謝慶東，何琳燕，王 琪，盛下放

(農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095)

一株高效溶解鉀長(zhǎng)石芽孢桿菌的分離鑒定與生物學(xué)特性研究①

謝慶東，何琳燕，王 琪，盛下放*

(農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095)

從風(fēng)化的鉀質(zhì)粗面巖表面分離篩選到1株高效風(fēng)化鉀長(zhǎng)石的芽孢桿菌E31菌株，通過(guò)菌株的生理生化特征并結(jié)合菌株16S rDNA序列分析，E31菌株被鑒定為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)。同時(shí)對(duì)E31菌株溶解鉀長(zhǎng)石的效應(yīng)與機(jī)制以及生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，E31菌株能風(fēng)化鉀長(zhǎng)石并釋放出其中的元素，28℃ 振蕩培養(yǎng)不同時(shí)間，接菌處理發(fā)酵液中可溶性K、Fe、Ca、Al含量分別比對(duì)照提高了19.6% ～ 25.6%、1 ～ 12.5倍、10.4% ～47.2% 和1.2 ～ 4.5倍。在鉀長(zhǎng)石存在條件下接菌處理發(fā)酵液pH為3.62 ～ 3.80，發(fā)酵液中葡萄糖酸含量達(dá)61 ～ 1 794 mg/L，發(fā)酵液細(xì)胞數(shù)量達(dá) (8.7 ～ 16.1)×106cfu/ml，表明菌株可以通過(guò)代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸來(lái)加速對(duì)鉀長(zhǎng)石的分解作用。另外，E31菌株能夠合成生長(zhǎng)素和鐵載體，E31菌株對(duì)溫度、pH和鹽濃度具有較強(qiáng)的耐受性。

鉀質(zhì)粗面巖；鉀長(zhǎng)石；蘇云金芽孢桿菌；礦物風(fēng)化；葡萄糖酸；生物學(xué)特性

微生物–礦物相互作用是地球上廣泛發(fā)生的一種地質(zhì)作用，微生物作用下硅酸鹽礦物的風(fēng)化作用是表生環(huán)境中普遍存在的地球化學(xué)過(guò)程[1]。細(xì)菌可以通過(guò)產(chǎn)生的有機(jī)酸、胞外多聚物以及鐵載體等不同的機(jī)制加速土壤礦物的溶解，對(duì)于巖石風(fēng)化、土壤形成以及土壤肥力的維持有重要的作用，同時(shí)在長(zhǎng)時(shí)間尺度上對(duì)土壤環(huán)境和大氣CO2產(chǎn)生重要的影響[2–6]。芽孢桿菌(Bacillus spp.)是一類革蘭氏染色陽(yáng)性、能夠產(chǎn)生抗逆性芽孢、好氧或兼性厭氧，且分布廣泛的一類細(xì)菌種群[7]。芽孢桿菌的芽孢對(duì)高溫、干燥、強(qiáng)電離輻射、紫外線、各種有害物質(zhì)都有很強(qiáng)的抗性，良好的抗逆性使得它在各種惡劣的環(huán)境下可以正常地生長(zhǎng)繁殖[8]。芽孢桿菌在礦物的生物風(fēng)化和元素的釋放等方面的研究已受到人們的重視。Song 等[9]發(fā)現(xiàn)Bacillus subtilis能夠顯著增強(qiáng)礦物風(fēng)化的速率；Basak 和Biswas[10]的研究表明，胨凍樣芽孢桿菌能夠風(fēng)化云母并能夠活化淋溶土中的 K元素；黃智等[11]在搖瓶條件下研究了Bacillus altitudinis溶解鉀長(zhǎng)石的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)菌株能明顯降低發(fā)酵液的 pH并釋放礦物中的Fe、Si、Al、K等元素。雖然芽孢桿菌分解礦物及其機(jī)制的研究已有報(bào)道，但從風(fēng)化的鉀質(zhì)粗面巖表面分離篩選高效風(fēng)化鉀長(zhǎng)石的芽孢桿菌并研究其對(duì)鉀長(zhǎng)石的溶解效能與機(jī)制等至今未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用選擇性培養(yǎng)基，從鉀質(zhì)粗面巖表面分離篩選到一株高效分解鉀長(zhǎng)石的蘇云金芽孢桿菌，并探明該菌株溶解鉀長(zhǎng)石的效能、機(jī)制及其生物學(xué)特性，豐富礦物風(fēng)化芽孢桿菌資源庫(kù)，同時(shí)為研發(fā)高效微生物肥料、提高土壤礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)提供理論依據(jù)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 鉀長(zhǎng)石和培養(yǎng)基

