巫麗娟 毛湘冰 余 冰 何 軍 黃志清 虞 潔 鄭 萍 羅鈞秋 陳代文(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，成都611130)

飼糧添加功能性復(fù)合添加劑對生長豬生長性能和免疫功能的影響

巫麗娟 毛湘冰 余 冰 何 軍 黃志清 虞 潔 鄭 萍 羅鈞秋 陳代文*
(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，成都611130)

本研究旨在考察飼糧中添加功能性復(fù)合添加劑對生長豬生長性能和免疫功能的影響。選取20頭平均體重為(21.06±1.98) kg的健康“杜×長×大”三元雜交生長豬，按體重相近的原則，隨機分為2個組，分別為基礎(chǔ)飼糧組(對照組)和在基礎(chǔ)飼糧中添加0.1%功能性復(fù)合添加劑的試驗飼糧組(添加劑組)，每個組10個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。試驗期14 d。結(jié)果表明，與對照組相比，飼糧添加功能性復(fù)合添加劑顯著提高了生長豬的平均日增重(ADG)(P<0.05)，極顯著提高了生長豬血清白細胞介素-10(IL-10)含量(P<0.01)，顯著或極顯著降低了生長豬血清白細胞介素-1(IL-1)和尿素氮(UN)含量(P<0.05或P<0.01)，并顯著或極顯著降低了生長豬血液白細胞內(nèi)與Toll樣受體(TLR)信號通路相關(guān)的核因子κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)和白細胞介素-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)mRNA的相對表達量(P<0.05或P<0.01)。綜上所述，飼糧中添加功能性復(fù)合添加劑可以改善生長豬的生長性能，而這可能與其可提高機體蛋白質(zhì)利用和調(diào)節(jié)機體免疫功能有關(guān)。

生長豬；功能性復(fù)合添加劑；生長性能；免疫功能

在畜禽生產(chǎn)中，作為飼料添加劑，抗生素已經(jīng)被用來抗應(yīng)激、促生長和防疾病。但飼用抗生素的濫用帶來了諸多社會問題，如耐藥性的不斷上升、在畜禽產(chǎn)品中的殘留等。因此，尋求抗生素替代品成為目前研究的焦點。研究表明，在畜禽飼糧中添加維生素D、維生素C、維生素E和黃芪多糖均具有提高生長性能和免疫功能的作用[1-4]。不同添加劑的作用效果不同，而將其制成復(fù)合添加劑可以起到相互補充和促進的作用。Molina等[5]研究表明，復(fù)合添加劑具有更好的抗氧化和抗炎癥作用。周顯清等[6]研究表明，維生素C與維生素E兩者作為添加劑共同添加到仔豬的飼糧中具有協(xié)同的作用。Zhu等[7]和Xu等[8]研究也表明，飼糧中添加由維生素C、維生素E、茶多酚、硫辛酸和乳酸菌等組成的復(fù)合添加劑能夠有效改善腸道功能提高仔豬生長性能。本研究旨在揭示通過飼糧添加一種主要成分為維生素C、維生素E、維生素D、黃芪多糖和葉酸等的功能性復(fù)合添加劑，研究其對生長豬生長性能和免疫功能的影響，旨在為該自主研制的功能性復(fù)合添加劑在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所使用的功能性復(fù)合添加劑成分及含量如下：維生素C 10.75%，葉酸0.21%，維生素A 0.67%，維生素D 3.77%，維生素E 6.00%，維生素B20.56%，黃芪多糖7.14%，碳酸氫鈉10.10%，葡萄糖60.80%。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

本試驗選取20頭初始體重為(21.06±1.98) kg的健康“杜×長×大”三元雜交生長豬，按體重相近的原則，隨機分為2個組，分別為基礎(chǔ)飼糧組(對照組)和在基礎(chǔ)飼糧中添加0.1%功能性復(fù)合添加劑的試驗飼糧組(添加劑組)，每個組10個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。試驗期14 d。

1.3 試驗飼糧

基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型，參考NRC(2012)25～50 kg生長豬營養(yǎng)需要量配制?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗飼糧按照試驗設(shè)計在基礎(chǔ)飼糧中添加0.1%的功能性復(fù)合添加劑，添加劑量等量替代玉米。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of the diet：VA 9 000 IU，VD33 000 IU，VE 20.0 IU，VK33.0 mg，VB11.5 mg，VB24.0 mg，VB63.0 mg，VB120.2 mg，煙酸 nicotinic acid 30.0 mg，泛酸 pantothenic acid 15.0 mg，葉酸 folic acid 0.75 mg，生物素 biotin 0.1 mg，F(xiàn)e 96.0 mg，Cu 5.6 mg，Zn 93.0 mg，Mn 3.7 mg，I 0.13 mg，Se 0.28 mg。

2)營養(yǎng)水平為計算值。Nutrient levels were calculated values.

