賴笑雨，陳金財(cái)，劉訓(xùn)志，高 輝，何 澄#（.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，江西贛州 34000；.贛南醫(yī)學(xué)院，江西贛州 34000）

丹參酮對人工關(guān)節(jié)無菌性松動小鼠氣囊模型中炎癥反應(yīng)的影響

賴笑雨1＊，陳金財(cái)2，劉訓(xùn)志1，高 輝1，何 澄1#（1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，江西贛州 341000；2.贛南醫(yī)學(xué)院，江西贛州 341000）

目的：研究丹參酮對人工關(guān)節(jié)無菌性松動小鼠氣囊模型中炎癥反應(yīng)的影響。方法：將小鼠隨機(jī)分為空白對照組（生理鹽水）、鈦顆粒組（生理鹽水）和丹參酮低、中、高劑量組（50、100、200mg/kg），每組10只。所有小鼠建立氣囊模型，除空白對照組小鼠氣囊內(nèi)注入0.5m L生理鹽水外，其余各組小鼠氣囊內(nèi)均注入0.5m L鈦顆粒懸液（10mg/m L），24 h后按0.1m L/10 g連續(xù)ig相應(yīng)藥物14 d。末次給藥24 h后收集氣囊，肉眼和蘇木精-伊紅染色顯微鏡觀察氣囊炎癥情況，計(jì)算炎癥細(xì)胞密度；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測氣囊組織中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）mRNA表達(dá)量；酶聯(lián)免疫吸附法檢測氣囊組織中TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)量。結(jié)果：與空白對照組比較，鈦顆粒組小鼠氣囊紅腫明顯，可見較多滲出及新生血管，炎癥反應(yīng)嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞密度明顯增加（P＜0.05）；TNF-α、IL-1βmRNA及蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。與鈦顆粒組比較，丹參酮各劑量組小鼠氣囊紅腫減輕，滲出及新生血管減少，炎癥反應(yīng)減輕，炎癥細(xì)胞密度明顯減小（P＜0.05）；TNF-α、IL-1βmRNA及蛋白表達(dá)明顯減弱（P＜0.05），且呈劑量依賴性。結(jié)論：丹參酮可有效抑制人工關(guān)節(jié)無菌性松動小鼠氣囊模型中的無菌性炎癥反應(yīng)。

丹參酮；無菌性松動；氣囊模型；炎性因子；小鼠

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療各種終末期關(guān)節(jié)病變的最后保障，其能有效減輕患者疼痛，維持關(guān)節(jié)功能。然而，隨著使用年限的增加，人工關(guān)節(jié)的磨損顆粒會釋放進(jìn)入關(guān)節(jié)腔隙及周圍滑膜組織，可引起無菌性炎癥和骨溶解，最終導(dǎo)致假體松動[1]。丹參酮是一種治療冠心病的藥物，能通過抑制炎癥因子的釋放有效緩解心絞痛[2]。除此之外，丹參酮還能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、提高骨密度來抑制骨吸收[3]。因此，本文研究了丹參酮對人工關(guān)節(jié)無菌性松動小鼠氣囊（Air-pouch）模型中炎癥反應(yīng)的影響，以期為其用于改善人工關(guān)節(jié)無菌性松動提供參考。

1 材料

1.1 儀器與軟件

Aiprism 7300型定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）儀（美國ABI公司）；TGL-16M型離心機(jī)（金壇市恒豐儀器廠）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；Simple PCI6.0圖像分析軟件（美國C-imaging公司）。

1.2 藥品與試劑

丹參酮對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110867-200406，純度：99.5%）；內(nèi)毒素定量檢測試劑盒（廈門鱟試劑有限公司，批號：CE32545）；鈦顆粒（美國Zimmer公司，批號：YFM 11-U1）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海船夫生物科技有限公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas公司）；DNA marker（北京天為時(shí)代科技有限公司）；Taq DNA聚合酶、脫氧核苷酸三磷酸（dNTPs）和引物（上海生物工程有限公司）。

1.3 動物

50只清潔級昆明種小鼠，♂，10～12周齡，體質(zhì)量25～30 g，由贛南醫(yī)學(xué)院提供，購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)，動物許可證號：SCXK（湘）2015-0002，飼養(yǎng)于贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。對動物的所有處置均符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)要求。

2 方法

2.1 鈦顆粒懸液的制備

將鈦顆粒置于干燥箱中，180℃下干燥6 h，加入75%乙醇浸泡過夜，6 000 r/m in（離心半徑15 cm）離心2 min，棄去上層，再用生理鹽水反復(fù)沖洗、離心（離心條件同上）3次，采用內(nèi)毒素定量檢測試劑盒檢測鈦顆粒中內(nèi)毒素指標(biāo)合格（＜0.1 EU/m L）后，制備成10mg/m L鈦顆粒懸液，備用。

