超克+楊景峰+李佳怡

摘要：概述了汽車尾氣的污染狀況及危害、汽車尾氣顆粒物的檢測、斑馬魚的優(yōu)點(diǎn)，探討了斑馬魚用于汽車尾氣顆粒物毒性檢測的可行性。

關(guān)鍵詞：汽車尾氣顆粒物；生物監(jiān)測；斑馬魚胚胎；毒性

中圖分類號：X830.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-672X（2017）02-0074-05

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2017.02.014

現(xiàn)今，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及經(jīng)濟(jì)水平的提高，汽車已經(jīng)成為人類不可缺少的交通運(yùn)輸工具。它給人們的生活和工作帶來了便利的同時，也帶來了極大的污染：汽車尾氣危害人體健康，破壞城市建筑物及景觀，對人類的生存環(huán)境造成極大影響[1]。伴隨汽車工業(yè)的快速發(fā)展、汽車產(chǎn)量和保有量不斷增加，汽車尾氣大量排放已逐漸成為大氣的主要污染來源[2-3]。

1 汽車尾氣的危害及污染狀況

汽車尾氣排放對環(huán)境的污染主要集中表現(xiàn)在城市的空氣污染，尾氣中含有上百種的化合物，排放入空氣后容易形成酸雨、光化學(xué)煙霧、霧霾等現(xiàn)象[4]。汽車尾氣中所包含的物質(zhì)主要有一氧化碳（CO）、氮氧化物（NOx）、碳?xì)浠衔铮℉C）和細(xì)微顆粒物等，這些污染物對人體健康具有潛在的、長久危害，對生態(tài)環(huán)境同樣造成直接污染和破壞[5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每千量汽車每天排出一氧化碳約3000kg，碳?xì)浠衔镔|(zhì)200-400kg，氮氧化合物50-150kg。一氧化碳與血紅蛋白有高度的親和力，比氧氣要大210倍以上，當(dāng)空氣中一氧化碳濃度升高時，血紅蛋白與一氧化碳相結(jié)合，喪失運(yùn)輸氧的能力，可危及人和動物生命。碳?xì)浠衔镏邪喾N有機(jī)物成分，部分有機(jī)成分被證明是非常強(qiáng)的致癌物質(zhì)，如苯、苯并芘等多環(huán)芳烴類物質(zhì)。尾氣中的氮氧化合物含量相對較少，但毒性卻非常的大，達(dá)到一定濃度就會對人的呼吸系統(tǒng)和免疫功能造成嚴(yán)重危害。此外，汽車尾氣中的含鉛化合物很多，可隨呼吸進(jìn)入血液，并長期蓄積在體內(nèi)，引起貧血、腦損傷等癥狀，還會影響兒童正常成長和智力發(fā)育低下，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重癡呆癥狀。鉛還能經(jīng)由母體血液進(jìn)入胎盤，危害胎兒健康。2000年開始，我國在全國范圍內(nèi)推廣了無鉛汽油，解決了汽車尾氣中鉛污染的問題，但事實(shí)上，無鉛汽油仍然存在不少環(huán)境污染問題[6]。近年來，隨著霧霾等大氣污染問題的日益突出，也使得大量細(xì)顆粒物（fine particulate matter，PM2.5）走進(jìn)了人們的視野，細(xì)顆粒物對大氣的污染形勢十分嚴(yán)峻。

2 汽車尾氣顆粒物

汽車顆粒物污染是對人體健康危害最大的大敵。顆粒物被定義為可懸浮于空氣中的固體和液體微粒，根據(jù)粒徑大小可分為總懸浮顆粒物（粒徑≤100μm）、粗顆粒物（粒徑≤10μm，即PM10）和細(xì)顆粒物（粒徑≤2.5μm，即PM2.5，也成為可入肺顆粒物）、超細(xì)微粒（粒徑≤100 nm）等。目前國內(nèi)大多數(shù)研究集中在細(xì)顆粒物對人體各器官的損害。汽車尾氣排出的顆粒物表面較粗糙且呈多空隙狀態(tài)，具有較強(qiáng)的吸附能力[7]。汽油燃燒過程中產(chǎn)生的大量有機(jī)物、未燃油和揮發(fā)性有機(jī)物等都會吸附在其上。分析結(jié)果顯示，顆粒物吸附有多種有機(jī)物，其中主要包括酸、酯、烷烴、多環(huán)芳烴類（PAHs）如芘、蒽等、雜環(huán)化合物（苯并噻唑）、含氧化合物等。無鉛汽油車尾氣排出顆粒物，顆粒物吸附的有機(jī)物所占的比例較高， 而且由于無鉛汽油中芳烴、烯烴的含量高，顆粒物也含有多種的芳烴化合物 [8]。顆粒物對人體的毒性作用取決于顆粒物的來源、濃度、粒徑、化學(xué)組成（過渡金屬、可溶性組分、有機(jī)成分、生物成分）、酸性、吸濕性、可溶性，以及與其他污染物的協(xié)同作用[9]。

