楊 璐，杜巖新，徐利娟，黃建新

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710069)

土壤微生態(tài)環(huán)境對櫻桃樹“黑疙瘩”病發(fā)生的影響①

楊 璐，杜巖新，徐利娟，黃建新*

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710069)

研究陜西“黑疙瘩”病櫻桃樹根際土壤微生態(tài)環(huán)境，分析其對櫻桃樹“黑疙瘩”病發(fā)病的影響，可為后期防治工作提供理論和實(shí)踐依據(jù)。本研究采用傳統(tǒng)微生物學(xué)、分子生物學(xué)及生物化學(xué)相結(jié)合的方法，對陜西白鹿原發(fā)病櫻桃樹根際土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性及可培養(yǎng)微生物數(shù)量、優(yōu)勢細(xì)菌種類與健康櫻桃樹根際的差異進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：健康櫻桃樹根際土壤全磷、速效鉀、有效磷、堿解氮平均含量高于病株根際，土壤有機(jī)碳含量低于病株根際，而土壤全氮、全鉀含量及pH根際間差異不顯著；健康櫻桃樹根際土壤蛋白酶、脲酶、轉(zhuǎn)化酶及多酚氧化酶活性高于病株根際，而脫氫酶和過氧化氫酶活性低于病株根際。土壤根際微生物分析表明，健康櫻桃樹根際土壤的可培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌數(shù)量顯著高于病株根際，尤其是優(yōu)勢細(xì)菌種類及數(shù)量；而霉菌平均數(shù)量則相反，但差異不顯著。因此，根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌的減少及優(yōu)勢細(xì)菌分布不均，以及速效養(yǎng)分的減少、酶活性的降低可能是影響櫻桃樹“黑疙瘩”病發(fā)生的原因之一。

櫻桃樹；黑疙瘩?。煌寥牢⑸鷳B(tài)環(huán)境

櫻桃(Cerasus pseudocerasus)，某些李屬類植物的統(tǒng)稱，因其果實(shí)外表晶瑩剔透、色澤鮮艷且富含多種營養(yǎng)元素，作為水果食用備受人們的喜愛。國內(nèi)現(xiàn)已有許多大型櫻桃產(chǎn)地，陜西白鹿原萬畝櫻桃園就是其一，櫻桃產(chǎn)業(yè)已成為陜西農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要支柱。但近年來該地區(qū)的櫻桃樹出現(xiàn)一種嚴(yán)重的病害，癥狀為地上樹干、樹枝及分叉處木質(zhì)部凸起形成深褐色、黑色瘤狀病斑并伴有流膠現(xiàn)象。實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)該癥狀是已有研究報(bào)道中的根癌病、流膠病以及枝枯病癥狀的綜合。其與根癌病最為相似，但兩者發(fā)病部位不同，根癌病發(fā)病部位主要集中在近表土樹根部，樹枝上少有[1]，但陜西白鹿原所發(fā)現(xiàn)的病害樹根部感染極少，且經(jīng)調(diào)查多年來農(nóng)民按照冠癭病所進(jìn)行的治療是無效的，當(dāng)?shù)剞r(nóng)民根據(jù)病狀的表征稱其為“黑疙瘩”病。該病害傳播速度快，同一果園在3年內(nèi)感染率高達(dá)80%，減產(chǎn)20% 以上，嚴(yán)重時甚至出現(xiàn)毀園現(xiàn)象。因其病狀特殊，故下文中也稱其為“黑疙瘩”病。

根際土壤微生態(tài)環(huán)境與植物健康狀況之間的關(guān)系已成為近年來研究的熱點(diǎn)。已有研究表明，果樹根際土壤狀況與果樹的抗逆性和病害的發(fā)生密切相關(guān)[2]。由于目前陜西櫻桃樹這種病害產(chǎn)生的原因尚無定論，因此，本研究擬通過分析病害園(發(fā)病率高達(dá)90%)與健康園(發(fā)病率為0)櫻桃樹根際土壤的理化特征、酶活性，以及可培養(yǎng)微生物數(shù)量、優(yōu)勢細(xì)菌的種類差異來分析病狀發(fā)生的可能原因，以期為防治櫻桃病害提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品的采集與處理 土壤樣品在2014年7月采集于陜西省白鹿原櫻桃園(108°59′ ～ 109°16′E，34°10′ ～ 34°27′N)。選取連作6年紅燈櫻桃品種的兩個櫻桃園，健康園(約0.2 hm2)位于龍灣村，發(fā)病率為 0；病害園位于西塘村田園櫻桃標(biāo)準(zhǔn)示范園(約1 hm2)，發(fā)病率約90% 以上。兩個櫻桃園在地理位置上相隔約10 km，土壤均為黃土類型。采用五點(diǎn)取樣法分別對櫻桃健康園和病害園中各 7株櫻桃樹采集其根際土壤[3]，健康園樣品編號為J1 ～ J7；病害園均為病情嚴(yán)重植株，編號為B1 ～ B7。采集的土樣分別放于滅菌平皿中并用保鮮袋獨(dú)立包裝，快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，放于–4 ℃冰箱中保存。