2.2 小鼠氣囊模型的建立

取小鼠，選背部正中線上離尾巴根部2 cm處為進(jìn)針點(diǎn)，消毒后sc 3m L無菌空氣建立初始?xì)饽?，然后每? d sc 1m L無菌空氣至第5天，第6天觀察注射部位若無炎癥反應(yīng)，即表示氣囊模型建立成功。

2.3 分組與給藥

將小鼠隨機(jī)分為空白對照組（生理鹽水）、鈦顆粒組（生理鹽水）和丹參酮低、中、高劑量組（50、100、200 mg/kg），每組10只。所有小鼠建立氣囊模型，除空白對照組小鼠氣囊內(nèi)注入0.5m L生理鹽水外，其余各組小鼠氣囊內(nèi)均注入3m L鈦顆粒懸液，24 h后按0.1m L/10 g連續(xù)ig相應(yīng)藥物14 d。由于人工關(guān)節(jié)無菌性松動的病理過程與骨質(zhì)丟失有關(guān)，因此給藥劑量參考文獻(xiàn)[4]中的劑量設(shè)立。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 肉眼觀察氣囊 末次給藥24 h后，切開小鼠背部皮膚，觀察氣囊周圍結(jié)締組織變化情況，如有無紅腫及血管增生等情況。

2.4.2 蘇木精-伊紅（HE）染色后顯微鏡觀察氣囊 取出氣囊的一半固定于4%多聚甲醛溶液中，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋及修塊、脫蠟、HE染色，最后脫水、透明、封片，置于顯微鏡下觀察。每個(gè)標(biāo)本在400倍視野下，隨機(jī)選取12點(diǎn)方位視野采用Simple PCI6.0圖像分析軟件測量細(xì)胞核的數(shù)目并計(jì)算平均值即為炎癥細(xì)胞密度。

2.4.3 RT-PCR法檢測氣囊組織中TNF-α、IL-1βmRNA表達(dá) 取出氣囊，制成組織勻漿后，取上清液提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR條件為：94℃預(yù)變性3m in，94℃變性30 s，58～59℃退火1m in，72℃延伸5 min，經(jīng)過35個(gè)循環(huán)得出熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（ct）。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，根據(jù)2－ΔΔct法計(jì)算目的基因TNF-α、IL-1βmRNA的相對表達(dá)量，Δct＝目的基因ct－內(nèi)參基因ct。引物序列見表1。

表1 RT-PCR的引物序列Tab 1 RT-PCR p rimer sequences

2.4.4 ELISA法檢測氣囊組織中TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)量 取氣囊組織勻漿，12 000 r/min（離心半徑15 cm）離心10m in，取含有蛋白質(zhì)的上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作檢測，根據(jù)樣品的吸光度計(jì)算出TNF-α、IL-1β的蛋白表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 氣囊肉眼觀察結(jié)果

經(jīng)肉眼觀察可見，空白對照組小鼠氣囊輕度紅腫，少見新生血管。肽顆粒組小鼠氣囊紅腫明顯，可見較多滲出及新生血管。丹參酮各劑量組小鼠氣囊紅腫和新生血管情況介于空白對照組與肽顆粒組之間，效果呈劑量依賴性。各組小鼠氣囊囊壁的肉眼觀察結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠氣囊囊壁的肉眼觀察結(jié)果Fig 1 Observation results of air-pouch wall of m ice by eyes in each group

3.2 氣囊HE染色后顯微鏡觀察結(jié)果

空白對照組小鼠氣囊囊壁炎癥反應(yīng)輕，周圍軟組織中以成纖維細(xì)胞為主，炎性細(xì)胞密度為（2 909.53± 264.57）個(gè)/mm2。與空白對照組比較，鈦顆粒組小鼠氣囊囊壁炎性反應(yīng)明顯，可見大量炎癥細(xì)胞及注入的磨損顆粒，炎癥細(xì)胞密度明顯增加[（5 324.34±323.74）個(gè)/mm2，P＜0.05）。丹參酮各劑量組小鼠氣囊囊壁炎癥反應(yīng)介于空白對照組和鈦顆粒組之間。與鈦顆粒組比較，丹參酮低、中、高劑量組小鼠氣囊中炎癥細(xì)胞密度明顯減小[（4 563.35±313.43）、（4 117.08±297.47）、（3 783.07± 289.46）個(gè)/mm2，P＜0.05]，其中高劑量組較低、中劑量組減小更明顯（P＜0.05）。各組小鼠氣囊囊壁的組織切片圖見圖2。

