宋少波，張華，付海麗，張雯，李偉

（天津工業(yè)大學省部共建分離膜與膜過程國家重點實驗室，天津 300387）

1-羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲/氧化石墨烯納米材料制備及其抗菌性能

宋少波，張華，付海麗，張雯，李偉

（天津工業(yè)大學省部共建分離膜與膜過程國家重點實驗室，天津 300387）

通過接枝改性氧化石墨烯（GO）制備了1-羥甲基-5，5-二甲基乙內(nèi)酰脲/氧化石墨烯（1-MDMH/GO）納米材料。利用FTIR、XRD、XPS、SEM和AFM等方法對1-MDMH/GO納米材料的結(jié)構(gòu)和性能進行了表征。分別用金黃色葡萄球菌（S. cereus）和大腸桿菌（E. coli）為模擬體系對納米復合物的抗菌性進行檢驗，通過抑菌環(huán)和平板計數(shù)法測定復合物的抗菌性能。結(jié)果顯示：1-羥甲基-5，5-二甲基乙內(nèi)酰脲（1-MDMH）成功地接枝到GO上，并且得到的GO和1-MDMH/GO皆為片狀結(jié)構(gòu)組成的二維單層納米材料，具有大的比表面積，其中1-MDMH/GO復合物的層間距較GO增大0.124nm。細菌與復合物接觸24h后，1-MDMH/GO對S. cereus的抗菌率為97.9%，對E. coli的抗菌率為92.4%。較之GO，相同條件下其對上述兩種細菌有更好的抑制能力，抗菌率分別提高了25.0%和33.3%。

氧化石墨烯；鹵銨鹽；協(xié)同作用；抗菌；納米材料

石墨烯具有大的比表面積、優(yōu)異的電學、力學、熱學和光學性質(zhì)以及穩(wěn)定的化學性能等特點，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型材料[1-5]。2010年，上海應用物理所HU等[6]首次發(fā)現(xiàn)了石墨烯材料的抗菌作用，立即引起了科學界的廣泛興趣。進一步研究其抗菌機理，結(jié)果表明其尖銳的邊緣對大腸桿菌細胞膜具有破壞作用[7-9]。這種物理抗菌機理表明其抗菌過程中細菌不易產(chǎn)生抗藥性[10-13]，表明石墨烯是一種具有廣闊前景的新型抗菌材料。但是其抗菌范圍（抗菌廣譜性）受到限制，對其進行化學改性可進一步提高其抗菌性能。

抗菌劑[14-15]種類繁多，其中以1-羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲（1-MDMH）為代表的高分子鹵銨鹽[16]抗菌劑具有抗菌廣譜性、低毒性、便于改性等優(yōu)點使其備受青睞[17-18]。但其單獨使用時抗菌藥用劑量大，不宜直接被固載在各種材料上。把鹵胺抗菌劑和納米技術(shù)有機結(jié)合，有望應用在功能纖維、水消毒、涂料、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域。

JIANG等[19]將納米銀顆粒負載到氧化石墨烯（GO）上制備出了GO-Ag復合材料，進一步研究表明石墨烯能夠吸附在細菌細胞表面，使納米銀能容易地進入細胞內(nèi)，進一步提高殺菌性能；MARTA等[20]將殼聚糖、納米銀和GO制備形成新型復合物，三者協(xié)同的抗菌性能遠高于單一的GO。本研究通過GO與1-MDMH間反應制備了具有良好抗菌性能的1-MDMH/GO復合材料，并對復合材料的微觀結(jié)構(gòu)和性能進行了表征。通過對GO的改性，進一步提高其抗菌性能，有效地擴展了石墨烯的應用領(lǐng)域。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

1-羥甲基-5,5-二甲基乙內(nèi)酰脲（1-MDMH）、4-二甲氨基吡啶、二環(huán)己基碳二亞胺，購自日本東京化成工業(yè)株式會社；次氯酸鈉為分析純，天津市福晨化學試劑廠；二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺均為分析純，天津市光復科技發(fā)展有限公司；石墨粉（Gt，粒徑=320目），購自阿拉??；蛋白胨、酵母浸膏粉和瓊脂粉均為生化試劑，天津市光復精細化工研究所；金黃色葡萄球菌（S. aureus）和大腸桿菌（E. coli）由天津醫(yī)科大學提供。

