吳鵬飛+王麗娟+劉昭+切巖祥和

摘要：以栽培品種京藏香草莓（Fragaria ananassa Duch.）花藥（單核靠邊期）為材料，75%乙醇為對照，研究了5種不同組合的消毒方式對草莓花藥愈傷組織的誘導(dǎo)影響。結(jié)果表明，處理T1經(jīng)過Tween-80消毒后，用75%乙醇進行消毒30 s可以有效控制花藥污染，同時還能減少花藥褐化率；其次是處理T3，該處理雖能減少污染，但是褐化率略高于T1；處理T0（CK）、T2均有不同程度的污染，處理T4褐化率最高。

關(guān)鍵詞：草莓（Fragaria ananassa Duch.）；花藥；消毒方式；愈傷組織

中圖分類號：S668.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）07-1364-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.042

Effects of Different Sterilization Methods on Protected Strawberry Anther Callus Induction

WU Peng-fei1， WANG Li-juan1， LIU Zhao1， KIRRIIWA Yoshikazu2

（1.Department of Horticulture， Tianjin Agricultural College， Tianjin 300384，China；

2.Faculty of Agriculture， Shizuoka University， Shizuoka 4228529， Japan）

Abstract： Using varieties of “Jingzangxiang” strawberry（Fragaria ananassa Duch.） anther（mononuclear side） as materials，75% alcohol as a reference， the five different combination ways of disinfection effect on strawberry anther callus induction were studied. The experimental results showed that the treatment T1 after Tween-80 disinfection disinfected with 75% alcohol could effectively control the pollution of anther， at the same time it also reduced the browning rate of anther. T3 could reduce pollution， but the browning rate is slightly higher than the T1， T0（CK） and T2 have different degrees of pollution， T4 browning was the most serious.

Key words： strawberry（Fragaria ananassa Duch.）； anther； disinfection method； callus

草莓（Fragaria ananassa Duch.）為薔薇科草莓屬多年生草本植物，原產(chǎn)南美，中國各地及歐洲等地廣為栽培。草莓是高度雜合的多倍體植物，育種上可利用草莓花藥組織培養(yǎng)進而獲得單倍體植株，經(jīng)染色體加倍形成純合二倍體[1，2]，為研究草莓遺傳育種提供借鑒。研究表明草莓通過花藥組織培養(yǎng)獲得的植株脫毒率可達到100%，部分經(jīng)染色體鑒定后的植株可直接用于生產(chǎn)[3，4]。然而不同的消毒方式對草莓花藥的組織培養(yǎng)具有一定影響，不同的消毒試劑、消毒時間等都直接影響草莓花藥組織培養(yǎng)，本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上，研究了5種不同組合消毒方式對草莓花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響，以期獲得最適宜草莓花藥組織培養(yǎng)的消毒方式。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及預(yù)處理

以生產(chǎn)上廣泛栽培的京藏香草莓花藥為試驗材料，于2015年12月份采集無病蟲害植株的第一花絮的草莓花苞，置于Leica DM4000B正置顯微鏡下進行鏡檢，選擇單核靠邊期的草莓花藥于4 ℃冰箱預(yù)處理48 h[5]。

1.2 方法

1.2.1 花藥消毒 花藥消毒設(shè)置5個處理（表1）：用洗衣粉對花苞進行表面清洗處理，自來水沖洗20 min。對照組T0（CK），將沖洗好的花苞置于超凈工作臺中用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗4次；處理1（T1），將表面處理過的花苞加入一滴Tween-80搖勻靜止5 min，然后自來水沖洗20 min，轉(zhuǎn)入超凈工作臺中用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗4次；處理2（T2），將沖洗好的花苞置于超凈工作臺中用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗4次，加入0.1% HgCl2消毒5 min，無菌水沖洗4次；處理3（T3），用Tween-80對花苞進行消毒后置于超凈工作臺中用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗4次，加入0.1% HgCl2消毒5 min，無菌水沖洗4次；處理4（T4），將沖洗好的花苞置于超凈工作臺中用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗4次，加入2% NaClO消毒5 min，無菌水沖洗4次。

1.2.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件 選擇飽滿的花藥（完全去除花絲）接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，培養(yǎng)基中蔗糖30 g/L，瓊脂粉7 g/L，pH 5.8。將接種花藥置于（25±1）℃下暗培養(yǎng)3 d[6]，轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)箱，光照時間16 h/d，光照度2 500 lx，濕度65%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個處理接種30瓶，每瓶接種10個花藥，重復(fù)3次，即每個處理共接種300個花藥。在接種后每 3 d統(tǒng)計一次污染數(shù)（若有污染轉(zhuǎn)接至備用培養(yǎng)基），30 d后統(tǒng)計各處理污染數(shù)、褐化數(shù)及出愈數(shù)。將數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。污染率=污染的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%；褐化率=（褐化的外植體總數(shù)+污染外植體數(shù)）/接種外植體總數(shù)×100%；出愈率=出愈傷的外植體總數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對草莓花藥組織培養(yǎng)污染率的影響