鉀長(zhǎng)石(購(gòu)自煙臺(tái)市華威礦業(yè)有限公司)元素組成：SiO263.6%，K2O 13.5%，Al2O318.4%，F(xiàn)e2O31.7%，MgO 0.1%，CaO 0.04%。礦物樣品處理參照文獻(xiàn)[12]。礦物樣品研磨、過(guò)100 ～ 300目篩，去離子水超聲波清洗、鹽酸溶液浸泡、去離子水超聲清洗若干次，烘干備用。

BHm培養(yǎng)基：150 mg MgSO4?7H2O，80 mg NaH2PO4，90 mg Na2HPO4，65 mg (NH4)2SO4，20 mg CaCl2，2 g葡萄糖，1 L蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.0；LB培養(yǎng)基：10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母粉，10 g 氯化鈉，1 L 蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.0；有氮改良培養(yǎng)基：10 g蔗糖，2 g K2HPO4，1 g (NH4)2SO4，0.5 g MgSO4?7H2O，0.1 g NaCl，1 L蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.2 芽孢桿菌分離、純化與篩選

采用LB培養(yǎng)基按文獻(xiàn)[12]分離。已風(fēng)化鉀質(zhì)粗面巖樣品采自南京小龍山鉀礦區(qū)(118°45′E，31° 47′N)。巖石樣品 10 g 加入 90 ml 無(wú)菌水中，充分振蕩(10 min)以制備成菌懸液，菌懸液置于80℃水浴鍋中水浴15 min以殺死非芽孢桿菌，采用稀釋涂布的方法分離巖石樣品中的芽孢桿菌，平板在 30℃培養(yǎng)3天后挑取單菌落并進(jìn)行菌種劃線純化。

采用貧營(yíng)養(yǎng)的 BHm培養(yǎng)基，以發(fā)酵液中有效Al含量的增加作為鉀長(zhǎng)石溶解的標(biāo)志。100 ml 塑料三角瓶中分裝BHm培養(yǎng)基30 ml，加入0.15 g 鉀長(zhǎng)石粉，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為7.0，115℃ 滅菌30 min，將供試菌株分別接種于2 ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 ～16 h，離心(8 000 r/min，5 min)收集菌體后，用無(wú)菌水洗滌2次后重懸于無(wú)菌水中，調(diào)整其OD600為0.8左右(108cfu/ml)，接種于每一只塑料瓶中，對(duì)照接等量滅活菌液，28℃振蕩(150 r/min)培養(yǎng)7天后分析發(fā)酵液中有效Al含量，以篩選高效分解鉀長(zhǎng)石的芽孢桿菌菌株。發(fā)酵液中有效Al含量的測(cè)定：將發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min，取上清液用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測(cè)定溶液中Al的含量。

1.3 高效菌株對(duì)鉀長(zhǎng)石的溶解作用

高效菌株對(duì)鉀長(zhǎng)石的溶解試驗(yàn)同1.2。搖瓶培養(yǎng)時(shí)間分別為0、1、2、3、5、7和15 d，在不同培養(yǎng)時(shí)間取樣分析發(fā)酵液pH，細(xì)胞數(shù)量，有機(jī)酸以及其中有效態(tài)Fe、Al、K、Ca等元素的含量。發(fā)酵液pH采用pH計(jì)測(cè)定，細(xì)胞數(shù)量采用平板計(jì)數(shù)，發(fā)酵液高速離心(10 000 r/min，15 min)，0.25 μm 濾膜過(guò)濾，濾液用高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中有機(jī)酸，測(cè)定條件：色譜柱：C18 Agilent ZorbaxSB-AQ (4.6 mm × 250 mm)，流速0.6 ml/min，進(jìn)樣量20 μl，流動(dòng)相：0.02 mol/L KH2PO4(pH 2.4)和1% 色譜甲醇，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm；發(fā)酵液有效態(tài)Fe、Al、K、Ca等元素的含量采用ICPOES測(cè)定。