1.2 實驗過程

1.2.1 GO的制備

將40mL濃硫酸加入到250mL的三口燒瓶中，加熱至90℃，機械攪拌，同時加入4g五氧化二磷和4g過硫酸鉀，將溫度降至80℃，再加入5g Gt。恒溫反應4.5h，冷卻至室溫，加入200mL蒸餾水，靜置過夜，過濾，烘干，即可得到預氧化石墨。

將250mL三口燒瓶置于冰水浴中，加入57.5mL濃硫酸，機械攪拌，加入0.5g硝酸鈉和2.5g預氧化石墨片，待固體溶解后，緩慢加入5g高錳酸鉀，反應30min，再升溫至35℃反應90min。最后加入350mL蒸餾水升溫至95℃，反應15min，將反應物轉(zhuǎn)移至2000mL的燒杯中，滴加12.5mL 30%的過氧化氫溶液，過濾，得到枯黃色固體，加入10mL 10%稀鹽酸洗滌，離心，冷凍干燥。

1.2.2 1-MDMH/GO的制備

稱取0.1g GO置于250mL燒杯內(nèi)，加入150mL二氯甲烷，超聲振蕩40min，再將上述溶液轉(zhuǎn)移于250mL三口燒瓶中并加入1g 4-二甲氨基吡啶、0.1g二環(huán)己基碳二亞胺與0.3g 1-MDMH，迅速放入恒溫60℃的水浴鍋中，氮氣保護，攪拌，反應12h。除去上層清液，洗滌，再用10mL次氯酸鈉溶液浸泡，洗滌，抽濾，冷凍干燥。

1.3 性能測試與表征

采用德國Bruker Uecior 22傅里葉變換紅外光譜儀對GO和1-MDMH/GO樣品從4000～400cm–1進行掃描。采用日本Rigaku公司D/MAX 2500型X射線衍射儀（XRD）測試樣品層間距，使用Cu靶輻射源（λ=0.154nm），Ni濾波片，掃描范圍4°～80°，掃描速率0.1°/s，管電壓 50kV，管電流35mA。將樣品精細研磨，然后加入到樣品板孔里，采用島津/Kratos的X光電子能譜儀AXIS Supra測試表面C、N、O的含量。采用日本日立公司Hitachi S-4800型掃描電鏡（SEM）對樣品表面的形貌進行觀察。AFM是將事先準備好的1-MDMH/GO在乙醇溶液中分散，用微量的注射泵取樣，然后滴到云母片上，置于紅外燈下進行干燥，采用美國SPM-5500型原子力顯微鏡掃描樣品的表面結(jié)構(gòu)。

1.4 抗菌性能

1.4.1 抑菌環(huán)

將GO和1-MDMH/GO兩種物質(zhì)壓片，采用抑菌圈法測定兩種物質(zhì)的抗菌性。無菌條件下，每組制作3個平行固體培養(yǎng)基，將S. cereus和E. coli置于固體培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)24h后，通過觀察抑菌圈的大小判斷抗菌劑的抗菌能力。

1.4.2 平板計數(shù)法

取5支已滅菌的離心管，分別加入20mL培養(yǎng)液與濃度約為107cfu/mL的S. cereus或E. coli菌懸液，再分別向后4支離心管中加入GO、1-MDMH/GO、氨芐青霉素（陽性對照）、磷酸鹽緩沖液（PBS陰性對照，pH=7.4）各0.1g，培養(yǎng)24h后，分別逐級稀釋，對不同混合物的試液，選取3個不同濃度梯度菌液各0.2mL分別鋪平板，在37℃固體培養(yǎng)基下培養(yǎng)24h后，進行平板計數(shù)，從而得到各試液的活菌數(shù)（平行3組實驗），抗菌率按式(1)計算。

1.4.3 電鏡觀察

分別稱取0.1g GO與1-MDMH/GO，再分別加入20mL菌懸液濃度為107cfu/mL 的S. cereus和E. coli液體培養(yǎng)液，于37℃恒溫搖床中振蕩24h后取出離心，傾去上層清液，用2.5%戊二醛固定，再用不同濃度梯度的乙醇溶液逐級洗脫，干燥，噴金，用SEM觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 1-MDMH/GO的化學組成

