，呈圓形，食道黏膜縱行褶皺呈長(zhǎng)指狀，黏膜下層為疏松結(jié)締組織。光裸方格星蟲(chóng)蟲(chóng)體壁呈半透明狀，由外到內(nèi)依次可分為角質(zhì)層、上皮、結(jié)締組織層、環(huán)肌層、縱肌層和壁體腔膜等6個(gè)部分[14]，這與本試驗(yàn)中的對(duì)照組結(jié)構(gòu)類(lèi)似。

重金屬的毒性主要取決于游離(水合)的金屬離子濃度[15]，如Cd主要取決于游離Cd2+濃度，Cu取決于游離Cu2+及其氫氧化物的量。而重金屬的化學(xué)形態(tài)則取決于它的來(lái)源及其進(jìn)入水體后與水中其他物質(zhì)能夠發(fā)生的相互作用，因而水體中的重金屬形態(tài)會(huì)隨環(huán)境條件的不同而變化。重金屬對(duì)生物組織的急性毒性作用機(jī)理為[16]對(duì)動(dòng)物酶的活性的影響包括誘導(dǎo)和抑制、對(duì)生物大分子、動(dòng)物蛋白質(zhì)和核酸的影響如破壞他們的結(jié)構(gòu)等。近年來(lái)也研究發(fā)現(xiàn)[17]，重金屬除可導(dǎo)致蛋白質(zhì)化學(xué)損傷作用外，亦可誘導(dǎo)生物機(jī)體內(nèi)一些功能蛋白生成，如應(yīng)激蛋白和金屬硫蛋白。但當(dāng)重金屬在生物體內(nèi)累積量超過(guò)體內(nèi)金屬硫蛋白的合成速度時(shí)，多余的重金屬離子就會(huì)與體內(nèi)的其他生物分子，包括酶和核酸等生物大分子相互作用，從而引起中毒現(xiàn)象。光裸方格星蟲(chóng)循環(huán)系統(tǒng)的功能由體腔液擔(dān)任，而且其體液是個(gè)開(kāi)放的組織系統(tǒng)，對(duì)于任何酶活性的變化都會(huì)給整個(gè)系統(tǒng)帶來(lái)影響，因此其機(jī)體對(duì)外界環(huán)境變化的敏感性強(qiáng)。本研究表明，一定劑量的重金屬Cd2+和Cu2+即可導(dǎo)致光裸方格星蟲(chóng)表現(xiàn)出明顯的中毒反應(yīng)甚至死亡，同時(shí)也導(dǎo)致星蟲(chóng)體壁的滲透平衡被破壞，其身體吸水膨脹。這是由于一定劑量的重金屬離子可抑制水生生物酶的活性[10，16]，當(dāng)劑量加大而超過(guò)生物自身的解毒能力時(shí)，則表現(xiàn)出明顯的中毒反應(yīng)甚至死亡。

本研究結(jié)果表明，Cu2+和Cd2+均對(duì)光裸方格星蟲(chóng)有很強(qiáng)的毒性作用，其致死和半致死起始濃度有所差異，方格星蟲(chóng)對(duì)這兩種重金屬離子吸收和耐受能力不同。這種差異表明了Cd作為生物非必需元素，對(duì)光裸方格星蟲(chóng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性，這可能與星蟲(chóng)體內(nèi)Cd硫蛋白的結(jié)合能力有關(guān)。然而，Cu2+在最初反應(yīng)不太明顯，在48 h內(nèi)中低濃度組中毒死亡現(xiàn)象相對(duì)較少，但在72 h后，死亡數(shù)突然增加，光裸方格星蟲(chóng)對(duì)低濃度重金屬離子Cu2+短期內(nèi)的調(diào)節(jié)作用可能與其體內(nèi)的解毒貯存功能有關(guān)，當(dāng)其體內(nèi)重金屬離子積累一定濃度后，將會(huì)使得其體內(nèi)蛋白與重金屬離子結(jié)合而減輕其毒性；但是隨著暴露時(shí)間的增加，體內(nèi)累積重金屬離子濃度增加，這時(shí)蛋白質(zhì)與離子結(jié)合達(dá)到飽和，解毒作用減弱，導(dǎo)致死亡率增加。本研究中，在Cu2+的24 h組的實(shí)驗(yàn)中，死亡率并未隨著處理濃度的升高而增加，但在CuSO4·5H2O處理梯度為18 mg/L 時(shí)而突然增加，其原因可能是由于當(dāng)時(shí)并未意識(shí)到“假死”現(xiàn)象，后來(lái)通過(guò)查閱相關(guān)資料已經(jīng)避免類(lèi)似情況發(fā)生。