圖2 各組小鼠氣囊囊壁的組織切片圖（HE，×400）Fig 2 Tissue slices of air-pouch wall of m ice in each group（HE，×400）

3.3 氣囊組織中TNF-α、IL-1βm RNA及蛋白的表達(dá)

與空白對照組比較，鈦顆粒組和丹參酮各劑量組小鼠氣囊組織中TNF-α、IL-1βmRNA及蛋白表達(dá)均增強(qiáng)（P＜0.05）；與鈦顆粒組比較，丹參酮各劑量組小鼠氣囊組織中TNF-α、IL-1βmRNA及蛋白表達(dá)均減弱（P＜0.05），其中高劑量組較低、中劑量組降低更明顯（P＜0.05）。各組小鼠氣囊組織中TNF-α、IL-1βmRNA及蛋白的表達(dá)量見表2。

表2 各組小鼠氣囊組織中TNF-α、IL-1βm RNA及蛋白的表達(dá)量（±s，n＝10）Tab 2 m RNA and protein expression of TNF-α，IL-1βin air-pouch tissue of m ice in each group（±s，n＝10）

表2 各組小鼠氣囊組織中TNF-α、IL-1βm RNA及蛋白的表達(dá)量（±s，n＝10）Tab 2 m RNA and protein expression of TNF-α，IL-1βin air-pouch tissue of m ice in each group（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與鈦顆粒組比較，#P＜0.05；與丹參酮低、中劑量組比較，ΔP＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.titanium particle group，#P＜0.05；vs.tanshinone low-dose，medium-dose groups，ΔP＜0.05

組別空白對照組鈦顆粒組丹參酮低劑量組丹參酮中劑量組丹參酮高劑量組蛋白55.20±4.38 112.60±5.75＊105.40±5.31＊#99.52±4.45＊#87.63±4.38＊#ΔTNF-α mRNA 1.20±0.56 5.00±1.27＊4.37±1.22＊#4.06±1.17＊#2.96±1.48＊#Δ蛋白57.43±5.76 139.80±6.68＊131.47±6.54＊#124.08±5.70＊#109.47±5.41＊#ΔIL-1β mRNA 1.10±0.43 7.45±1.76＊6.02±1.63＊#5.36±1.71＊#3.90±1.65＊#Δ

4 討論

本文選用的氣囊模型已被證明能成功地進(jìn)行磨損微粒致無菌性松動的機(jī)制分析[5]。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室分析所取的氣囊囊壁，內(nèi)附注射的鈦顆粒，能有效模擬無菌性松動造成的假體周圍微環(huán)境[6]。炎癥因子TNF-α、IL-1β也是公認(rèn)的評價(jià)炎性反應(yīng)的指標(biāo)[7]。因此本實(shí)驗(yàn)對探討藥物改善人工關(guān)節(jié)無菌性松動的研究具有充分的可行性。

磨損產(chǎn)生的鈦顆粒長期刺激假體周圍組織，使其產(chǎn)生慢性肉芽腫性炎癥反應(yīng)。此炎癥反應(yīng)可使假體與骨之間形成一種炎性界膜，界膜組織中的破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞等長期受到鈦顆粒的刺激，釋放出大量溶骨性介質(zhì)及趨化因子[8]，主要包括TNF-α、IL-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶9、蛋白激酶K、核因子κB（NF-κB）受體活化因子（RANK）、前列腺素等[9]。上述炎癥介質(zhì)釋放的增加，不僅能促進(jìn)破骨前體細(xì)胞分化成熟，增加破骨細(xì)胞的數(shù)量，導(dǎo)致骨吸收[10]；還能作用于自身，使炎癥細(xì)胞局部浸潤性增強(qiáng)，通過自分泌及旁分泌作用致使更多的巨噬細(xì)胞在假體周圍聚集，放大炎癥反應(yīng)的效果；不僅如此，這些炎性介質(zhì)還能激活RANK/ RANK配體（RANKL）通路，導(dǎo)致更多的巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，進(jìn)一步加劇骨吸收活性[11]。這些級聯(lián)反應(yīng)促成了無菌性炎癥和骨溶解，最終誘發(fā)人工關(guān)節(jié)無菌性松動。目前研究證實(shí)，在髖膝關(guān)節(jié)翻修術(shù)中，因?yàn)闊o菌性松動導(dǎo)致的假體植入失敗的比例已達(dá)60%左右[12]，由此可見，抑制鈦顆粒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)已經(jīng)成為預(yù)防甚至治療人工關(guān)節(jié)無菌性松動的可行之路[13]。

