李 萬，楊明明,2，高 翔,2，董 劍,2，趙萬春,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西省小麥工程技術(shù)研究中心/陜西省小麥新品種培育工程研究中心，陜西楊凌 712100)

西農(nóng)538 LMW-GS基因的克隆、原核表達(dá)及功能鑒定

李 萬1，楊明明1,2，高 翔1,2，董 劍1,2，趙萬春1,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西省小麥工程技術(shù)研究中心/陜西省小麥新品種培育工程研究中心，陜西楊凌 712100)

為了探索普通小麥品種西農(nóng)538的LMW-GS對面粉加工品質(zhì)的影響，根據(jù)NCBI中已公布的LMW-GS基因序列，設(shè)計(jì)了一對特異性引物，從西農(nóng)538基因組DNA中克隆出LMW-GS基因后，對其進(jìn)行原核表達(dá)及摻粉試驗(yàn)。序列分析表明，克隆得到的LMW-GS基因序列 (GenBank登錄號為KX452081)有單一完整的開放閱讀框，編碼區(qū)長915 bp，無內(nèi)含子。同源性比對及進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)儆?Glu-D3、Type V (Group 10)、m型、C組LMW-GS基因。SDS-PAGE和Western blot分析表明，該基因原核表達(dá)成功。微量摻粉試驗(yàn)表明，誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白對小麥面粉加工品質(zhì)有負(fù)效應(yīng)。

小麥；LMW-GS基因；原核表達(dá)；微量摻粉試驗(yàn)

低分子量谷蛋白是龐大的基因家族，其大多數(shù)基因被定位在第一同源組群1A、1B和1D染色體的短臂末端，編碼位點(diǎn)分別命名為 Glu-A3、 Glu-B3和 Glu-D3[1-2]。此外，在 Glu-D4和 Glu-D5位點(diǎn)也有報(bào)道[3]。

研究表明，低分子量谷蛋白亞基(low molecular weight glutenin,LMW-GS)基因家族成員在編碼區(qū)結(jié)構(gòu)上非常相似，由信號肽、保守N-端區(qū)、含有多個(gè)重復(fù)短肽的重復(fù)區(qū)以及保守C-端區(qū)構(gòu)成[4]，不具有內(nèi)含子，其氨基酸序列中通常含有8個(gè)半胱氨酸殘基，但某些LMW-GS含有9個(gè)半胱氨酸[5]，這些半胱氨酸位置保守，對面粉加工品質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)[6]。由于LMW-GS與醇溶蛋白在基因編碼位點(diǎn)上緊密連鎖，分離較為困難，直到20世紀(jì)80年代末期人們才逐漸認(rèn)識到LMW-GS的重要性。研究表明，有些LMW-GS對面粉品質(zhì)的影響遠(yuǎn)大于HMW-GS，或與HMW-GS對品質(zhì)的貢獻(xiàn)極為相似[7-8]。為了驗(yàn)證這種說法，Wieser等[9]通過微量流變學(xué)和烘烤測試發(fā)現(xiàn)，兩倍LMW-GS含量可以獲得和HMW-GS同樣的面粉延展性。Benedettelli等[10]還研究了低分子量谷蛋白的無效等位基因，發(fā)現(xiàn)其對某些品質(zhì)參數(shù)有決定性作用。

小麥品種西農(nóng)538具有耐旱性好、分蘗力強(qiáng)、成穗率高、抗干熱風(fēng)、成熟黃亮等特點(diǎn)，是西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥品質(zhì)育種課題組選育的新品種。邱玉亮等[11]發(fā)現(xiàn)其HMW-GS組成為1、14+15和2+12。王玉杰等[12]對其LMW-GS進(jìn)行SDS-PAGE及分子標(biāo)記檢測發(fā)現(xiàn)，其具有 Glu-A3a、 Glu-B3d和 Glu-D3c。另外，張龍龍等[13]研究表明，西農(nóng)538屬于強(qiáng)抗旱型品種。陳冬陽等[14]從中克隆了幾丁質(zhì)酶基因，并利用實(shí)時(shí)熒光定量法研究其在小麥根、莖、葉等不同部位的表達(dá)差異，以及受條銹菌誘導(dǎo)后的表達(dá)量變化，認(rèn)為其對真菌性病害具有抗性。本研究根據(jù)前人研究成果設(shè)計(jì)特異性引物，從西農(nóng)538基因組DNA中克隆出LMW-GS基因后，對其進(jìn)行體外表達(dá)及摻粉試驗(yàn)，以期拓寬小麥優(yōu)質(zhì)基因資源，為小麥品質(zhì)改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