1.4 高效礦物風(fēng)化芽孢桿菌形態(tài)、生理生化特性與鑒定

按常規(guī)方法對(duì)菌株形態(tài)和生理生化特性進(jìn)行分析。將菌株接種于滅菌的2 ml LB液體培養(yǎng)基，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。取1.5 ml純培養(yǎng)物6 000 g離心5 min，細(xì)菌基因組總DNA的提取采用CTAB法[13]。菌株16S rDNA擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCGGCTCAG-3′)和 1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 1.5 kb。反應(yīng)體系為 25 μl，包括 12.5 μl 2×Taq Master Mix，0.5 μl濃度為10 μmol/L的引物，1 μl DNA模板，10.5 μl ddH2O；PCR反應(yīng)條件為95℃ 預(yù)變性5 min，95℃ 變性45 s，56℃ 退火45 s，72℃ 延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物用經(jīng)EB染色的1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將獲得的序列用BLAST軟件與GenBank中已知的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定菌株。

1.5 菌株產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)和鐵載體能力測(cè)定

菌株產(chǎn)IAA能力測(cè)定采用王璐等[14]方法。將供試菌株接入有氮培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵液離心，取上清液，加正磷酸和Sackowski’s顯色劑，混勻，黑暗下顯色，測(cè)定530 nm波長(zhǎng)處吸光值。以IAA標(biāo)準(zhǔn)液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算發(fā)酵液中IAA的濃度[15]。

菌株產(chǎn)鐵載體能力測(cè)定參照王璐等[14]方法。將供試菌株接入有氮液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵液離心，取上清液加入CAS檢測(cè)液，混勻，以去離子水作對(duì)照，測(cè)定630 nm波長(zhǎng)處的吸光值；取未接菌的LB液體培養(yǎng)基與CAS檢測(cè)液混勻，同法測(cè)定為參比值[16–17]。

1.6 溫度、初始 pH和鹽濃度對(duì)芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

溫度、初始pH和鹽濃度對(duì)芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響采用王璐等[14]方法進(jìn)行分析。將供試菌株點(diǎn)接于LB固體平板，分別在4℃、15℃、30℃、45℃和55℃的溫度下培養(yǎng) 72 h，觀察其能否生長(zhǎng)及生長(zhǎng)情況；用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH將LB培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。將活化的供試菌株分別點(diǎn)接于上述不同pH的培養(yǎng)基中，28℃ 培養(yǎng)72 h，觀察其能否生長(zhǎng)及生長(zhǎng)情況；按質(zhì)量百分比濃度分別配制NaCl濃度為0.1%、0.5%、1.0%、5.0%、10%、20% 和 30% 的LB培養(yǎng)基，將供試菌株分別點(diǎn)接于上述培養(yǎng)基上，30℃ 培養(yǎng)72 h，觀察其能否生長(zhǎng)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Microsoft Office Excel 2007處理，采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 芽孢桿菌的分離篩選

細(xì)菌廣泛分布在巖石(礦物)表面和土壤中[12,18]。采用熱處理和添加鉀長(zhǎng)石的貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(BHm培養(yǎng)基)篩選到18株能夠從鉀長(zhǎng)石中釋放Al的芽孢桿菌，其中菌株 E31風(fēng)化鉀長(zhǎng)石的能力最強(qiáng)，接菌處理發(fā)酵液中的有效Al(0.53 mg/L)含量比對(duì)照(0.09 mg/L)增加了4.9倍，因此，以下試驗(yàn)均以菌株E31為供試菌株。另外，供試鉀質(zhì)粗面巖表面可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量達(dá)2.86×106cfu/g，芽孢桿菌數(shù)量達(dá)3.24×105cfu/g，芽孢桿菌數(shù)量占總細(xì)菌數(shù)量的11.3%。