圖1為GO和1-MDMH/GO的紅外光譜圖。如圖所示：a，b兩曲線在3430cm–1、1650cm–1、1100cm–1、1050cm–1處出現(xiàn)O－H、C==C、C(O)O、C－C伸縮振動峰，它們屬于GO的特征吸收峰。相較與曲線a，曲線b在1712cm–1處出現(xiàn)N—H的伸縮振動吸收峰和1340cm–1、1280cm–1處出現(xiàn)的C－N伸縮振動吸收峰，這些特征峰都屬于1-MDMH/GO的特征振動吸收峰，并且在1775cm–1處出現(xiàn)C==O的伸縮振動峰，表明GO成功接枝到了1-MDMH上。

2.2 1-MDMH/GO的晶體結(jié)構(gòu)

圖2為GO和1-MDMH/GO的X射線衍射圖。如圖所示：與曲線a在2θ=10.7°處（d=0.826nm）出現(xiàn)一個很強的特征衍射峰相比，曲線b上（002）晶面特征衍射峰出現(xiàn)在2θ=9.3°處（d=0.950nm），圖形向左移動，表明界面間距得到增大，增大了0.124nm。這是因為通過酯化反應1-MDMH成功地接枝到了GO的表面，使得其層間距進一步增加。

圖1 GO和1-MDMH/GO的傅里葉變換紅外光譜圖

圖2 GO和1-MDMH/GO的X射線衍射譜圖

2.3 1-MDMH/GO的表面組成

圖3為GO和1-MDMH/GO的X射線光電子能譜圖。如圖3(a)所示，GO結(jié)合能在284.4eV和531.5eV處分別出現(xiàn)了碳峰和氧峰，這是因為經(jīng)過修正Hummers法制備得到的GO上存在大量的氧化基團如羥基、羧基等。與圖3(a)相比，圖3(b)在結(jié)合能398.8eV處出現(xiàn)的氮峰屬于接枝反應物1-MDMH，也進一步說明1-MDMH/GO制備成功。與GO中的氧含量相比，1-MDMH/GO中的氧含量由28.1%增加到35.5%，主要原因是GO表面上的羧基反應成了酯基，氧化程度得到進一步的增大，另一個原因是因為1-MDMH高的含氧量，也使1-MDMH/GO的含氧量上升。

2.4 1-MDMH/GO的表面形貌

圖4為Gt、GO以及1-MDMH/GO的掃描電鏡圖。如圖所示： Gt片層堆積嚴重，表面平整；GO經(jīng)過高溫氧化片層變薄，表面出現(xiàn)明顯褶皺；而通過接枝后，1-MDMH/GO表面形貌發(fā)生變化，褶皺更加明顯并且出現(xiàn)一些小凸起。更多的褶皺會使其層間距變大，和XRD數(shù)據(jù)相對應。

2.5 1-MDMH/GO的微觀形貌

圖3 GO和1-MDMH/GO的X射線光電子能譜圖

圖4 Gt、GO以及1-MDMH/GO的掃描電鏡圖

圖5 GO以及1-MDMH/GO的原子力顯微鏡圖

圖5為GO與1-MDMH/GO原子力顯微鏡照片。由圖5(a)中可以看出GO為片狀單層結(jié)構(gòu)，片層厚度為0.9nm，半徑大于2μm，說明具有大的比表面積的單層GO已制備成功。由圖5(b)可以看出1-MDMH/GO亦為片狀單層結(jié)構(gòu)且較GO的片層厚度增加，增加至1.1nm，這是因為 1-MDMH接枝到GO上的原因。而1-MDMH/GO片層半徑較GO的半徑有所減小，這是因為接枝反應過程中GO邊緣被破壞。

2.6 抗菌性能

圖6是GO和1-MDMH/GO對S. cereus和E. coli的抑菌圈照片。由圖6可見：GO對S. cereus和E. coli的抑菌圈均不及1-MDMH/GO的抑菌圈明顯，表明1-MDMH與GO復合后，起到了協(xié)同抗菌的作用，提高了復合物的抗菌性能。其中1-MDMH/GO對S. cereus的抑菌圈直徑大于E. coli的抑菌圈直徑，這是因為S. cereus更薄的細胞壁更容易被刺破而失去活性。

從表1數(shù)據(jù)看出，GO和1-MDMH/GO兩種物質(zhì)與兩種細菌接觸24h后，GO對S. cereus的抑菌率可達78.3%，對E. coli的抗菌率可達69.3%，而1-MDMH/GO對兩者的抗菌率分別為97.9%和92.4 %，說明1-MDMH/GO協(xié)同作用具有更好的抗菌效果。

