王化敦，高春蕾，張 鵬，張 瑜，張平平，馬鴻翔

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇南京 210095)

長江中下游麥區(qū)小麥品種籽粒硬度及puroindoline基因等位變異的分子檢測

王化敦1，高春蕾2，張 鵬1，張 瑜1，張平平1，馬鴻翔1

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇南京 210095)

為了明確長江中下游麥區(qū)小麥籽粒硬度及puroindoline基因型的分布，以該麥區(qū)105份小麥育成品種為材料，利用單籽粒硬度儀(SKCS)測定其籽粒硬度，利用分子標(biāo)記檢測和基因序列分析鑒定puroindoline基因的等位變異。結(jié)果表明，在長江中下游麥區(qū)歷年育成的小麥品種中軟質(zhì)麥比例較高，占52.4%，硬質(zhì)麥和混合麥分別占38.1%和9.5%；硬質(zhì)麥和混合麥中存在 Pinb-D1b、 Pina-D1b和 Pinb-D1p三種變異類型，突變頻率分別為29.5%、10.5%和3.8%。

普通小麥；籽粒硬度；puroindoline基因

籽粒硬度是小麥最重要的品質(zhì)性狀之一，對潤麥加水量、出粉率、面粉顆粒大小、破損淀粉粒數(shù)量和加工品質(zhì)均有很大影響[1]。按胚乳質(zhì)地將普通小麥分為硬質(zhì)麥、混合麥和軟質(zhì)麥，不同籽粒硬度的小麥具有不同品質(zhì)特性，如硬質(zhì)麥適合制作面包和優(yōu)質(zhì)面條等食品，軟質(zhì)麥適合制作餅干和糕點(diǎn)等甜食類食品，介于二者之間的混合麥可用于制作一些發(fā)酵時間短的面包及薄餅等，也可用于制作饅頭和面條等食品[2]。

小麥籽粒硬度主要與一種被稱為Friabilin的蛋白有關(guān)，F(xiàn)riabilin蛋白主要由puroindoline a (PINA) 和puroindoline b (PINB) 2種組分組成，軟質(zhì)麥中puroindoline蛋白含量較高，硬質(zhì)麥中puroindoline蛋白含量較低[1,3]。Friabilin蛋白及其組分的發(fā)現(xiàn)，大大推進(jìn)了小麥籽粒硬度在分子水平上的研究進(jìn)程。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，小麥籽粒硬度主要受位于5D染色體短臂上的1對主效基因(Hardness)和一些修飾基因控制，軟質(zhì)(Ha)對硬質(zhì)(ha)為顯性，若puroindolinea(Pina) 或puroindolineb(Pinb) 基因發(fā)生突變，通常會導(dǎo)致小麥胚乳質(zhì)地變硬[4-5]。1997年，Giroux和Morris[6]在硬質(zhì)麥中發(fā)現(xiàn)Pinb基因序列的一個位點(diǎn)發(fā)生突變(由G變?yōu)锳)，導(dǎo)致編碼氨基酸序列中第46位點(diǎn)的甘氨酸(Gly)變?yōu)榻z氨酸(Ser)，將這種變異類型命名為 Pinb-D1b。之后，在普通小麥中，相繼發(fā)現(xiàn)18種 Pinb-D1突變類型和11種 Pina-D1突變類型，Chen等[7]對其分子特征和來源進(jìn)行了詳細(xì)匯總。

目前，對我國小麥籽粒硬度及puroindoline基因型的研究主要集中在黃淮麥區(qū)，且主要針對春小麥[8-21]。長江中下游麥區(qū)是我國重要的小麥產(chǎn)區(qū)之一，張 曉等[22]曾對該地區(qū)揚(yáng)麥系列的21份小麥品種的籽粒硬度進(jìn)行了分析，但所使用材料有限，缺乏對該地區(qū)小麥品種在籽粒硬度方面較為深入、系統(tǒng)地了解。鑒于此，本研究以長江中下游麥區(qū)歷年育成的105份小麥品種為材料，進(jìn)行了籽粒硬度和puroindoline基因等位變異的鑒定，旨在了解該地區(qū)小麥品種資源籽粒硬度和puroindoline基因型分布的特點(diǎn)，為該地區(qū)小麥品種的品質(zhì)改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