在尾氣顆粒物排放上，美國是全球最早制訂排放標(biāo)準(zhǔn)的國家之一，也是汽車排放法規(guī)最嚴(yán)的國家，其中聯(lián)邦標(biāo)準(zhǔn)（EPA2010）最為嚴(yán)格，比如其規(guī)定的重卡柴油機(jī)氮氧化物和顆粒物，每制動馬力1小時的排放上限分別為 0.2 g 和 0.01 g，幾乎相當(dāng)于零排放。近些年，歐洲標(biāo)準(zhǔn)的限值也是越來越嚴(yán)。日本也在很早之前就對細(xì)顆粒物的來源和危害有過很多的研究，得出汽車排放的顆粒物是城市中PM2.5的主要來源，而且粒徑相對較小的細(xì)顆粒物還具有致癌作用[10]。而我國自從細(xì)顆粒物指標(biāo)加入新修訂的 GB3095-2012《環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》以來，機(jī)動車細(xì)顆粒物排放才得到重視，尾氣顆粒物毒性的生物監(jiān)測也成為一個研究熱點(diǎn)。由于采樣和檢測設(shè)備、技術(shù)和方法的缺乏，尾氣顆粒物的生成機(jī)理、檢測方法、毒性效應(yīng)等還需要進(jìn)一步地研究。

3 汽車尾氣顆粒物生物監(jiān)測現(xiàn)狀

以下內(nèi)容是有關(guān)不同種類的生物學(xué)監(jiān)測介紹。

3.1 細(xì)胞系及酵母等監(jiān)測與研究

3.1.1 人癌細(xì)胞

張遵真等[11]為研究汽車尾氣的毒性作用機(jī)制，以人肺腺癌A549細(xì)胞為研究對象，采用MMT試驗(yàn)檢測汽車尾氣顆粒物對細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果顯示出明顯的細(xì)胞毒性，且隨濃度的增加，細(xì)胞存活率也下降。

3.1.2 重組基因酵母

王娟等[12]的實(shí)驗(yàn)中，采用環(huán)境雌激素基因重組酵母測評系統(tǒng)，測定了汽車尾氣的雌激素活性。結(jié)果表明汽車尾氣在最高劑量時吸光度值（A600）遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他各劑量組，說明汽車尾氣超過一定濃度范圍會對酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致酵母細(xì)胞死亡。同時，汽車尾氣在個別劑量時檢出雌激素活性，說明汽車尾氣具有微弱雌激素樣作用。此外，吳文忠等[13]用重組基因酵母檢測了污泥、土壤中的類雌激素污染物，發(fā)現(xiàn)樣品餾分中多環(huán)芳烴（PAHs）的含量與雌激素的活性正相關(guān)。通過研究尾氣顆粒物的組成，結(jié)合一些研究結(jié)果和參考文獻(xiàn)，有理由推測汽車尾氣中的雌激素樣作用可能與尾氣顆粒物中的多環(huán)芳烴類（PAHs）等物質(zhì)有關(guān)。

3.2 昆蟲系統(tǒng)監(jiān)測與研究

這是一個有趣的研究領(lǐng)域，高慧璟等[14]研究了道路交通污染對昆蟲的影響。其中提到，汽車尾氣中的細(xì)顆粒物飄落到公路干線兩側(cè)的植物表面，與植物組織結(jié)合后很難分解，通過食物鏈轉(zhuǎn)移到植食性昆蟲及其天敵體內(nèi)，并造成嚴(yán)重威脅。根據(jù)昆蟲對污染物的反應(yīng)類型進(jìn)行區(qū)系分類，開展昆蟲系統(tǒng)調(diào)查，同時利用昆蟲對交通污染物的特異性反應(yīng)，進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測指示生物研究[15]。