2.7 1-MDMH/GO復合材料抗菌觀察

圖7(a)為正常的S. cereus照片，圖7(d)為正常的E. coli，分別呈現(xiàn)球形和棒狀，細菌邊界較清晰。圖7(b)和圖7(e)分別為S. cereus和E.coli與GO接觸24h后的掃描電鏡照片，由圖7(b)可以看到S. cereus部分被GO包覆發(fā)生了變形。而圖7(e)可以看出在與GO接觸24h后，E.coli表面開始發(fā)生凹陷。圖7(c)和圖7(f)分別為S. cereus和E. coli與1-MDMH/GO接觸24h后的掃描電鏡照片?？煽闯鯯. cereus開始出現(xiàn)聚集及融合，且邊界逐漸模糊，而E. coli與復合物接觸24h的掃描電鏡照片，菌體已發(fā)生嚴重的變形和皺縮，部分細菌粘連在一起，已失去原有形態(tài)。上述情況的出現(xiàn)表明復合材料協(xié)同抗菌比單一GO的抗菌性更強，對細菌細胞壁有更好的刺破能力，使得細胞壁被破壞，細胞質(zhì)流出，使細菌失去活性。

表1 GO 和 1-MDMH/GO 的抑菌率（n=3）

圖6 GO和1-MDMH/GO對S. cereus和E. coli的抑菌圈

圖7 1-MDMH/GO處理前、后S. cereus和E. coli的電鏡照片

3 結(jié)論

（1）通過接枝改性GO成功制得1-MDMH/GO納米材料，而1-MDMH/GO納米材料表面產(chǎn)生形貌變化，出現(xiàn)大量凸起。

（2）電鏡照片表明所制得的1-MDMH/GO較GO納米材料的粒徑尺寸降低，但1-MDMH/GO納米材料層間距比GO增大0.124nm。

（3）1-MDMH/GO對S. cereus的抗菌率可達97.9%，對E. coli的抗菌率為92.4%。較之GO，其細菌抑制能力分別提高了25.0%和33.3%。

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Preparation and antibacterial activity of 1-hydroxy methyl-5，5-dimethylhydantoin/graphene oxide nanocomposites

SONG Shaobo，ZHANG Hua，F(xiàn)U Haili，ZHANG Wen，LI Wei
（State Key Laboratory of Separation Membranes and Membrane Processes，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300387，China）

By grafting modification of graphene oxide on the reaction，we prepared 1-hydroxy methyl-5,5-dimethylhydantoin/graphene oxide（1-MDMH/GO）nanomaterial. The structure and properties of 1-MDMH/GO was analyzed with Fourier transform infrared spectrophotometer，X-ray diffraction spectroscopy，X-ray photoelectron spectroscopy，scanning electron microscope and atomic force microscope. The antibacterial property of compound was separately tested using Staphylococcus aureus（S. cereus）and Escherichia coli（E. coli）as model system and analyzed by using bacteriostatic ring and plate count methods. The results showed that，1-hydroxy methyl-5，5-dimethylhydantoin was successfully grafted onto the graphene oxide（GO）and 1-MDMH/GO and GO were of single-layer nanosheet structure with large specific surface. The layer spacing of the composite was increased by 0.124nm compared with GO. After being contacted with the two bacteria for 24h，the bacteriostatic rate of the 1-MDMH/GO reached 97.9% for S. cereus and 92.4% for E. coli，which had enhanced by 25.0%and 33.3% respectively，compared with GO under the same condition.

graphene oxide（GO）；ammonium halide；synergistic effect；antimicrobial；nanomaterials

TB34

：A

：1000–6613（2017）05–1831–07

10.16085/j.issn.1000-6613.2017.05.034

2016-09-20；修改稿日期：2017-01-11。

國家自然科學基金（51573135）、省部共建分離膜與膜過程國家重點實驗室（天津工業(yè)大學）開放課題（Z2-201560）及天津市高等學?？萍及l(fā)展基金（20140305）項目。

宋少波（1990—），男，碩士研究生，研究方向為納米材料。聯(lián)系人：張華，教授，碩士生導師，研究方向為納米材料。E-mail：hua1210@126.com。