普通小麥品種西農(nóng)538由國家小麥改良中心楊凌分中心品質(zhì)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。DNA凝膠回收純化試劑盒、增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000購于天根生化科技(北京)有限公司；EsTaqMasterMix購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；克隆載體pEASY-T1、原核表達(dá)載體pEASY-Blunt E1、克隆菌株EscherichiacoliTrans1-T1、原核表達(dá)菌株EscherichiacoliTrans B(DE3)、ProteinIso Ni-NTA Resin、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Blue Plus II、抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR擴(kuò)增引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取

以室內(nèi)培養(yǎng)1周左右的西農(nóng)538幼嫩葉片為材料，采用微量CTAB法[15]提取基因組DNA。

1.2.2 目的基因的克隆及其序列分析

根據(jù)NCBI中已公布的LMW-GS基因序列(EU189094)設(shè)計(jì)特異性引物lmwF/lmwR (lmwF:5′-GCCTTTCTTGTTTACGGCTG-3′; lmwR:5′-TCAGATTGACATCCACACAAT-3′)。以西農(nóng)538的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，包括25 μL EsTaqMasterMix、lmwF和lmwR各2 μL、DNA模板3 μL、滅菌ddH2O 18 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，使用DNA凝膠回收純化試劑盒回收目的片段。將膠回收的目的片段連接入pEASY-T1克隆載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)，涂于含有適量氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，第二天進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。使用通用引物M13F/M13R對白色單克隆菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選陽性克隆，并送武漢昆泰銳生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測序。利用DNAMAN、Lasergene及 SignalP 4.1 Server 和NCBI網(wǎng)站上的在線工具對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.3 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)

根據(jù)測序得到的LMW-GS基因序列，設(shè)計(jì)一對不擴(kuò)增信號肽序列的表達(dá)引物lmwexF/lmwexR(lmwexF:5′-CAGATGGAGACTAGATG CATCCC-3′;lmwexR:5′-TCAGTAGGCACCA ACTCCGG-3′)。以陽性克隆菌液為模板，用lmwexF/lmwexR進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收目的片段。擴(kuò)增體系及擴(kuò)增程序同基因克隆。將目的片段與pEASY-Blunt E1表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化于E.coliTrans1-T1感受態(tài)，37 ℃過夜培養(yǎng)。用引物T7T/lmwexF或lmwexR/T7P進(jìn)行陽性單克隆篩選，并測序鑒定。將插入順序正確的陽性克隆提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化于Trans B(DE3)表達(dá)感受態(tài)，培養(yǎng)后挑選陽性單克隆菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基(含100 mg·mL-1Amp)，于37 ℃、200 r·min-1過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)物按1∶100的比例接種于5 mL含LB液體培養(yǎng)基(含100 mg·mL-1Amp)中震蕩培養(yǎng)至菌液OD600=0.6左右，取1 mL菌液作為陰性對照，向剩下的菌液中加入終濃度為1 mmol·L-1IPTG，20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。用12%的SDS-PAGE分析鑒定蛋白表達(dá)結(jié)果。

1.2.4 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析

誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。在60 V電壓下濕轉(zhuǎn)75 min，然后取出NC膜于干凈的玻璃容器中，TBS洗膜3次，每次15 min；用新配置的封閉液(含5%脫脂奶粉)室溫?fù)u床封閉2 h，棄封閉液，TBS和TBST洗膜各2次，每次15 min；以鼠抗His(1∶10 000封閉液稀釋)抗體為一抗，室溫?fù)u床孵育1 h，棄一抗，TBS和TBST洗膜各2次，每次15 min；以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000封閉液稀釋)為二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，棄二抗，TBS和TBST洗膜各2次，每次15 min；最后用增強(qiáng)型 HRP-DAB底物顯色試劑盒避光進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.2.5 目的蛋白的純化和品質(zhì)效應(yīng)鑒定

