彭騫騫 周 瑩 王雪敏 馮京海 甄 龍， 張少帥 常 玉 石玉祥 張敏紅*(.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京0093；.河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院，邯鄲0560)

不同相對(duì)濕度對(duì)間歇性26 ℃環(huán)境下肉雞盲腸菌群多樣性的影響

彭騫騫1,2周 瑩1*王雪敏2馮京海1甄 龍1，2張少帥1常 玉1石玉祥2張敏紅1**
(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院，邯鄲056021)

本試驗(yàn)旨在研究不同相對(duì)濕度(RH)對(duì)間歇性26 ℃環(huán)境下肉雞盲腸菌群多樣性的影響。選取29日齡愛(ài)拔益加(AA)肉雞180只轉(zhuǎn)入環(huán)境控制艙，隨機(jī)分成3個(gè)組(RH分別為30%、60%和85%)，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞(公母各5只)。從29日齡開(kāi)始，每天10：00—16：00(6 h)溫度維持26 ℃，RH分別為30%、60%和85%，剩余時(shí)間溫度為21 ℃，RH為60%。試驗(yàn)共14 d。采用16S rDNA的變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)，結(jié)合特異性和共性條帶割膠回收DNA進(jìn)行克隆和測(cè)序，分析RH在間歇性26 ℃偏熱處理第7天和第14天時(shí)對(duì)盲腸內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的影響。結(jié)果表明：1)試驗(yàn)第7天，30%RH組肉雞盲腸DGGE條帶數(shù)(菌群豐富程度)高于60%RH組，而85%RH組低于60%RH組；試驗(yàn)第14天，30%、85%RH組肉雞盲腸DGGE條帶數(shù)均高于60%RH組。2)聚類(lèi)分析顯示，試驗(yàn)第7天，85%RH對(duì)盲腸菌群影響明顯；試驗(yàn)第14天，30%RH對(duì)盲腸菌群影響明顯。但隨著處理時(shí)間推移，30%RH對(duì)肉雞盲腸菌群影響越大。3)間歇性26 ℃環(huán)境下不同RH組肉雞盲腸內(nèi)共性菌群是Faecalibacteriumprausnitzii；在試驗(yàn)第7天，30%、85%RH組肉雞盲腸中特異性菌群是Stomatobaculumlongum。結(jié)果提示：間歇性26 ℃環(huán)境下，低濕(30%RH)和高濕(85%RH)影響肉雞盲腸菌群的結(jié)構(gòu)和多樣性，且不同處理時(shí)間RH的影響不同。

相對(duì)濕度；間歇熱；肉雞；盲腸菌群；變形梯度凝膠電泳

家禽腸道菌群對(duì)宿主營(yíng)養(yǎng)吸收和腸道發(fā)育發(fā)揮著重要的作用，進(jìn)而影響家禽的生長(zhǎng)與健康[1]。環(huán)境因素、飼糧和日齡均可影響腸道菌群[2-5]。研究報(bào)道，熱應(yīng)激作用下，肉雞盲腸內(nèi)菌群數(shù)量變化明顯，乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量顯著降低，大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量顯著升高[6]，飼糧可顯著影響胃腸道菌群的組成和代謝活性[7]。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)家禽消化道菌群的研究，多利用傳統(tǒng)純培養(yǎng)法對(duì)菌群數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)[8]，但結(jié)果不夠準(zhǔn)確。原因是由于胃腸道菌群絕大多數(shù)是厭氧的，但當(dāng)下技術(shù)還不夠成熟，由此可見(jiàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)方法對(duì)腸道菌群的分析局限性很大。據(jù)報(bào)道，用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)，雞腸道內(nèi)50%以上的正常菌群不易被檢測(cè)[9]。隨著現(xiàn)代新型技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)為研究腸道菌群提供了科學(xué)方便的方法[10]。本實(shí)驗(yàn)室利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，26 ℃持續(xù)偏熱處理減少了肉雞盲腸菌群的多樣性[11]，而且發(fā)現(xiàn)間歇性偏熱環(huán)境(26和31 ℃)和相對(duì)濕度(RH)誘導(dǎo)的應(yīng)激顯著影響肉雞的生產(chǎn)性能、體溫和酸堿平衡[12]。目前為止，利用DGGE技術(shù)對(duì)肉雞腸道菌群影響因素的研究在飼糧成分[7,13]、日齡大小[14-17]、熱應(yīng)激[18-19]方面有所報(bào)道，但有關(guān)RH在間歇性26 ℃環(huán)境下對(duì)肉雞腸道菌群的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)肉雞盲腸菌群16S rDNA的DGGE圖譜進(jìn)行分析，研究間歇性26 ℃環(huán)境下不同RH對(duì)肉雞盲腸菌群多樣性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