由表2可知，不同消毒處理對草莓花藥組織進行消毒后，一定程度上可減少組織培養(yǎng)中的污染率，其中T1、T3處理可以顯著降低污染率，其次是T2、T4，T0（CK）處理效果最差。

2.2 不同消毒處理對草莓花藥組織培養(yǎng)褐化率的影響

由表3可知，T1處理能夠顯著降低草莓花藥組織培養(yǎng)中的褐化率，其次是T2、T3，其中T3處理污染率最低，但是隨著加入0.1% HgCl2進行消毒會增加花藥的褐化率；在各處理中T0（CK）、T4褐化最嚴重。

2.3 不同消毒處理對草莓花藥組織培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

由表4可知，T1處理草莓花藥愈傷組織誘導(dǎo)率最高，T0（CK）、T2、T3、T4較T1處理愈傷組織誘導(dǎo)率低，其中T0（CK）處理只用75%乙醇進行表面處理不能徹底消毒；在進行花藥預(yù)處理的過程中，花苞會有不程度開放，此時75%乙醇進行消毒后繼續(xù)用0.1% HgCl2、2% NaClO消毒會增加草莓花藥的褐化率影響愈傷組織誘導(dǎo)率[7]。

3 小結(jié)與討論

通過花藥組織培養(yǎng)獲得的單倍體植株，對誘變育種和突變遺傳研究具有很高的價值，單倍體材料能在植株上較充分地顯現(xiàn)重組的配子類型，可以為育種生產(chǎn)提供新的遺傳材料。提高草莓花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率，除了對草莓花藥進行不同發(fā)育期的選擇、低溫預(yù)處理、不同培養(yǎng)基的篩選外，如何對草莓花藥進行有效地表面消毒直接關(guān)系到愈傷組織誘導(dǎo)率[8，9]。本試驗對5種消毒試劑進行篩選的過程中發(fā)現(xiàn)，T1處理中使用Tween-80進行清洗后，加入75%乙醇消毒可以顯著降低花藥的污染率，而且能夠降低草莓花藥的褐化率；T2、T3、T4經(jīng)75%乙醇消毒后分別用0.1% HgCl2、2% NaClO進行處理可以顯著減少污染的發(fā)生[10，11]，但是隨著花藥預(yù)處理過程中花苞的不同程度開放，繼續(xù)使用HgCl2和NaClO消毒會在一定程度上增加草莓花藥誘導(dǎo)的褐化率。

結(jié)果表明，用洗衣粉對花苞進行表面清洗后，用Tween-80浸泡沖洗后加入75%乙醇滅菌30 s能夠降低草莓花藥組織培養(yǎng)過程中的污染率和褐化率，該試驗結(jié)果可以為草莓花藥組織培養(yǎng)提供一定參考。

參考文獻：

[1] 趙永欽，吳新新，鄭 禾，等.草莓‘甜查理和‘章姬花藥培養(yǎng)及單倍體植株的獲得[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，17（5）：39-45.

[2] OWEN H R，MILLER A R.Haploid plant regeneration from anther cultures of three north American cultivars of strawberry（Fragria ananassa Duch.）[J].Plant Cell Reports，1996，15：905-909.

[3] 喬 奇，張振臣，靳秀蘭.草莓花藥培養(yǎng)脫毒技術(shù)研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2003，19（2）：26-27.

[4] 周厚成，何水濤.草莓病毒病研究進展[J].果樹學(xué)報，2003，20（5）：421-426.

[5] NA H，KIM D，CHUN C.Effects of cold pretreatment and medium composition on another culture initiation in strawberry[J].Korean Jour of Hort Sci and Tech，2011，29（5）：488-493.

[6] 孟志卿.草莓花藥組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（2）：440-441.

[7] 張玉君，彭興龍，張哲民，等.草莓組織培養(yǎng)與脫毒技術(shù)[J].河南林業(yè)科技，2009，29（11）：73-75.

[8] 范淑芳.不同消毒方式對華中枸骨組織培養(yǎng)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（16）：5007-5008.

[9] 晁慧娟，劉 敏，姬謙龍，等.“甜查理”草莓花藥培養(yǎng)脫毒技術(shù)[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2010，25（2）：18-21.

[10] 查中萍，柳 俊，劉定富.影響草莓花藥培養(yǎng)因素的分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（1）：24-28.

[11] 王利民，周 毅，陳龍友，等.植物組織培養(yǎng)中消毒劑的運用[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2002，20（1）：15-17.