目的蛋白的純化參照楊 帆等[16]的方法。用4 g全自動(dòng)微型粉質(zhì)儀(Micro-dough LAB，Perten公司，瑞典)測定粉質(zhì)參數(shù)。參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T14614-93和HMW-GS功能的體外鑒定方法進(jìn)行。向4 g基礎(chǔ)面粉中加入10 mg純化的目的蛋白，混勻后加入適量的H2O和250 μL 50 μg·mL-1的還原劑DTT溶液，4 min后再加入250 μL 200 μg·mL-1的KIO3氧化劑溶液，揉面20 min，記錄粉質(zhì)曲線。粉質(zhì)參數(shù)分析方法參考Xu等[17]和Chen等[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因克隆結(jié)果

以西農(nóng)538基因組DNA為模板，利用引物lmwF/lmwR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到約1 500 bp的單一條帶(圖1)。將目的條帶回收、克隆和測序后，得到長度為1 508 bp的序列。使用ORF Finder在線工具對得到的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列有單一完整的開放閱讀框，編碼區(qū)內(nèi)無內(nèi)含子，長915 bp，可編碼304個(gè)氨基酸。通過BLAST和DNAMAN比對分析發(fā)現(xiàn)，該序列和 Glu-D3編碼的LMW-GS的氨基酸序列有極高的相似性，其中，與DQ357056的相似性達(dá)到99.02%，初步斷定本研究得到的序列為 Glu-D3位點(diǎn)編碼的LMW-GS基因。將序列提交至GenBank，得到登錄號KX452081。

M：核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

M:Nucleotide marker DL2000;1:Amplified product.

圖1 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物

Fig.1 Amplified product separated on 2% agarose gel

2.2 序列分析

分析KX452081推導(dǎo)的氨基酸序列可知(圖2)，其編碼的成熟蛋白分子量約32.54 kDa，主要由6部分構(gòu)成，即由20個(gè)氨基酸殘基組成的信號肽(signal peptide)、由13個(gè)氨基酸殘基組成的含有1個(gè)半胱氨酸殘基的N-端保守區(qū)(N-terminus)、由99個(gè)氨基酸殘基組成的富含谷氨酰胺(Q)和脯氨酸(P)的重復(fù)區(qū)(repeated domain)、含有5個(gè)半胱氨酸殘基的C-端保守區(qū)Ⅰ(C-terminal region Ⅰ)、含有1個(gè)半胱氨酸殘基的富含谷氨酰胺(Q)的C-端保守區(qū)Ⅱ(C-terminal region Ⅱ)、含有1個(gè)半胱氨酸殘基的C-端保守區(qū)Ⅲ(C-terminal region Ⅲ)。結(jié)合N/C端氨基酸組成(METRCIPG ……VGTGVGAY)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖3)，推測KX452081屬于Type V (Group 10)、m型、C組LMW-GS。

2.3 目的基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

將含有重組質(zhì)粒的Trans B(DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞在20 ℃經(jīng)1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，用12%的SDS-PAGE檢測誘導(dǎo)表達(dá)情況。結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)表達(dá)蛋白與預(yù)期相符。進(jìn)一步用Western blot分析表明，目的基因片段獲得正確表達(dá)(圖5)。

序列中半胱氨酸殘基用黑色三角形表示。Black triangles indicated cysteine residues.

圖3 KX452081推導(dǎo)的氨基酸序列的進(jìn)化樹分析

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) Blue Plus II；1：未誘導(dǎo)的空載體；2：IPTG 誘導(dǎo)的空載體；3：未誘導(dǎo)的LMW-GS重組質(zhì)粒；4：IPTG誘導(dǎo)的LMW-GS重組質(zhì)粒；箭頭指示目的蛋白。

M:Protein marker Blue Plus II; 1:Protein of non-recombinant plasmid without induction; 2:Protein of non-recombinant plasmid after adding IPTG; 3:Protein of recombinant plasmid of LMW-GS without induction; 4:Protein of recombinant plasmid of LMW-GS after adding IPTG; The arrow shows target protein.

圖4 重組蛋白的SDS-PAGE分析

Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) Blue Plus II；1：重組蛋白。

M:Protein marker Blue Plus II; 1:Recombinant protein.

圖5 重組蛋白的Western blot分析

Fig.5 Recombinant protein detected by Western blot

A：中國春面粉中添加DTT和KIO3；B：中國春面粉中添加DTT、KIO3和LMW-GS。

A:Basic flour added with DTT and KIO3; B:Basic flour added with DTT,KIO3and LMW-GS.