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所教學(xué)科研試驗基地進行。試驗時間為2016年5月21日至2016年6月4日，試驗豬采用單籠飼養(yǎng)，自由飲水，每日飼喂3次(08:00、14:00、20:00)，少喂勤添，喂量以料槽內(nèi)略有剩余為度。豬舍溫度控制在27～28 ℃，相對濕度控制在70%左右。定期沖洗圈舍，保持圈舍通風、清潔、干燥和衛(wèi)生。

1.5 樣品采集

血樣采集：于試驗第15天對所有生長豬進行空腹采血10 mL，在室溫下放置45 min，3 000 r/min離心10 min，分離血清，-20 ℃保存。并采血3～5 mL緩慢注入含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中，慢慢顛倒混勻，用于分離血液中的白細胞。

1.6 測定指標與方法

1.6.1 生長性能

試驗期間每天計算采食量，計算試驗全期平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)，并于試驗第1和15天早上空腹稱重，計算試驗第1～14天的平均日增重(average daily gain，ADG)，且由ADFI和ADG計算料重比(feed to gain ratio，F(xiàn)/G)。

1.6.2 血清指標

血清尿素氮(urea nitrogen，UN)含量采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，嚴格按照試劑盒說明操作；血清白細胞介素(interleukin，IL)-1和IL-10含量采用上海諾淵實業(yè)有限公司酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒進行測定，嚴格按照試劑盒說明操作。

1.6.3 白細胞相關(guān)基因mRNA相對表達量

1.6.3.1 白細胞分離

白細胞分離按照天津灝洋生物制品科技有限公司動物外周血白細胞分離液試劑盒進行分離。具體操作如下：

1)取15 mL離心管，加入分離液3 mL。

2)將血液樣本緩慢小心注入分離液的液面上，在18～20 ℃以內(nèi)，400×g離心36 min。

3)最終液相分層，第1層淡黃色為稀釋的血漿；第2層是以單核細胞為主的白色云霧層狹窄帶；第3層無色透明為分離液層；第4層深紅色沉淀物為紅細胞層。

4)使用無菌的巴士吸管抽出分離液上層液體，棄去，用吸管小心吸取分離液層、單核細胞層和紅細胞層置于另一新離心管內(nèi)。

5)加入細胞洗滌液混勻，250×g離心10 min，棄去上清，用紅細胞裂解液除去紅細胞內(nèi)容物和碎片，加入細胞洗滌液再反復(fù)清洗。

6)清洗好后，加入1 mL Trizol，反復(fù)吹打，標記， -80 ℃保存。

1.6.3.2 相關(guān)基因的相對表達量

采用熒光定量PCR檢測白細胞中與Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)信號通路相關(guān)基因[核因子κB(nuclear factor kappa B cells，NF-κB)、髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88，MyD88)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)、白細胞介素-1受體相關(guān)激酶1(IL-1 receptor associated kinase 1，IRAK1)、白細胞介素-1受體相關(guān)激酶4(IL-1 receptor associated kinase 4，IRAK4)和IκB蛋白激酶α(IκB kinase α，IKK-α)]的相對表達量，用Primer Premier 5.0根據(jù)NCBI上提供的目的基因序列進行引物設(shè)計，設(shè)計好的引物序列(表2)送至成都康迪生物技術(shù)有限公司合成。按照試劑盒說明提取白細胞的總RNA，按照TaKaRa公司生產(chǎn)的Prime ScriptTMRT Reagents試劑盒上說明書嚴格操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以反轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板，用SYBR Green PCR Mix試劑盒檢測目的基因相對表達量。采用10 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。目的基因相對表達量以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法計算。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)用Excel 2007進行初步整理，并采用SPSS 17.0軟件進行t檢驗，所有測定結(jié)果以每個重復(fù)為統(tǒng)計單位，以“平均值±標準誤”表示，P<0.05時表示差異顯著，P<0.01時表示差異極顯著，0.05≤P<0.10時為有差異趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧添加功能性復(fù)合添加劑對生長豬生長性能的影響