選取180只29日齡健康愛(ài)拔益加(AA)肉雞，體重(1 210±13) g，隨機(jī)分成3個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞(公母各5只)。試驗(yàn)在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制艙內(nèi)進(jìn)行，溫度、RH自動(dòng)控制(精度分別為±1 ℃和±7%)，無(wú)風(fēng)，24 h光照。試驗(yàn)肉雞飼養(yǎng)在本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的單層平養(yǎng)籠具[20]上，自由采食與飲水。試驗(yàn)動(dòng)物所用飼糧與文獻(xiàn)[21-22]保持一致。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

22日齡肉雞在21 ℃、RH為60%的環(huán)境適應(yīng)1周。29日齡時(shí)，將肉雞分別轉(zhuǎn)入3個(gè)環(huán)境控制艙，RH分別為30%、60%和85%，溫度在10：00—16：00(6 h)維持在26 ℃，剩余時(shí)間溫度為21 ℃，RH為60%至試驗(yàn)結(jié)束，共14 d。

1.3 樣品的收集與處理

分別于試驗(yàn)第7天和第14天，每組隨機(jī)選取6只雞(公母各3只，每重復(fù)選1只)，禁食12 h后處死，用5%新潔爾滅浸泡3 min，全身消毒，打開(kāi)腹腔，結(jié)扎盲腸兩端，剪下后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)盲腸腸壁，將同一組的6個(gè)樣品迅速混合均勻，放入無(wú)菌的2 mL離心管中，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 盲腸樣品分析

1.4.1 細(xì)菌總DNA的提取

[23]，采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)手提法，提取樣品基因組總DNA(由北京億鳴復(fù)興生物科技有限公司完成)。提取的基因組總DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 基因組總DNA 16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增

根據(jù)參考文獻(xiàn)[24]設(shè)計(jì)出16S rDNA V3區(qū)引物(由北京億鳴復(fù)興生物科技有限公司合成)，見(jiàn)表1。

表1 引物序列

PCR擴(kuò)增體系(50 μL)為：10×PCR緩沖液5 μL；dNTP(2.5 mmol/μL)3.2 μL；TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.4 μL；GC357F(20 μmol/μL)1 μL；517R(20 μmol/μL)1 μL；模板DNA 50 ng；補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火0.5 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。PCR儀為Biometra公司生產(chǎn)的T-gradient。

1.4.3 基因組總DNA 16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增片段DGGE

取10 μL PCR的產(chǎn)物，采用Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行凝膠電泳分析。采用濃度為7%的聚丙烯酰胺凝膠、變性梯度為30%～60%、150 V、60 ℃下在1×TAE緩沖液中電泳5～8 h。DGGE完畢后，參考文獻(xiàn)[25]進(jìn)行硝酸銀染色。染色完畢后，采用Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

1.4.4 割膠回收差異條帶和共性條帶并克隆測(cè)序

用滅菌的手術(shù)刀切下條帶，目的條帶的回收采用OMEGA公司Poly-Gel DNA Extraction Kit。以回收產(chǎn)物為模板，按1.4.2方法再次擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)，把重新擴(kuò)增的DNA片段切膠回收、純化，將產(chǎn)物連接在Pmd18-T載體上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽(yáng)性克隆，北京億鳴復(fù)興生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果分析在GenBank的Blast中進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

DGGE圖譜采用Quantity One軟件對(duì)每個(gè)樣品的條帶數(shù)目進(jìn)行量化分析，用非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析。根據(jù)DGGE圖譜樣品條帶數(shù)及每個(gè)條帶灰度值，對(duì)各樣品中細(xì)菌多樣性指數(shù)進(jìn)行分析。樣品的多樣性用香農(nóng)-維納指數(shù)(H)、均勻度(E)和豐富度(S)表示。其算法如下：