2.2 E31菌株對(duì)鉀長(zhǎng)石的溶解作用及其機(jī)制

研究表明，細(xì)菌可以通過(guò)產(chǎn)生的有機(jī)酸、鐵載體、多糖以及氧化還原作用加速礦物的風(fēng)化并釋放其中的元素[5,9,12,19]。由圖 1可以看出，芽孢桿菌E31菌株具有顯著的溶解鉀長(zhǎng)石的能力。接菌處理的發(fā)酵液中有效性K、Ca、Fe、Al的含量分別比對(duì)照增加了19.6% ～ 25.6%、10.4% ～ 47.2%、1 ～ 12.5倍和1.2 ～ 4.5倍(圖1)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株E31溶解鉀長(zhǎng)石的能力增強(qiáng)，而對(duì)照處理發(fā)酵液中的K、Ca、Fe、Al含量沒(méi)有顯著變化。菌株E31在含鉀長(zhǎng)石的貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中能夠正常生長(zhǎng)，培養(yǎng)1 d后發(fā)酵液中活細(xì)胞數(shù)量由初始的 1.4×106cfu/ml增加到1.5×107cfu/ml，培養(yǎng)時(shí)間在1 ～ 7 d內(nèi)發(fā)酵液中活細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有顯著變化，培養(yǎng)7 d后發(fā)酵液中的活細(xì)胞數(shù)量顯著下降(圖2A)。另外，菌株E31在風(fēng)化鉀長(zhǎng)石的過(guò)程中可以通過(guò)產(chǎn)酸來(lái)降低發(fā)酵液中的pH，培養(yǎng)1 d后，接菌處理的發(fā)酵液pH為3.66 ～ 3.80，而對(duì)照處理發(fā)酵液中的pH在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有顯著變化(圖2B)。菌株E31在含鉀長(zhǎng)石的貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中能夠大量合成葡萄糖酸，培養(yǎng)1 d后發(fā)酵液中葡萄糖酸含量最高(1 794 mg/L)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中葡萄糖酸含量快速下降，培養(yǎng)后期發(fā)酵液中葡萄糖酸含量為61 ～ 66 mg/L(圖3)。由此可見(jiàn)，菌株 E31能夠在貧營(yíng)養(yǎng)條件下通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)來(lái)降低發(fā)酵液中的pH，并通過(guò)發(fā)酵液的酸化作用和合成的葡萄糖酸的絡(luò)合作用來(lái)溶解鉀長(zhǎng)石并釋放出其中的元素，增加發(fā)酵液中可溶性K、Ca、Fe、Al含量[5,12]。

圖1 E31菌株對(duì)K、Ca、Fe和Al的溶解作用Fig. 1 K, Ca, Fe, and Al releases from feldspar in presence of strain E31

圖2 發(fā)酵液細(xì)胞數(shù)量(A)和pH (B)的變化Fig. 2 Change of cell numbers and pH in culture medium in presence of strain E31

圖3 芽孢桿菌E31菌株合成的葡萄糖酸Fig. 3 Production of gluconic acid by strain E31 during feldspar weathering process

2.3 菌株E31的鑒定

菌株E31的鑒定主要依據(jù)16S rRNA序列并結(jié)合菌株基本特征進(jìn)行。菌株 E31的基本特征：革蘭氏陽(yáng)性、好氧、桿狀、菌體大小為(1.5 ～ 2.0) μm×(3.0 ～3.5) μm，能產(chǎn)生芽孢。在LB培養(yǎng)基上菌落為白色、圓形、邊緣不規(guī)則、厚實(shí)且較濕潤(rùn)、易挑取。將E31菌株16S rRNA序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比對(duì)，采用MEGA 5.0軟件經(jīng)臨近法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出，菌株 E31與Bacillus thuringiensis ATCC 10792T(ACNF01000156)的16S rRNA基因序列相似性為100%。因此，E31菌株被鑒定為Bacillus thuringiensis。

圖4 基于16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(鄰接法)Fig. 4 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