由表3可知，與對照組相比，飼糧添加功能性復(fù)合添加劑顯著提高了生長豬的ADG(P<0.05)，有降低F/G的趨勢(P=0.09)。

表3 飼糧添加功能性復(fù)合添加劑對生長豬生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 飼糧添加功能性復(fù)合添加劑對生長豬血清UN含量的影響

由表4可知，與對照組相比，飼糧添加功能性復(fù)合添加劑顯著降低了生長豬血清UN含量(P<0.05)。

2.3 飼糧添加功能性復(fù)合添加劑對生長豬血清細胞因子含量的影響

由表5可知，與對照組相比，飼糧添加功能性復(fù)合添加劑極顯著降低了生長豬血清IL-1含量(P<0.01)，極顯著提高了血清IL-10含量(P<0.01)。

表4 飼糧添加功能性復(fù)合添加劑對生長豬血清UN含量的影響

表5 飼糧添加功能性復(fù)合添加劑對生長豬血清中細胞因子含量的影響

2.4 飼糧添加功能性復(fù)合添加劑對生長豬白細胞內(nèi)基因mRNA相對表達量的影響

由表6可知，與對照組相比，飼糧添加功能性復(fù)合添加劑顯著或極顯著降低了生長豬白細胞中NF-κB、TRAF6和IRAK1 mRNA的相對表達量(P<0.05或P<0.01)，有降低白細胞中IRAK4(P=0.08)和IKKα(P=0.05)mRNA相對表達量的趨勢。

表6 飼糧添加功能性復(fù)合添加劑對生長豬白細胞內(nèi)基因mRNA相對表達量的影響

3 討 論

3.1 飼糧添加功能性復(fù)合添加劑對生長豬生長性能和血清UN含量的影響

本試驗自主研制的功能性復(fù)合添加劑中維生素C、維生素E和黃芪多糖添加到飼糧中均具有提高仔豬生長性能及降低死亡率的作用[9-11]；本研究也發(fā)現(xiàn)，功能性復(fù)合添加劑添加到飼糧中可以顯著提高生長豬的ADG，并在一定程度上降低生長豬的F/G。血清UN含量可在一定程度上間接反映體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝與氨基酸之間的平衡狀況，當組織內(nèi)氨基酸沉積利用率增高時，血清UN含量降低[12-13]。Harvey等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加維生素E和維生素C可以顯著降低生長豬血清UN含量；彭宏剛等[15]報道，仔豬飼糧中添加黃芪多糖，可以顯著降低血清UN含量，改善仔豬氮平衡。這與前人對本研究中功能性復(fù)合添加劑組成成分的試驗結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加功能性復(fù)合添加劑可以顯著降低生長豬血清UN含量，表明該自主研發(fā)的功能性復(fù)合添加劑提高了生長豬對氨基酸的利用率，因此，我們可以推測功能性復(fù)合添加劑可以通過促進生長豬的蛋白質(zhì)沉積，從而提高生長豬的生長性能。

3.2 飼糧添加功能性復(fù)合添加劑對生長豬血清細胞因子含量和白細胞內(nèi)TLR信號通路相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響

血清中細胞因子是機體全身免疫反應(yīng)的指示器，表明機體的整個炎癥反應(yīng)[16]。IL-1主要由巨噬細胞產(chǎn)生，主要參與活化血管內(nèi)皮、組織損傷、發(fā)熱、淋巴細胞活化和誘導(dǎo)急性期蛋白質(zhì)合成等；IL-10是一種潛在的抗炎因子，具有促進前B細胞增殖，抑制T細胞激活和誘導(dǎo)T細胞的免疫耐受等免疫調(diào)節(jié)功能，通過抑制促炎細胞因子的合成發(fā)揮作用。Cantorna等[17]研究表明，維生素D可以調(diào)節(jié)人和老鼠的T細胞分化，從而調(diào)節(jié)IL-10的分泌，抑制機體的炎癥反應(yīng)，起到抗炎作用。維生素C可以降低促炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的含量，提高抗炎性細胞因子IL-10的含量來緩解氧化應(yīng)激對人體的炎性損傷[5]。廖波等[18]研究表明，飼糧中添加維生素D可以降低斷奶仔豬血清和腸內(nèi)容物的IL-2和IL-6含量。Fischer等[19]研究發(fā)現(xiàn)，維生素E和維生素C可以降低人血清中的IL-6含量。Zhao等[4]研究表明，黃芪多糖可以下調(diào)小鼠結(jié)腸炎組織中IL-1和IL-6含量。本研究使用功能性復(fù)合添加劑也得到和前人一致的結(jié)果，飼糧中添加功能性復(fù)合添加劑可以顯著降低生長豬血清中促炎性細胞因子IL-1含量，顯著提高血清中抗炎性細胞因子IL-10含量水平，表明功能性復(fù)合添加劑可以通過調(diào)節(jié)炎性細胞因子的分泌改善機體的免疫狀態(tài)。