收集長江中下游麥區(qū)歷年育成品種共計(jì)105份，其中，江蘇72份、湖北23份、安徽10份，這些材料基本上反映了長江中下游麥區(qū)歷年育種情況。于2015-2016年度在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田種植供試材料，每個小區(qū)種植5行，行長1.6 m。田間管理按當(dāng)?shù)卦囼?yàn)田進(jìn)行，抽穗后去雜，適時收獲，自然干燥。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 籽粒硬度的測定

每份材料選取150粒種子，利用Perten 4100型單籽粒谷物特性測試儀(Single Kernel Characterization System, SKCS)測定其硬度值。一般硬度值小于40為軟質(zhì)麥，大于60為硬質(zhì)麥，介于二者之間為混合麥。

1.2.2 基因組DNA的提取

采用CTAB法[23]提取小麥苗基因組DNA。為保證試驗(yàn)的可靠性，每份材料至少提取2份DNA。

1.2.3 硬度基因型的鑒定

對于SKCS測試結(jié)果為硬質(zhì)型和混合型的小麥品種進(jìn)行puroindoline基因型鑒定，以中國春( Pina-D1a/ Pinb-D1a)作為對照品種。

引物1[7]鑒定 Pinb-D1b類型，引物序列為 Pinb-D1b1-F：5′-ATGAAGACCTTATTCCTCC TA-3′； Pinb-D1b1-R：5′-CTCATGCTCACAGC CGCT-3′，擴(kuò)增片段長度為250 bp。

引物2[7]鑒定非 Pinb-D1b類型，引物序列為Pinb-D1b2-F：5′-ATGAAGACCTTATTCCTCC TA-3′； Pinb-D1b2-R：5′-CTCATGCTCACAGC CGCC-3′，擴(kuò)增片段長度為250 bp。

引物3[7]鑒定 Pina-D1b類型，引物序列為Pina-N1-F：5′-AATACCACATGGTTCTAGATA CTG-3′； Pina-N1-R：5′-GCAATACAAAGGAC CTCTAGATT-3′，擴(kuò)增片段長度為776 bp。

引物4[7]克隆 Pinb-D1基因，引物序列為 Pinb-D1-F：5′-GAGCCTCAACCCATCTATTC ATC-3′； Pinb-D1-R：5′-CAAGGGTGATTTT ATTCATAG-3′，擴(kuò)增片段長度為597 bp。

對經(jīng)引物1～3鑒定不屬于 Pinb-D1b變異類型并在 Pina-D1位點(diǎn)也未發(fā)生缺失突變的小麥品種，利用引物4克隆 Pinb-D1基因，送南京金斯瑞生物科技公司進(jìn)行測序以明確 Pinb-D1基因型。

PCR反應(yīng)在ABI 2720 thermal cycler上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：10 μL 2×PCR mix (Vazyme, P112)、上、下游引物(10 pmol·μL-1)各0.5 μL、100 ng模板DNA，用ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠(EB)染色，UV掃描成像。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS軟件采用LSD法進(jìn)行樣本間多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 長江中下游麥區(qū)小麥品種的籽粒硬度

SKCS測定結(jié)果(表1)表明，105份供試材料中，軟質(zhì)麥有55份，占供試材料的52.4%；硬質(zhì)麥有40份，占供試材料的38.1%；混合麥有10份，占供試材料的9.5%。以上結(jié)果表明，長江中下游麥區(qū)軟質(zhì)麥品種相對較多，其次為硬質(zhì)麥品種，混合麥品種最少。

2.2 長江中下游麥區(qū)小麥品種puroindoline基因的等位變異

根據(jù)籽粒硬度分子理論模型[24]，軟質(zhì)麥硬度基因型為野生型( Pina-D1a/ Pinb-D1a)，因此，本試驗(yàn)針對40份硬質(zhì)麥和10份混合麥分析了其硬度基因變異類型。

表1 長江中下游麥區(qū)小麥品種籽粒硬度及puroindoline基因型

-代表野生型 Pina-D1a或 Pinb-D1a。

- represents the wild type Pina-D1a or Pinb-D1a.