1.1.2 所用培養(yǎng)基[4]牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于細(xì)菌分離培養(yǎng)；高氏1號培養(yǎng)基(加入1% 的苯酚溶液)用于放線菌分離培養(yǎng)；馬丁氏培養(yǎng)基用于真菌的分離培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 根際土壤理化性質(zhì)的測定 依據(jù)《土壤農(nóng)化分析》[5]分別測定健康與患病櫻桃樹根際土壤有機(jī)碳、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷、速效鉀的含量；按照《土壤質(zhì)量——pH的測定(ISO 10390: 2005)》分別測定根際土壤pH。

1.2.2 根際土壤酶活性的測定 土壤中積累的酶種類很多，本研究主要檢測與植物生長相關(guān)的6種酶類：過氧化氫酶(CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法測定[6]，以1 g土壤消耗0.1 mol/L高錳酸鉀(對照與試驗(yàn)滴定的差) 的體積(ml)來表示；脲酶活性采用苯酚鈉–次氯酸鈉比色法測定[6]，以1 g土壤產(chǎn)生NH3-N的質(zhì)量(mg)來表示；轉(zhuǎn)化酶活性采用Na2S2O3滴定法測定[6]，以1 g土壤消耗0.1 mol/L硫代硫酸鈉(對照與試驗(yàn)滴定的差)的體積(ml)來表示；多酚氧化酶(PPO)活性采用鄰苯三酚比色法測定[6]，以1 g土壤產(chǎn)生的 棓紅紫 精(purpurogallin)的質(zhì)量來表示；脫氫酶(DHA)活性采用TTC法測定，以1 g土壤產(chǎn)生的三苯基甲 臜質(zhì)量(mg)來表示[6]。蛋白酶活性采用的改良茚三酮法測定，以 1 g土壤 50℃培養(yǎng) 2 h產(chǎn)生的NH2-N 質(zhì)量(mg)來表示[7]。

1.2.3 根際土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量及優(yōu)勢種群的測定 土樣于無菌水中梯度稀釋，以平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行微生物數(shù)量計(jì)數(shù)：細(xì)菌選取稀釋度為10–4～ 10–6；放線菌稀釋度為 10–3～ 10–5；霉菌稀釋度為 10–3～10–5，每組設(shè)置 3個重復(fù)。30℃恒溫培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)2 d、放線菌培養(yǎng)6 d、霉菌培養(yǎng)4 d，觀察結(jié)果并記錄。

優(yōu)勢細(xì)菌為最大梯度(均為10–6)平板菌落，分別挑取平板所有菌落并純化，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[8]及《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]對純化的優(yōu)勢細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定歸類。同時提取不同菌落 DNA，以細(xì)菌16S rDNA 引物27F和1495R對提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，送上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI上BLAST鑒定。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用 Microsoft Office、Origin等軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并繪圖；用SPSS 20.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 健康園與病害園櫻桃樹根際土壤理化性質(zhì)差異

經(jīng)測定，健康與患病櫻桃樹根際土壤的pH均在6.8 ～ 7.5，二者差異不顯著。其根際土壤的主要營養(yǎng)元素含量測定結(jié)果見圖1。由圖1E、F、D、B可見：健康園櫻桃樹根際土壤全磷、有效磷、速效鉀、堿解氮的平均含量高于病害園櫻桃樹根際，且分別是其平均含量的1.17倍、1.26倍、1.42倍、1.07倍；健康園櫻桃樹根際土壤有機(jī)碳平均含量明顯低于病害園櫻桃樹根際(圖1G)；兩園根際土壤的全氮、全鉀含量差異并不顯著(圖 1A、C)。由此可見，病害嚴(yán)重的櫻桃樹根際土壤中植物可直接利用的營養(yǎng)元素相對健康櫻桃樹根際呈現(xiàn)減少的趨勢。