3.3 哺乳動物監(jiān)測與研究

哺乳動物的監(jiān)測與研究主要是圍繞大鼠及小鼠用于汽車尾氣顆粒物毒性監(jiān)測展開的。

3.3.1 呼吸系統(tǒng)損害

在早年，彭寶成等[16]就曾采用大鼠氣管內(nèi)注入尾氣顆粒物的形式觀察生物效應(yīng)。得出結(jié)論，汽車尾氣顆粒物能引起肺組織及細(xì)胞染色體損傷。近些年，顆粒物致呼吸系統(tǒng)的損害依然是比較常見的研究方向。肖純凌等[17]，通過制備動物模型，即SPF級Wistar大鼠氣管注入PM2.5混懸液及其他對照樣本，觀測暴露不同時期大鼠氣管和肺泡的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果大鼠氣管掃描電鏡觀察可見，隨著染毒劑量的增高，氣管上皮纖毛粘連、紊亂； PM2.5對大鼠肺組織的損害比對氣管上皮的損害嚴(yán)重得多，可使肺纖維增生，肺泡腔變小，甚至使肺泡上皮細(xì)胞脫落溶解。與大鼠一樣，作為哺乳動物首先考慮尾氣對其肺部損傷的作用。唐思文等[21]選擇SPF級雄性昆明小鼠（Kunming mice，KM小鼠）作為實(shí)驗(yàn)動物。隨機(jī)分組，采用自制汽車尾氣染毒柜進(jìn)行短時、多次、連續(xù)染毒。通過肺組織HE染色、免疫組化法、Western印跡法等實(shí)驗(yàn)方法檢測發(fā)現(xiàn)汽車尾氣暴露后，小鼠肺組織出現(xiàn)明顯病理損傷，其作用與多個炎癥因子表達(dá)增高和氧化損傷有關(guān)。

3.3.2 生殖功能損害

嚴(yán)超等[18]研究，建立Sprague Dawley（SD）大鼠汽車來源PM2.5長期暴露模型，研究PM2.5長期暴露對SD大鼠生殖功能的損傷及其機(jī)制。將足夠數(shù)量SD雄性大鼠樣本 隨機(jī)分配成 3 組： 生理鹽水對照組，低劑量組，高劑量組。連續(xù)暴露，統(tǒng)計(jì)雌鼠受孕率，剩余實(shí)驗(yàn)鼠取材，進(jìn)行精子計(jì)數(shù)和畸形率測定、睪丸組織病理學(xué)檢測以及睪丸組織蛋白表達(dá)檢測。通過實(shí)驗(yàn)得出，PM2.5長期暴露損傷血睪屏障的完整性，進(jìn)而破壞生精微環(huán)境的穩(wěn)定，生精細(xì)胞發(fā)育異常，精子生成數(shù)量減少和質(zhì)量降低，并最終導(dǎo)致生殖功能損傷。

3.3.3 胚胎毒性及遺傳毒性

比較特別的研究，王海青等[19]使用妊娠期Wistar大鼠，通過動式染毒裝置進(jìn)行吸入染毒，觀察汽車尾氣對妊娠結(jié)局及胎鼠的影響，得出汽車尾氣具有胚胎毒性和遺傳毒性的結(jié)論。指出尾氣中的多環(huán)芳烴（PAHs）可以通過胎盤屏障，造成胎兒生長發(fā)育受限。同樣，根據(jù)葉雯婧等[20]等報道，通過對汽車尾氣顆粒物進(jìn)行采樣，制備提取液。向孕鼠妊娠起經(jīng)腹腔注射，按二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）對照組、低濃度組合高濃度組進(jìn)行研究。結(jié)果高劑量組非存活胎鼠發(fā)生率和活胎鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩發(fā)生率均高于對照組；高低劑量組均出現(xiàn)外觀畸形的活胎鼠，對照組的活胎鼠外觀正常。通過HE染色觀察到不同程度的組織病理損傷。得出汽車尾氣顆粒物可造成胎盤組織病理損傷，增加了宮內(nèi)發(fā)育遲緩和外觀畸形的發(fā)生率的結(jié)論。

3.3.4 其他器官或者多器官的損害

與上述同樣的暴露方法及實(shí)驗(yàn)手段，還可以研究尾氣顆粒物的多器官毒性。結(jié)果顯示，與正常組相比，PM2.5暴露組的SD大鼠體重明顯降低，且肺部外觀改變明顯，肺臟及心臟組織結(jié) 構(gòu)受損，出現(xiàn)心肌水腫，炎癥反應(yīng)明顯，肝臟、脾臟及腎臟亦有炎癥表現(xiàn)[22]。在小鼠，張志紅等[23]利用汽車尾氣顆粒物有機(jī)提取物進(jìn)行腹腔注射染毒。測定小鼠外周血白細(xì)胞分類、體重增長和臟器重量、抗體形成細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能實(shí)驗(yàn)4個指標(biāo)。結(jié)果表明，尾氣顆粒物對小鼠免疫功能有抑制作用，并且是多方面的。