首先，利用引物1和引物2對 Pinb-D1b變異類型進(jìn)行鑒定，PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，有31份小麥品種為 Pinb-D1b變異類型(圖1)。

對剩余19份材料利用引物3對 Pina-D1b變異類型進(jìn)行檢測。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，有11份小麥品種屬于 Pina-D1b變異類型(圖2)。

M: DL2000 marker；1：寧麥13；2：寧麥24；3：生抗2號；4：生選3號；5：生選4號；6：揚(yáng)麥158；7：揚(yáng)麥10號；8：揚(yáng)麥16；9：鎮(zhèn)麥5號；10：鎮(zhèn)麥8號；11：鎮(zhèn)麥9號；12：鎮(zhèn)麥10號；13：南農(nóng)9918；14：蘇麥5號；15：蘇麥8號；16：寧豐518；17：華麥6號；18：寧糯麥1號；19：申河麥1號；20：隆麥28；21：農(nóng)豐126；22：鄂麥26；23：襄麥25；24：襄麥55；25：皖麥42；26：安農(nóng)92484；27：寧麥19；28：揚(yáng)麥17；29：揚(yáng)麥23；30：鄂麥15；31：輪選22；32：中國春(CK)。

M: DL2000 marker; 1: Ningmai 13; 2: Ningmai 24; 3: Shengkang 2; 4: Shengxuan 3; 5: Shengxuan 4; 6: Yangmai 158; 7: Yangmai 10; 8: Yangmai 16; 9: Zhenmai 5; 10: Zhenmai 8; 11: Zhenmai 9; 12: Zhenmai 10; 13: Nannong 9918; 14: Sumai 5; 15: Sumai 8; 16: Ningfeng 518; 17: Huamai 6; 18: Ningnuomai 1; 19: Shenhemai 1; 20: Longmai 28; 21: Nongfeng 126; 22: Emai 26; 23: Xiangmai 25; 24: Xiangmai 55; 25: Wanmai 42; 26: Annong 92484; 27: Ningmai 19; 28: Yangmai 17; 29: Yangmai 23; 30: Emai 15; 31: Lunxuan 22; 32: Chinses Spring (Wild type).

圖1 利用引物1(A和B)和引物2(C和D)鑒定小麥 Pinb-D1b類型

Fig.1 Identification of Pinb-D1b allele in bread wheat using primer pairs 1(A and B) and 2(C and D)

M: DL2000 marker；1：寧麥10；2：寧麥11；3：寧麥12；4：寧麥15；5：寧麥17；6：寧麥22；7：寧麥23；8：南農(nóng)06Y86；9：鄂麥19；10：鄂麥22；11：皖麥32；12：中國春(CK)。

M: DL2000 marker; 1:Ningmai 10; 2:Ningmai 11; 3:Ningmai 12; 4:Ningmai 15; 5:Ningmai 17; 6:Ningmai 22; 7:Ningmai 23; 8:Nannong 06Y86; 9:Emai 19; 10:Emai 22; 11:Wanmai 32; 12:Chinese Spring (Wild type).