式中：Pi為樣品中單一條帶的強(qiáng)度在該樣品所有條帶總強(qiáng)度中所占的比率；N為DGGE圖譜單一泳道上所有條帶的豐富度，Ni為第i條帶的豐富度；S是某樣品中所有條帶數(shù)目總和。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉雞盲腸菌群結(jié)構(gòu)分析

各部位樣品均是6只雞盲腸內(nèi)含物的混合物。持續(xù)偏熱處理影響肉雞盲腸菌群的PCR-DGGE圖譜(圖1)，相同時(shí)間、不同RH處理下的圖譜均有差異。采用Quantity One軟件將肉雞盲腸菌群16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE圖譜進(jìn)行數(shù)字化分析，結(jié)果顯示：試驗(yàn)第7天，30%RH組細(xì)菌條帶比60%RH組增加了2條，85%RH組細(xì)菌條帶比60%RH組減少了1條；試驗(yàn)第14天，30%、85%RH組細(xì)菌條帶比60%RH組分別增加了8和5條。結(jié)果表明：試驗(yàn)第7天，30%RH增加了肉雞盲腸菌群的多樣性，85%RH減少了肉雞盲腸菌群的多樣性；試驗(yàn)第14天，30%、85%RH均增加了肉雞盲腸菌群的多樣性。相同RH處理，不同時(shí)間對(duì)肉雞盲腸菌群的PCR-DGGE圖譜影響也有差異。30%、85%RH組條帶在試驗(yàn)第14天比第7天增加了5條，60%RH組則減少了1條，這說(shuō)明30%、85%RH組處理時(shí)間對(duì)肉雞盲腸菌群多樣性影響較大，而60%RH組則影響較小。

聚類(lèi)分析結(jié)果(圖2)顯示，試驗(yàn)第7天，30%、85%RH組和60%RH組的相似系數(shù)分別為71.2%、64.4%；試驗(yàn)第14天，30%、85%RH組和60%RH組的相似系數(shù)分別為52.9%、65.2%；試驗(yàn)第14天較第7天，30%RH組相似系數(shù)較85%RH組明顯下降。以上結(jié)果表明，試驗(yàn)第7天，85%RH對(duì)盲腸菌群影響明顯；試驗(yàn)第14天，30%RH對(duì)盲腸菌群影響明顯，且隨著處理時(shí)間推移，30%RH對(duì)肉雞盲腸菌群影響越大。

圖譜中數(shù)字為切膠編號(hào) The numbers in the profiles showed excised gel No.。

圖1 肉雞盲腸內(nèi)容物PCR-DGGE圖譜

Fig.1 PCR-DGGE profiles generated from cecum contents of broilers

2.2 肉雞盲腸菌群多樣性分析

根據(jù)PCR-DGGE圖譜中樣品條帶數(shù)目及每個(gè)條帶的強(qiáng)度，對(duì)各樣品中細(xì)菌多樣性指標(biāo)進(jìn)行分析。由表2可知，不同RH處理下肉雞盲腸菌群多樣性指標(biāo)存在差異。試驗(yàn)第7天，30%RH組盲腸菌群香農(nóng)-維納指數(shù)和豐富度是2.81和20，85%RH組為2.65和17；試驗(yàn)第14天，30%RH組盲腸菌群香農(nóng)-維納指數(shù)和豐富度是3.03和25，85%RH組為2.96和22；且在整個(gè)試驗(yàn)期間30%RH組香農(nóng)-維納指數(shù)和豐富度均高于60%、80%RH組。試驗(yàn)第7天，85%RH組香農(nóng)-維納指數(shù)和豐富度均低于60%RH組；試驗(yàn)第14天，30%、85%RH組香農(nóng)-維納指數(shù)和豐富度均高于60%RH組。在試驗(yàn)全期，各組的均勻度都在92%以上。結(jié)果表明，30%RH提高了肉雞盲腸菌群多樣性指數(shù)和豐富度；試驗(yàn)第7天，85%RH降低了肉雞盲腸菌群多樣性指數(shù)和豐富度；試驗(yàn)第14天，30%、85%RH提高了肉雞盲腸菌群多樣性指數(shù)和豐富度。