2.4 蘇云金芽孢桿菌E31菌株產(chǎn)生長(zhǎng)素和鐵載體能力

菌株E31具有產(chǎn)IAA的能力，產(chǎn)量為30.8 mg/L。鐵載體是一類特異性螯合劑，是微生物在限鐵條件下(即鐵離子濃度較低時(shí))產(chǎn)生并分泌的一種低分子量(＜1 000 Da)、能夠螯合Fe (III) 離子的化合物。本試驗(yàn)采用CAS通用檢測(cè)法檢測(cè)供試菌株產(chǎn)鐵載體的能力[16–17]。根據(jù)A/Ar比值(即菌株測(cè)定值/對(duì)照值)對(duì)細(xì)菌鐵載體產(chǎn)量進(jìn)行半定量比較，A/Ar比值越小菌株產(chǎn)鐵載體能力越強(qiáng)[15–16]。菌株 E31的 A/Ar比值為0.45(在0.4 ～ 0.6范圍內(nèi))，產(chǎn)鐵載體能力中等。

2.5 蘇云金芽孢桿菌E31菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力

蘇云金芽孢桿菌E31菌株對(duì)不同的溫度、pH和鹽濃度等表現(xiàn)出一定的耐受性。菌株E31為中溫菌，在15 ～ 37℃下能較好生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為30℃左右；菌株E31生長(zhǎng)的pH范圍是3 ～ 10，最適生長(zhǎng)pH 7.0；菌株E31在0.5% ～ 20% 的NaCl中良好生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)鹽濃度為1.0% NaCl，值得注意的是，菌株E31耐高滲能力較強(qiáng)，在20% NaCl中能夠正常生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

1) 從風(fēng)化的鉀質(zhì)粗面巖表面分離篩選到一株高效風(fēng)化鉀長(zhǎng)石的蘇云金芽孢桿菌E31菌株。

2) 研究表明，蘇云金芽孢桿菌E31菌株能夠顯著促進(jìn)鉀長(zhǎng)石的溶解并釋放出其中的 Fe、K、Al、Ca等元素，E31菌株主要通過(guò)培養(yǎng)基的酸化和合成的葡萄糖酸加速鉀長(zhǎng)石的風(fēng)化。

3) E31菌株能夠合成植物促生物質(zhì)生長(zhǎng)素和鐵載體，同時(shí)對(duì)溫度、酸堿有一定的耐受性，尤其具有較強(qiáng)的耐高滲能力。

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Isolation and Identification of a Feldspar-dissolving Bacillus Strain and Its Biological Characteristics

XIE Qingdong, HE Linyan, WANG Qi, SHENG Xiafang*
(Key Laboratory of Agricultural and Environmental Microbiology, Ministry of Agriculture, College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

One mineral-weathering Bacillus strain was isolated from the surface of weathered potash trachyte and was identified as Bacillus thuringiensis based on the physiological and biochemical traits and 16S rDNA sequence analysis. The dissolution of feldspar by strain E31 and the mechanism involved as well as the biological characteristics were characterized. The results showed that strain E31 could weather feldspar and release elements from the mineral. The concentrations of K, Fe, Ca, and Al were increased by 19.6%–25.6%, 1–12.5 times, 10.4%–47.2% and 1.2–4.5 times in the presence of strain E31 compared with the controls respectively during the mineral weathering process. pH value, gluconic acid content, and cell numbers in the culture medium were 3.62–3.80, 61–1 794 mg/L, and (8.7–16.1)×106cfu/ml, respectively, in the presence of strain E31, suggesting that strain E31 could promote the mineral weathering by increasing the production of organic acids in the culture medium. Furthermore, E31 strain has the ability to produce IAA and siderophores in culture medium and also has the characteristics of acid or alkali and salt tolerance and temperature resistance.

Potash trachyte; Feldspar; Bacillus thuringiensis; Mineral weathering; Gluconic acid; Biological characteristics

Q93；S1

A

10.13758/j.cnki.tr.2017.02.014

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41473075)資助。

* 通訊作者(xfsheng@njau.edu.cn)

謝慶東(1990—)，男，山西晉城人，碩士研究生，主要從事硅酸鹽礦物–細(xì)菌相互作用研究。E-mail: 2013116076@njau.edu.cn