TLR信號通路能啟動機體非特異性免疫應(yīng)答，并繼而激活特異性免疫反應(yīng)。TLR信號通路主要是MyD88依賴性，激活的TLR募集MyD88，然后召集IRAK4，使其與IRAK1結(jié)合，誘導(dǎo)IRAK1磷酸化，作用于TRAF6，進而激活MAPK和NF-κB[20]。而NF-κB是一個激活炎癥的經(jīng)典的信號通路，可以誘導(dǎo)機體炎性細胞因子的分泌[21]。前人對本研究中功能性復(fù)合添加劑中相關(guān)有效成分的研究表明，維生素D、維生素C和維生素E可有效調(diào)節(jié)不同組織和器官中TLR信號通路。維生素D可以通過調(diào)控TLR信號通路，影響炎性細胞因子的釋放[22-23]。在人白細胞中，維生素C可以通過調(diào)控MyD88信號通路來調(diào)節(jié)炎性細胞因子分泌來維持機體正常生理平衡[24]。維生素E在人的心臟中可以通過調(diào)節(jié)TLR信號通路調(diào)節(jié)NF-κB來改善心肌炎[25]。本研究檢測仔豬外周血白細胞TLR信號通路相關(guān)基因的表達，發(fā)現(xiàn)功能性復(fù)合添加劑的使用趨于降低白細胞MyD88 mRNA相對表達量，顯著或極顯著降低NF-κB、TRAF6和IRAK1 mRNA相對表達量，并有降低IRAK4和IKKαmRNA相對表達量的趨勢。由此可以推測，本研究中自主研制的功能性復(fù)合添加劑在飼糧中的添加調(diào)節(jié)機體免疫功能，可能是通過調(diào)控TLR信號通路完成的。

4 結(jié) 論

飼糧中添加功能性復(fù)合添加劑可以提高生長豬的生長性能，而這一作用可能與其可提高氨基酸利用率以及通過調(diào)節(jié)TLR信號通路來改善生長豬的免疫功能等有關(guān)。

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*Corresponding author, professor, E-mail: dwchen@sicau.edu.cn

(責任編輯 武海龍)

Effects of Dietary Functional Compound Additive Supplementation on Growth Performance and Immune Function of Growing Pigs

WU Lijuan MAO Xiangbing YU Bing HE Jun HUANG Zhiqing YU Jie ZHENG Ping LUO Junqiu CHEN Daiwen*
(InstituteofAnimalNutritionofSichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China)

The aim of this experiment was to study the effects of dietary functional compound additive supplementation on growth performance and immune function of growing pigs. Twenty Duroc×Landrace×Large (DLY) healthy pigs with an initial body weight of (21.06±1.98) kg were randomly divided into two groups with 10 replicates per group and 1 pig per replicate. Pigs were fed the basal diet (control group) or the diet added 0.1% functional compound additive (additive group) for 14 days. The results showed that compared with the control group, dietary functional compound additive supplementation significantly increased the average daily gain (ADG) of growing pigs (P<0.05), significantly increased the serum interleukin-10 (IL-10) content of growing pigs (P<0.01), significantly reduced the serum urea nitrogen (UN) and interleukin-1 (IL-1) contents (P<0.05 orP<0.01), and significantly decreased the mRNA relative expressions of nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB), tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6) and IL-1 receptor associated kinase 1 (IRAK1), which is the key genes of Toll-like receptor (TLR) pathway, in white blood cells of growing pigs (P<0.05 orP<0.01). Collectively, above results indicate that dietary functional compound additive supplementation can improve the growth performance via improving the utilization of protein and regulating the immune function of growing pigs.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(5)：1716-1722]

growing pigs; functional compound additive; growth performance; immune function

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.05.031

2016-11-04

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-36)；四川省科技支撐項目(2013NZ005)；四川省科技成果轉(zhuǎn)換項目(2014NC0018)

巫麗娟(1989—)，女，四川眉山人，碩士研究生，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)。E-mail： 646687600@qq.com

*通信作者:陳代文，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: dwchen@sicau.edu.cn

S828

A

1006-267X(2017)05-1716-07