2.2 健康園與病害園櫻桃樹根際土壤酶活性差異

根際土壤酶來源于微生物細(xì)胞產(chǎn)生釋放的外酶、內(nèi)酶及一些結(jié)構(gòu)酶類，是土壤新陳代謝的重要因素[10]，有促進(jìn)土壤中腐殖質(zhì)、植物動物殘?bào)w的分解的作用，并且被作為評價(jià)土壤肥力以及健康狀況的一個良好潛在指標(biāo)[11]。

本研究健康與患病櫻桃樹根際土壤酶活性測定結(jié)果見圖2。由圖2A、B、C、D可見：健康園櫻桃樹根際土壤中蛋白酶、脲酶、轉(zhuǎn)化酶和多酚氧化酶活性平均值高于病害園櫻桃樹根際，且是其平均含量的1.92倍、10.23倍、1.67倍、1.61倍；脫氫酶、過氧化氫酶酶活性平均值則低于病害園櫻桃樹根際，呈現(xiàn)為脫氫酶平均活性值是健康園櫻桃樹根際土壤 2.25倍(圖2F)，過氧化氫酶活性平均值兩園間則差異不大(圖2E)?？梢姡疾烟覙涓H土壤中大部分酶活性相對健康櫻桃樹根際呈現(xiàn)減弱的趨勢，不利于營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化循環(huán)及有機(jī)體的分解與代謝[6]。

2.3 健康園與病害園櫻桃樹根際土壤可培養(yǎng)菌群差異

2.3.1 可培養(yǎng)微生物數(shù)量 土壤微生物對植物根系養(yǎng)分吸收、土壤肥力形成、營養(yǎng)物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化都有非常重要的作用[2]。健康和患病櫻桃樹根際土壤中細(xì)菌、放線菌及霉菌數(shù)量測定結(jié)果見表1。表1數(shù)據(jù)表明，健康櫻桃樹根際土壤細(xì)菌、放線菌數(shù)量平均值分別是患病櫻桃樹根際的2.04倍、1.64倍，且差異顯著；霉菌數(shù)量平均值表現(xiàn)為患病櫻桃樹根際大于健康櫻桃樹根際，但差異不顯著。可見，患病櫻桃樹根際土壤細(xì)菌及放線菌數(shù)量相對健康櫻桃樹根際土壤有所減少，而霉菌數(shù)量則有所增加。

圖1 健康與患病櫻桃樹根際土壤營養(yǎng)元素的對比Fig. 1 Comparison of nutrient elements in healthy and diseased rhizosphere soils of cherry tree

2.3.2 優(yōu)勢細(xì)菌種類 從健康園櫻桃樹根際土壤中分離出優(yōu)勢細(xì)菌145株，病害園櫻桃樹根際土壤中分離出89株，通過形態(tài)學(xué)和生理生化分析鑒定，將結(jié)果相似的菌株進(jìn)行歸類，其中健康園的145株優(yōu)勢細(xì)菌可歸為16種相似菌株；病害園的89株優(yōu)勢細(xì)菌歸為15種相似菌株。分別進(jìn)行16S rDNA測序，結(jié)果見表2。

健康櫻桃樹根際土壤分離出來的 145株菌分別屬于9個不同的屬；患病樣品分離出來的89株菌分別屬于8個不同的屬。健康與患病櫻桃樹根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌種類組成情況如圖3所示。

從圖3中可見，兩種土壤中細(xì)菌類群存在一定的差異性，具體表現(xiàn)在健康櫻桃樹根際土壤優(yōu)勢種屬包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、微小桿菌屬(Microbacterium)、考克氏菌屬(Kocuria)、類芽孢桿菌屬(Arthrobacter)，其占總量比例依次為 25.52%、19.31%、17.93% 和12.41%；患病櫻桃樹根際土壤中僅芽孢桿菌屬(Bacillus)是最明顯的優(yōu)勢種屬，所占比例為44.94%。僅在健康櫻桃樹根際土壤中發(fā)現(xiàn)的種屬有壤霉菌屬(Agromyces)、貪噬菌屬(Variovorax)；患病櫻桃樹根際土僅有的是微球菌屬(Micrococcus)?？梢?，患病櫻桃樹根際土壤相比健康櫻桃樹根際細(xì)菌優(yōu)勢菌的種類、數(shù)量減少，而且菌群結(jié)構(gòu)比例發(fā)生變化。

圖2 健康與患病櫻桃樹根際土壤酶活性值對比Fig. 2 Comparison of enzyme activities between healthy and diseased rhizosphere soils of cherry tree

表1 健康與患病櫻桃樹根際土壤微生物數(shù)量Table 1 Numbers of microorganisms in healthy and diseased rhizosphere soils of cherry tree