4 斑馬魚在科研中的優(yōu)勢

斑馬魚（Danio rerio）是一種常見的小型熱帶淡水魚。因?yàn)轶w側(cè)有類似斑馬一樣的條紋而得名。斑馬魚體型纖細(xì)，成魚體長約4cm，成梭形或紡錘形。它的世代時間短，3～4個月即可達(dá)到性成熟。斑馬魚常年產(chǎn)卵，成熟雌魚每隔幾天可產(chǎn)幾百枚卵。卵子體外受精、發(fā)育，胚胎發(fā)育同步且速度快，胚體透明。斑馬魚對水質(zhì)要求不高，發(fā)育溫度為25～31℃。目前斑馬魚己逐漸成為最受關(guān)注的脊椎動物發(fā)育生物學(xué)模式之一，在環(huán)境毒理學(xué)、病理毒理學(xué)等方面顯示出了很大的優(yōu)勢[24]。

概括來說，斑馬魚作為模式生物有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）成本低：由于斑馬魚體型小，所需養(yǎng)殖空間少，養(yǎng)殖成本低；能大規(guī)模養(yǎng)殖繁育，便于獲得大量樣本；染毒劑量少，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本；（2）易觀察：斑馬魚胚胎透明，可以清楚地觀察到各個階段的發(fā)育情況；（3）可利用信息豐富：斑馬魚由于基因信息全面且已有多種轉(zhuǎn)基因魚模型，作為一種國際標(biāo)準(zhǔn)的動物模型而普遍應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、基因組學(xué)及生態(tài)毒理學(xué)的研究中；（4）斑馬魚胚胎敏感度高，這對環(huán)境毒理評價具有重要意義；（5）研究方法多：如整體原位雜交技術(shù)、整體免疫組化技術(shù)、熒光技術(shù)等；（6）具有遺傳毒性：斑馬魚生長周期短，有利于次代的檢測與觀察。

在我國，斑馬魚被廣泛用于胚胎發(fā)育學(xué)研究領(lǐng)域，一般常用動物模型如小鼠屬于胎盤動物，胚胎操作時不能離開母體，實(shí)驗(yàn)分析時就需要大量推論，用時超過20天，需要大量的資金和人力。而斑馬魚的胚胎體外發(fā)育且發(fā)育非常迅速，各發(fā)育階段有其明顯的特征，易于準(zhǔn)確地在各不同階段進(jìn)行處理[25-26]。

5 斑馬魚胚胎作為尾氣顆粒物毒性監(jiān)測模 型的可行性

顆粒物對人體的危害與其來源以及復(fù)雜的理化性質(zhì)（如表面形態(tài)特征、吸附組分等）有著很大的關(guān)系，它對人體可能產(chǎn)生諸多危害，毒性機(jī)制也不唯一，因此對顆粒物的毒性需要進(jìn)行高通量評價[27-28]。而斑馬魚胚胎的經(jīng)濟(jì)、快速、敏感，可大面積高通量初期篩選與檢測，突出了其顯著優(yōu)點(diǎn)。

給斑馬魚胚胎染毒所用的汽車尾氣顆粒物，使用大中流量大氣采樣裝置和稱重過的玻璃纖維濾膜進(jìn)行采樣，也可采用直接刮取排氣管上積碳的方法。采樣后的濾膜進(jìn)行再次稱重，記錄。浸泡于酒精或其他溶劑經(jīng)超聲波震蕩萃取，過濾后提純，用二甲基亞砜（DMSO）溶劑定容，提取液4℃保存[29]。實(shí)驗(yàn)動物斑馬魚胚胎，選用受精后2h的斑馬魚進(jìn)行梯度染毒，因?yàn)榘唏R魚胚胎及幼魚呈透明狀，因此它在形態(tài)學(xué)方面極易觀察。在光學(xué)顯微鏡下可以很直觀的看到他的發(fā)育狀況是否正常。可以通過軟骨染色觀察顆粒物提取液對斑馬魚胚胎軟骨發(fā)育的影響。也可以深入的做病理組織學(xué)及其酶類變化方面的的檢測. 還可以通過切片，以及HE染色來觀察尾氣顆粒物對斑馬魚胚胎肝臟等器官的組織學(xué)變化，通過二惡英類物質(zhì)標(biāo)志物質(zhì)細(xì)胞色素P450 （CYP1A）的誘導(dǎo)期強(qiáng)度（如CYP1A抗體染色或者定量PCR）檢測二惡英類物質(zhì)的污染程度。

綜上所述，表明斑馬魚胚胎作為汽車尾氣顆粒物毒性生物監(jiān)測測模型具有實(shí)際可行性。尤其是污染物的高通量檢測，為尾氣凈化技術(shù)、污染檢測技術(shù)及污染物過濾技術(shù)提供高通量檢測。

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