圖2 利用引物3鑒定小麥 Pina-D1b類型

Fig.2 Identification of Pina-D1b allele in bread wheat using primer pair 3

用引物4進(jìn)一步對剩余的8份不屬于 Pinb-D1b類型及 Pina-D1位點(diǎn)也沒有發(fā)生突變的小麥品種進(jìn)行 Pinb-D1基因克隆、測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有4份小麥品種(揚(yáng)糯麥1號、鎮(zhèn)麥168、鄂麥17和鄂麥18)為 Pinb-D1p變異類型，另外4份小麥品種(蘇麥3號、鄂麥14、皖麥27和皖麥54)在Pinb位點(diǎn)為野生型( Pinb-D1a)。

綜上，在鑒定的105份小麥品種中， Pinb-D1b基因型有31份，突變頻率為29.5%； Pina-D1b基因型有11份，突變頻率為10.5%； Pinb-D1p基因型有4份，突變頻率為3.8%。

2.3 不同puroindoline基因等位變異的籽粒硬度比較

上述分析表明，在長江中下游麥區(qū)的105份小麥品種中存在4種puroindoline基因型(表2)。野生型( Pina-D1a/ Pinb-D1a)籽粒硬度平均值最小，僅為31，顯著低于其余三種基因型的籽粒硬度； Pina-D1b/ Pinb-D1a類型籽粒硬度平均值最高，為78； Pina-D1a/ Pinb-D1b和 Pina-D1a/ Pinb-D1p類型籽粒硬度分別為70和62，但二者之間無顯著性差異。

3 討 論

籽粒硬度與品質(zhì)密切相關(guān)，明確小麥籽粒硬度概況以及Pina和Pinb等位變異類型分布特點(diǎn)對于小麥品質(zhì)改良具有重要意義。李根英等[8]、張福彥等[9]和劉紅美等[14]對黃淮麥區(qū)小麥品種(系)及核心種質(zhì)資源的分析表明，硬質(zhì)麥在黃淮麥區(qū)占有較高的比例，軟質(zhì)麥和混合麥所占比例較低。王 亮等[15]、叢 花等[16]、王雪玲等[17]、劉 麗等[25]和張 晶等[26]研究發(fā)現(xiàn)新疆、青海、云南和陜西等地區(qū)小麥品種(系)也以硬質(zhì)麥為主。

表2 不同puroindoline基因型的籽粒硬度指數(shù)

平均值后的不同字母表示基因型間差異顯著(P<0.05)。

Different letters following the mean value indicate the difference was significant at 0.05 level.

本研究對105份小麥籽粒硬度的分析表明，不同于以上地區(qū)，長江中下游麥區(qū)軟質(zhì)麥較多，所占比例為52.4%，硬質(zhì)麥和混合麥較少，分別占38.1%和9.5%。張 曉等[22]發(fā)現(xiàn)21份揚(yáng)麥系列小麥品種中，軟質(zhì)麥所占比例高達(dá)76.2%。何中虎等[27]報道，長江中下游麥區(qū)以中筋麥為主，同時沿江及沿海沙土地區(qū)是我國重要的弱筋小麥產(chǎn)區(qū)。因此，該區(qū)域軟質(zhì)麥品種較多很可能與中筋麥和弱筋麥的廣泛分布有關(guān)。

隨著小麥籽粒硬度遺傳基礎(chǔ)研究的逐步深入，在普通小麥中先后發(fā)現(xiàn)了19種 Pinb-D1變異類型和11種 Pina-D1變異類型[7]。有研究表明， Pinb-D1b類型在硬質(zhì)麥中占主導(dǎo)地位，但常見于育成小麥品種(系)[8-9, 14, 21, 26,28]。而在農(nóng)家品種或地方品種中，情況則有所不同。李根英等[8]、劉紅美等[14]和叢 花等[16]對黃淮麥區(qū)和新疆地區(qū)農(nóng)家品種和地方品種的分析表明， Pinb-D1p類型在硬質(zhì)麥中最為常見，而李善福等[18]對西藏地方品種的分析發(fā)現(xiàn) Pinb-D1c類型在硬質(zhì)麥中具有較高的比例。張 曉等[22]分析了21份揚(yáng)麥系列品種的籽粒硬度基因，發(fā)現(xiàn)揚(yáng)麥系列只存在 Pinb-D1b一種變異類型。本研究表明，所調(diào)查的105份小麥品種中存在 Pina-D1b、 Pinb-D1b和 Pinb-D1p三種變異類型，其中 Pinb-D1b所占比例最高，與前人研究發(fā)現(xiàn) Pinb-D1b類型在硬質(zhì)麥中占主導(dǎo)地位的研究結(jié)果一致。本研究基本反應(yīng)了該地區(qū)小麥育成品種籽粒硬度基因型的分布，對該地區(qū)農(nóng)家品種和地方品種籽粒硬度基因型的分布有待進(jìn)一步研究。