隨著Cu2+和Cd2+濃度增加，星蟲(chóng)死亡率呈上升趨勢(shì)。當(dāng)Cu2+濃度為1.43 mg/L時(shí)，光裸方格星蟲(chóng)24 h內(nèi)的死亡率為0；當(dāng)Cu2+濃度>4.61 mg /L時(shí)，48 h和72 h內(nèi)星蟲(chóng)的死亡率均明顯增加。當(dāng)Cd2+濃度>6.13 mg /L 時(shí)，光裸方格星蟲(chóng)48 h和72 h內(nèi)的死亡率明顯增加。Cu2+在48 h對(duì)光裸方格星蟲(chóng)的LC50為10.60 mg /L，Cd2+在48 h的LC50為11.95 mg/L。

此次實(shí)驗(yàn)中的重金屬離子主要是隨著方格星蟲(chóng)采食而進(jìn)入其機(jī)體內(nèi)，所以食道及胃腸道是重金屬離子的主要侵害部位，也是較先受到毒性作用的部位，Michel等[18]在研究光裸方格星蟲(chóng)的消化道結(jié)構(gòu)時(shí)認(rèn)為，其消化酶的分泌主要在下行腸中進(jìn)行，而營(yíng)養(yǎng)的吸收則全部發(fā)生在上行腸的中上段，所以重金屬離子對(duì)蟲(chóng)體消化道的損傷作用在消化道的中上段更為明顯。也有研究認(rèn)為[19]，細(xì)胞損傷的機(jī)理主要是有毒物質(zhì)與膜蛋白相互作用于ATP酶控制的Na+-K+離子的分布，從而造成膜通透性改變，而毒物對(duì)酶的抑制為不可逆性的抑制，因此造成生物體的細(xì)胞損傷。

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Acute toxicity effect of heavy metal Cu2+and Cd2+onSipunculusnudusCHEN

Zhenguo1，BANTinghui1，ZHOUHongkai2*

(1.Bihaiwan Aquatic Science and Technology Co.Ltd.in Zhanjiang，Zhanjiang 524300，China；2.College of Agronomy，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China)

In order to explore the acute toxicity effect of heavy metal ions(Cu2+and Cd2+)onSipunculusnudus，we set six concentration gradients and three processing time to observe mortality and histological test ofSipunculusnudus.The results showed that：1)Sipunculusnuduswere poisoned in certain concentrations of Cu2+and Cd2+.The mortality rate ofSipunculusnudusincreased with the increasing of heavy metal ions concentration and the extension of processing time，which had the obvious dosage and time effect.(2)The Cu2+function of toxicity was greater than that of Cd2+inSipunculusnudus.The LC50values of Cu2+at 48 h and 72 h were 10.60 mg/L and 4.36 mg/L，respectively，and the LC50values of Cd2+at 48 h and 72 h were 11.95 mg/L and 5.76 mg/L,respectively.3)The esophagus and gastrointestinal were the mainly and first part poisoned inSipunculusnudusof heavy metals.

Sipunculusnudus；Cu2+；Cd2+；acute toxicity；median lethal concentration( LC50)

2016-12-02 資助項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(41073059)；湛江市科技招標(biāo)項(xiàng)目(編號(hào)：2011C0102).

陳振國(guó)(1986-)，男，本科，研究方向：海水養(yǎng)殖.E-mail:597255767@qq.com

周鴻凱(1962-)，男，教授，研究方向：生態(tài)環(huán)境安全相關(guān)研究. E-mail: 897961801@qq.com

S968.9

A

1006-5601(2017)02-00090-07

陳振國(guó)，班庭輝，周鴻凱.重金屬Cu2+、Cd2+對(duì)光裸方格星蟲(chóng)的急性毒性效應(yīng)[J].漁業(yè)研究，2017，39(2)：90-96.