圖6 純化的LMW-GS(KX452081)對粉質(zhì)曲線的影響

表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異在0.05水平上顯著。

Values are averaged from three replicates; Values marked with different letters show significant difference at 5% probability level. DvT:Development time; DT:Departure time; WC:Width of curve; AT:Arrival time; DS:Degree of softening; MTI:Mixing tolerance index; BdT:Breakdown time; ST:Stability time; FQN:Farinograph quality number.

2.4 目的蛋白的品質(zhì)效應(yīng)

采用4 g微量粉質(zhì)儀通過氧化還原反應(yīng)將10 mg純化后的表達(dá)產(chǎn)物添加到基礎(chǔ)面粉中，得到如圖6所示的粉質(zhì)曲線及表2所列的粉質(zhì)參數(shù)。分析表明，加入LMW-GS后，與對照相比，面團(tuán)形成時(shí)間、離線時(shí)間、帶寬、及線時(shí)間沒有顯著變化，而弱化度、機(jī)械耐力系數(shù)、斷裂時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間均顯著上升，粉質(zhì)質(zhì)量參數(shù)顯著下降。

3 討 論

二硫鍵對蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起著十分重要的作用，它是由兩個(gè)半胱氨酸殘基(Cys)的側(cè)鏈巰基氧化形成的一種肽鏈內(nèi)或肽鏈間的共價(jià)交聯(lián)[19]。LMW-GS一般含有8個(gè)Cys，而趙惠賢等[20]在小偃6號中克隆的 Glu-D3位點(diǎn)LMW-GS基因 (登錄號為AY263369) 有9個(gè)Cys殘基。這些Cys在氨基酸序列中的位置一般都很保守，它可以形成二硫鍵，這是LMW-GS二級結(jié)構(gòu)的一個(gè)重要特征，通過這些二硫鍵可以將LMW-GS和HMW-GS連接起來形成谷蛋白大聚合體，從而共同對小麥品質(zhì)起作用。

LMW-GS主要有四種分類系統(tǒng)：a.根據(jù)其在SDS-PAGE和IEF/SDS-PAGE雙向電泳中遷移率的不同分為B、C和D區(qū),其中B區(qū)為分子量42～51 kDa的堿性蛋白；C區(qū)LMW-GS與部分醇溶蛋白重疊，分子量31.0～36.5 kDa；D區(qū)為與ω醇溶蛋白位置相近的酸性蛋白[8,21]。b.根據(jù)N-末端或起始氨基酸序列將LMW-GS分為 LMW-m(METSH(R/C)I-)、LMW-s(SHIPGL-) 和 LMW-i(ISQQQQ-)三種[22-24]。c.依據(jù)染色體定位將LMW-GS分為 Glu-A3 、 Glu-B3 、 Glu-D3[25]。d.根據(jù)Cys的分布、N/C端氨基酸序列將LMW-GS劃分為Type (I～VI)六類，12組亞基[26-27]。本試驗(yàn)中得到的LMW-GS基因序列含有8個(gè)半胱氨酸殘基，成熟蛋白分子量約32.54 kDa，序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可知，該序列位于 Glu-D3，具有Type V (Group 10)、m型、C組LMW-GS的結(jié)構(gòu)特征。