3 討論

根際微環(huán)境是一個由植物根系細(xì)菌、真菌、放線菌及土壤動物組成的多因素相關(guān)聯(lián)的復(fù)雜系統(tǒng)[12]，是植物和微生物交流活躍的土壤微區(qū)[13]。本研究中患病櫻桃樹根際土壤養(yǎng)分平均含量相對較低的有效磷、速效鉀、堿解氮均是植物可直接利用的營養(yǎng)[14]，由此可見患病櫻桃樹根際土壤的速效肥力差且營養(yǎng)缺失嚴(yán)重；而患病櫻桃樹根際土壤的有機(jī)碳平均含量相對較高，這可能是患病植株落葉過多所導(dǎo)致的[15]。

患病櫻桃樹根際土壤平均酶活性值較低的有蛋白酶、脲酶、轉(zhuǎn)化酶和多酚氧化酶，其中脲酶、蛋白酶參與土壤生態(tài)系統(tǒng)氮素循環(huán)，尿素的分解，與土壤中氮素的含量呈正相關(guān)[16]；轉(zhuǎn)化酶與土壤中微生物呼吸強(qiáng)度呈正相關(guān)[6]；多酚氧化酶與土壤腐殖質(zhì)程度呈正相關(guān)[17]。由此可見，患病櫻桃樹根際土壤肥力、熟化程度以及微生物活性都不及健康櫻桃樹根際高。其中，健康櫻桃樹根際土壤脲酶活性是患病櫻桃樹根際的10倍，差異最大，結(jié)合營養(yǎng)元素結(jié)果可見患病根際土壤氮素缺失嚴(yán)重。而患病櫻桃樹根際土壤酶活性較高的僅有脫氫酶，這可能是因?yàn)槊摎涿概c土壤中碳源有密切關(guān)系[18]，患病櫻桃樹根際土壤有機(jī)碳含量高所導(dǎo)致的。

表2 健康與患病櫻桃樹根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌鑒定結(jié)果Table 2 Numbers of microorganisms in healthy and diseased rhizosphere soils of cherry tree

圖3 健康與患病櫻桃樹根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌種類組成Fig. 3 Composition of dominant bacterium species in healthy and diseased rhizosphere soils of cherry tree

根際土壤微生物是土壤–根系間養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)器[19]。健康櫻桃樹根際土壤的細(xì)菌、放線菌數(shù)量相對患病櫻桃樹根際較多且差異顯著，而兩園霉菌數(shù)量表現(xiàn)為差異不顯著。優(yōu)勢細(xì)菌的鑒定結(jié)果顯示，患病櫻桃樹根際土壤的優(yōu)勢細(xì)菌數(shù)量及種類不僅少于健康櫻桃樹根際且菌群結(jié)構(gòu)比例發(fā)生變化，其土壤優(yōu)勢細(xì)菌考克氏菌屬、微小桿菌屬、類芽孢桿菌屬比重降低且缺少壤霉菌屬和貪噬菌屬。綜合土壤微環(huán)境菌群的數(shù)量及種類差異，可能是患病櫻桃樹根際土壤菌群結(jié)構(gòu)比例變化后病菌入侵引起病害，進(jìn)而患病植株?duì)I養(yǎng)傳輸阻斷，造成根際土壤營養(yǎng)不均衡，不利于微生物的生長，土壤失去自我修復(fù)的能力，植物病害持續(xù)加重。

4 結(jié)論

通過比較健康與患病櫻桃樹根際土壤微環(huán)境，發(fā)

現(xiàn)在自然環(huán)境相同的條件下，患病植株根際土壤相對健康樣品氮、磷、鉀速效肥力及催化氮素轉(zhuǎn)化循環(huán)的酶活性減弱；細(xì)菌、放線菌數(shù)量，尤其是優(yōu)勢細(xì)菌種類及數(shù)量減少且菌群結(jié)構(gòu)比例發(fā)生變化。由此可見，速效養(yǎng)分氮的減少及微生物菌落的變化可能是導(dǎo)致櫻桃樹“黑疙瘩”病發(fā)生的原因。

[1] 馬德欽, 張洪勝, 梁衛(wèi)東. 利用土壤桿菌防治植物冠癭病[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 1995, 22(4): 238–242

[2] 倪志華, 李晶, 廖嬌, 等. 果樹根際微生態(tài)研究現(xiàn)狀及展望[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2010, 12(4): 34–38

[3] Wang X, Zabowski D. Nutrient composition of Douglas-fir rhizosphere and bulk soil solutions[J]. Plant Soil, 1998, 200: 13–20