在本研究發(fā)現(xiàn)的puroindoline基因型中， Pina-D1b類型籽粒硬度顯著高于 Pinb-D1b、 Pinb-D1p和野生型， Pinb-D1b和 Pinb-D1p類型籽粒硬度顯著高于野生型，但二者之間并無顯著性差異，與劉紅美等[14]和陳 鋒等[21]對不同puroindoline基因型的小麥品種籽粒硬度關(guān)系的研究結(jié)果一致。擁有PINA蛋白缺失類型的小麥品種籽粒硬度值都普遍偏高[29]，但有報道表明， Pinb-D1c類型也具有較高的籽粒硬度[17-18, 21]。在本研究調(diào)查的105份小麥品種中未發(fā)現(xiàn) Pinb-D1c類型，有關(guān) Pinb-D1c類型與其他類型籽粒硬度的關(guān)系有待研究。研究表明，擁有 Pinb-D1b變異類型的小麥在磨粉、饅頭、面條和面包加工品質(zhì)等方面均略優(yōu)于其他類型[29-34]，這很可能是在育種過程中硬質(zhì)麥中的 Pinb-D1b類型逐步取代較古老的農(nóng)家種和地方品種中 Pinb-D1p和 Pinb-D1c等類型的重要原因。與 Pinb-D1b變異類型相比，PINA蛋白缺失類型可能更適合于制作印度薄餅[13]。因此，明確了長江中下游麥區(qū)歷年育成小麥品種籽粒硬度的基因型，在今后的育種過程中，可以根據(jù)育種目標(biāo)有選擇的加以利用。

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Allelic Variation ofpuroindolineAlleles in Bread Wheats from Lower-Middle Reaches of the Yangtze River

WANG Huadun1,GAO Chunlei2,ZHANG Peng1, ZHANG Yu1,ZHANG Pingping1,MA Hongxiang1

(1.Jiangsu Academy of Agricultural Sceinces/Jiangsu Provincial Key Laboratory for Agrobiology,Nanjing,Jiangsu 210014,China; 2.College of Agriculture,Nanjing Agricultural University,Nanjing,Jiangsu 210095,China)

To elucidate the grain hardness index and the distribution of hardness-related gene in the lower-middle reaches of the Yangtze River wheat region, 105 wheat varieties widely collected from this region were used in this study. Grain hardness was examined by a Single Kernel Characterization System (SKCS). Molecular detection and sequencing analysis were used to identifypuroindolinealleles. The results showed that soft wheat accounts for 52.4%, while hard and mixed wheat account for 38.1% and 9.5%, respectively. Three mutantpuroindolinealleles of Pinb-D1b, Pina-D1b and Pinb-D1p were detected in hard and mixed wheat. Of them, the frequency of Pinb-D1b was the highest, with the percentage of 29.5%, followed by Pina-D1b and Pinb-D1p, with the percentage of 10.5% and 3.8%, respectively.

Bread wheat; Grain hardness;puroindolinealleles

時間：2017-04-07

2016-12-30

2017-03-15 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31501819)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-3)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20161375)

E-mail：hdwang@jaas.ac.cn

馬鴻翔(E-mail:hxma@jaas.ac.cn)

S512.1；S331

A

1009-1041(2017)04-0438-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170407.1020.004.html