丹參酮又名總丹參酮，是從中藥丹參（唇形科植物丹參根）中提取出的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，是丹參的主要有效活性成分之一，具有抗血小板聚集、抗動脈硬化、抗感染和降低血脂等作用[14]。沈迎念等[15]發(fā)現(xiàn)，在治療主動脈瓣鈣化過程中丹參酮能有效抑制TNF-α、1L-1β的表達(dá)。BaiY等[16]證明了丹參酮能通過抑制NF-κB信號通路來治療結(jié)腸癌。除此之外，F(xiàn)an G等[17]的研究結(jié)果也表明，丹參酮能通過抑制TNF-α、IL-1β等炎癥因子及NF-κB信號通路，有效抑制脂多糖誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。在人工關(guān)節(jié)無菌性松動中，NF-κB信號被激活后，可引起單核巨噬細(xì)胞在假體周圍廣泛聚集，進(jìn)一步分化成為破骨細(xì)胞，造成假體周圍破骨細(xì)胞數(shù)量增加。甚至NF-κB本身也能促使破骨細(xì)胞前體向破骨細(xì)胞分化，同時(shí)具有維持破骨細(xì)胞生存的作用[18]。而丹參酮不僅能抑制TNF-α、IL-1β等炎癥因子的釋放，還能阻斷NF-κB信號通路，這些因素的共同作用都可抑制破骨細(xì)胞激活，從而抑制假體周圍骨溶解的發(fā)生，延緩人工關(guān)節(jié)無菌性松動的發(fā)生及發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹參酮能有效抑制人工關(guān)節(jié)無菌性松動過程中的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，有效干預(yù)人工關(guān)節(jié)無菌性松動的病變過程，為將來使用藥物預(yù)防假體植入失敗提供了理論依據(jù)。

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（編輯：鄒麗娟）

Effect of Tanshinone on Inflammatory Response in Air-pouch M odel M ice w ith Artificial Joint Aseptic Loosening

LAIXiaoyu1，CHEN Jincai2，LIU Xunzhi1，GAO Hui1，HE Cheng1（1.Dept.of Orthopedics，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Jiangxi Ganzhou 341000，China；2.Gannan Medical University，Jiangxi Ganzhou 341000，China）

Tanshinone；Aseptic loosening；Air-pouchmodel；Inflammatory factor；M ice

R687

A

1001-0408（2017）13-1780-04

2016-08-09

2016-10-24）

＊主治醫(yī)師，碩士。研究方向：人工關(guān)節(jié)無菌性松動。電話：0797-8266017。E-mail：562213821@qq.com

#通信作者：副主任醫(yī)師。研究方向：人工關(guān)節(jié)無菌性松動。電話：0797-8269507。E-mail：jxgzhecheng@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.15

ABSTRACTOBJECTIVE：To study the effect of tanshinone on inflammatory response in air-pouch model mice w ith artificial joint aseptic loosening.METHODS：M ice were random ly divided into blank control group（normal saline），titanium particle group（normal saline），tanshinone low-dose，medium-dose，high-dose groups（50，100，200 mg/kg），10 in each group.Air-pouch modelswere induced.Except thatmice were injected 0.5 m L normal saline into air-pouch in blank control group，other groups were injected 0.5 m L Titanium particle suspension（10 mg/m L）into air-pouch，continuously administrated medicines by 0.1 m L/10 g after 24 h，ig，for 14 d.After 24 h of last administration，the air-pouch was collected，air-pouch inflammation was observed by eyes and by m icroscopy after hematoxylin-eosin staining，and inflammatory cell density was calculated.Real-time quantitative polymerase chain reactionmethod was conducted to detect the tumor necrosis factorα（TNF-α），interleukin 1β（IL-1β）mRNA expression；enzyme-linked immunosorbentmethod was used to detect the TNF-α，IL-1βprotein expression.RESULTS：Compared w ith blank control group，air-pouch swelling was obvious in titanium particle group，much exudation and neovascular were observed，inflammatory response was severe，inflammatory cell density was increased significantly（P＜0.05）；TNF-α，IL-1βmRNA and protein expression were obviously enhanced（P＜0.05）.Compared w ith titanium particle group，air-pouch swelling was relieved in tanshinone doses groups，exudation and neovascular were decreased，inflammatory response was relieved，inflammatory cell density was decreased significantly（P＜0.05）；TNF-α，IL-1βmRNA and protein expression were obviously decreased（P＜0.05），w ith a dose-dependentmanner.CONCLUSIONS：Tanshinone can effectively inhibit the aseptic inflammatory response in air-pouch model m ice w ith artificial joint aseptic loosening.