[4] 沈萍, 范秀容, 李廣武. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 3版. 北京:高等教育出版社, 1999: 214–215

[5] 鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析[M]. 3版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000: 25–108

[6] 中國科學(xué)院南京土壤研究所微生物室. 土壤微生物研究法[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1985: 44–58, 263

[7] 蔡紅, 沈仁芳. 改良茚三酮比色法測定土壤蛋白酶活性的研究[J]. 土壤學(xué)報(bào), 2005, 42(2): 306–312

[8] 布坎南, 吉本斯. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M]. 8版. 北京: 科學(xué)出版社, 1984

[9] 蔡妙英, 東秀珠. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 科學(xué)出版社, 2001

[10] Huner A H. Laboratory and greenhouse techniques for nutrient survey to determine the soil amendment required for optimum plant growth[J]. Florida USA: Mimeograph, Agro, Service International, 1998: 56–68

[11] 楊鵬鳴, 周俊國. 不同肥料對土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性的影響[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011(11): 78–80

[12] Campbell R, Greaves M P. Anatomy and community structure of the rhizosphere[M]//Lynch J M. The rhizosphere. Chichester: John Wiley and Sons, 1990: 11–34

[13] 李增強(qiáng), 趙炳梓, 張佳寶. 玉米品種對根際微生物利用光合碳的影響[J]. 土壤學(xué)報(bào), 2016, 53(5):190–199

[14] 楊瑞, 劉帥, 王紫泉. 秦嶺山脈典型林分土壤酶活性與土壤養(yǎng)分關(guān)系的探討[J]. 土壤學(xué)報(bào), 2016, 53(4): 1037–1046

[15] 李博, 王金滿, 王洪丹, 等. 煤礦區(qū)土壤有機(jī)碳含量測算與影響因素研究進(jìn)展[J]. 土壤, 2016, 48(3): 434–441

[16] 李娜, 湯潔, 張楠, 等. 凍融作用對水田土壤有機(jī)碳和土壤酶活性的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2015, 38(10): 1–6

[17] 郝建朝, 吳沿友, 連賓, 等. 土壤多酚氧化酶性質(zhì)研究及意義[J]. 土壤通報(bào), 2006, 37(3): 470–474

[18] 張凱煜, 谷潔, 趙聽, 等. 土霉素和磺胺二甲嘧啶對堆肥過程中酶活性及微生物群落功能多樣性的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 35(12): 3927–3936

[19] 孫波, 廖紅, 蘇彥華, 等. 土壤–根系–微生物系統(tǒng)中影響氮磷利用的一些關(guān)鍵協(xié)同機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 土壤, 2015, 47(2): 210–219

Effects of Soil Microecological Environment on Occurrence of‘Black Humor’ Disease in Cherry Tree

YANG Lu, DU Yanxin, XU Lijuan, HUANG Jianxin*
(College of Life Sciences, Northwest University, Xi’an 710069, China)

The methods of traditional microbiology, molecular biology and biochemistry were combined to study the differences of rhizosphere soil physical and chemical properties, soil enzyme activities and the culturable microorganism diversities between healthy and diseased cherry trees in the White Deer Prairie Shaanxi for the prevention and control of ‘Black tumor’ disease. The results showed that the contents of total phosphorus, available potassium, available phosphorus and available nitrogen of healthy rhizosphere soil were significantly higher than those of diseased one, organic carbon content of healthy rhizosphere soil was significantly lower than that of diseased one. Total nitrogen, total potassium contents and pH had no significant difference between healthy and diseased rhizosphere soils. The activities of protease, urease, invertase and PPO enzymes of healthy rhizosphere soil were much higher than those of diseased one, but the activities of DHA and CAT enzymes of healthy rhizosphere soil were lower. The population of culturable bacteria and actinomyces of healthy rhizosphere soil were significantly more than diseased one, particularly of dominant bacteria, the mean population of streptomyces of healthy rhizosphere soil were lower than those of diseased one but without significant difference. The decrease of the number of culturable bacteria and actinomycetes, the imbalance proportion of dominant bacteria in the rhizosphere soil, the decrease of available fertilizer and enzyme activities may be the causes of Black tumor disease.

Cherry tree; Black tumor disease; Soil microecological environment

Q93

A

10.13758/j.cnki.tr.2017.02.015

陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(SJ08ZT08-2)資助。

* 通訊作者(jxhuang@nwu.edu.cn)

楊璐(1991—)，女，山西運(yùn)城人，碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)。E-mail: lululily91@163.com