從本研究結(jié)果可知，加入LMW-GS(KX452081)后，反映品質(zhì)的指標(biāo)變化并不完全一致。其中，面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間和斷裂時(shí)間顯著上升，面團(tuán)形成時(shí)間、帶寬和離線時(shí)間并沒有顯著變化，說明LMW-GS對面粉筋力有增強(qiáng)作用；而弱化度和機(jī)械耐力系數(shù)顯著上升，及線時(shí)間沒有顯著變化，又說明LMW-GS對筋力有負(fù)效應(yīng)。粉質(zhì)質(zhì)量指數(shù)則是用于快速方便的綜合評價(jià)面粉筋度和耐揉性的一個(gè)重要指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果得出，加入純化的LMW-GS后，粉質(zhì)質(zhì)量指數(shù)顯著下降。說明本研究純化得到的LMW-GS對面粉加工品質(zhì)有負(fù)效應(yīng)，這與孫 輝等[28]的研究結(jié)果相一致，也與李艷亮[29]克隆得到的m型、C組、 Glu-D3位點(diǎn)的LMW-GS(GQ892589)的品質(zhì)效應(yīng)一致。但是，李艷亮[29]在同一個(gè)試驗(yàn)中，也克隆得到了m型、C組、 Glu-D3位點(diǎn)的LMW-GS基因序列GQ892582，其對面粉品質(zhì)有正效應(yīng)；而Sissons等[30]也認(rèn)為m型LMW-GS對小麥面粉的總體特性有改善作用，上述兩個(gè)研究成果均與本試驗(yàn)結(jié)果相反，分析引起結(jié)果不同的原因，首先Sissons等[30]在分離和純化m型LMW-GS時(shí)，采用在一個(gè)窄pH范圍內(nèi)等電聚焦的方法(約90%純化度)，而本試驗(yàn)則是通過在大腸桿菌系統(tǒng)中體外表達(dá)，然后利用表達(dá)載體攜帶的His標(biāo)簽通過柱層析進(jìn)行蛋白純化；其次比較GQ892582和KX452081，二者氨基酸序列相似性僅有68.95%，同源性較差，另外使用的小麥品種和基礎(chǔ)面粉也不同，綜上，分離和純化目的蛋白的方式以及氨基酸序列位點(diǎn)的變異、缺失等都可能是導(dǎo)致結(jié)果差異的原因，但具體原因仍需更為深入地研究來證實(shí)。

微量摻粉試驗(yàn)易受外界環(huán)境的影響，對試驗(yàn)所需的外源蛋白的純度要求較高，同時(shí)LMW-GS基因家族復(fù)雜，不僅數(shù)量遠(yuǎn)多于HMW-GS，變異廣，并且這些變異都可能會(huì)導(dǎo)致其面粉品質(zhì)效應(yīng)的改變，加之LMW-GS在SDS-PAGE中與醇溶蛋白重疊[31]，給深入研究LMW-GS帶來了難度，從而使得大多數(shù)低分子量谷蛋白亞基對小麥品質(zhì)的作用并沒有得到清楚認(rèn)識，因此有必要對不同位點(diǎn)編碼、不同組的LMW-GS以及它們的各種變異形式的品質(zhì)效應(yīng)做進(jìn)一步的研究。本研究分離鑒定出了一種對面粉品質(zhì)具有負(fù)向效應(yīng)的LMW-GS，為利用基因工程對普通小麥加工品質(zhì)改良提供了一定的理論依據(jù)。

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Isolation,Prokaryotic Expression and Functional Analysis of LMW-GS from Xinong 538 (TriticumaestivumL.)

LI Wan1,YANG Mingming1,2,GAO Xiang1,2,DONG Jian1,2,ZHAO Wanchun1,2

(1.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China; 2.Wheat Engineering Research Center of Shaanxi Province/Study Centre of Wheat Breeding of Shaanxi Province,Yangling,Shaanxi 712100,China)

Low-molecular-weight glutenin subunits (LMW-GS) play an important role in determining the processing quality of wheat (TriticumaestivumL.) flour. In this study,we isolated a LMW-GS gene (915 bp,GenBank accession number:KX452081) from wheat cultivar Xinong 538,using a pair of specific primers. The comprehensive analysis of deduced amino acid sequence,and phylogenetic and evolutionary analyses of full sequence,N- and C-terminal domains revealed that KX452081 was closely related to Glu-D3 loci,C-group,Type V (Group 10) and m-type LMW-GS. The target DNA fragments were subcloned into the pEASY-Blunt E1 expression vector and expressed inEscherichiacoliTrans B(DE3) cell under IPTG induction. The gene was successfully expressed inE.colisystem according to SDS-PAGE analysis and western-blotting assay. The fusion protein was purified and recovered by His-Trap affinity chromatography,and then integrated into the control flour by using a 4 g Micro-dough LAB Farinograph. Results showed that the LMW-GS originated from Xinong 538 had a negative effect on dough quality properties.

Wheat; LMW-GS gene; Prokaryotic expression; Farinograph

時(shí)間：2017-04-07

2017-01-25

2017-02-20 基金項(xiàng)目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系研究項(xiàng)目(CARS-3-2-47)；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題(2011AA100501) 第一作者E-mail：599092122@qq.com 通訊作者：高 翔(E-mail:gx@nwsuaf.edu.cn)

S512.1；S331

A

1009-1041(2017)04-0445-07

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