圖2 肉雞盲腸菌群PCR-DGGE聚類(lèi)分析

時(shí)間Time相對(duì)濕度RH/%香農(nóng)-維納指數(shù)Shannon?Wienerindex均勻度Evenness豐富度Richness第7天The7thday302．810．9420602．740．9518852．650．9317第14天The14thday303．030．9425602．620．9217852．960．9622

2.3 肉雞盲腸特異性菌群和共性菌群分析

從肉雞盲腸菌群16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE圖譜中分別割膠回收了2個(gè)共性條帶和4個(gè)特異性條帶(見(jiàn)圖1中箭頭所指)，PCR擴(kuò)增后克隆到Pmd18-T載體并測(cè)序，在 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表3，試驗(yàn)第7、14天時(shí)盲腸均檢測(cè)到2和6號(hào)條帶(Faecalibacteriumprausnitzii)；間歇性26 ℃環(huán)境下不同RH處理后，盲腸菌群也會(huì)出現(xiàn)明顯差異，在試驗(yàn)第7天，1號(hào)條帶(Stomatobaculumlongum)均出現(xiàn)在30%、85%RH組，而60%RH組未發(fā)現(xiàn)；在試驗(yàn)第14天，1和5號(hào)條帶(Stomatobaculumlongum和Faecalibacteriumprausnitzii)在30%RH處理下均不生長(zhǎng)，在60%、85%RH組均被測(cè)出，4號(hào)條帶(Clostridiumthermosuccinogenes)均出現(xiàn)在30%、60%RH組，而85%RH組未發(fā)現(xiàn)。以上結(jié)果說(shuō)明，在試驗(yàn)第7天，30%、85%RH促進(jìn)了Stomatobaculumlongum生長(zhǎng)；在試驗(yàn)第14天，30%RH抑制了Faecalibacteriumprausnitzii的定植，85%RH抑制了Clostridiumthermosuccinogenes的定植。

在6個(gè)測(cè)序結(jié)果中，條帶序列分布于厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中細(xì)菌的同源性絕大多數(shù)都大于95%，但條帶4數(shù)據(jù)庫(kù)中與之親緣關(guān)系最近的已鑒定的菌群的同源性僅為84%。因此這個(gè)序列所代表的菌群有可能為新的不可培養(yǎng)菌群。

表3 DGGE圖譜中條帶的基因片段序列比對(duì)

3 討 論

3.1 持續(xù)偏熱環(huán)境對(duì)肉雞盲腸菌群多樣性的影響

Zhou等[26]研究表明，PCR-DGGE圖譜分析家禽腸道菌群需具備合適的樣本量，大量試驗(yàn)結(jié)果表明最佳樣本量為5只雞。Gong等[27]采用同樣的分析技術(shù)研究肉雞嗉囊到盲腸黏膜細(xì)菌的組成，采用的樣本量為5只雞。彭騫騫等[11]在2015年應(yīng)用DGGE技術(shù)對(duì)持續(xù)偏熱環(huán)境對(duì)肉雞盲腸菌群多樣性的研究，所采用的樣本量為6只雞。因此，本試驗(yàn)采用6只肉雞盲腸內(nèi)容物混合樣品，應(yīng)用DGGE技術(shù)分析間歇性26 ℃環(huán)境下RH對(duì)肉雞盲腸菌群多樣性的影響。

研究顯示，盲腸對(duì)菌群多樣性影響很大[28]。盲腸菌群的多樣性以及1 g糞便含有1×1011CFU菌群使盲腸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[7]。許多研究報(bào)道，肉雞腸道中盲腸菌群較豐富[29]。李永洙[19]利用PCR-DGGE技術(shù)發(fā)現(xiàn)肉雞生長(zhǎng)期對(duì)盲腸菌群的影響最大。盲腸內(nèi)菌群最豐富，隨著日齡的增長(zhǎng)菌群種類(lèi)會(huì)增加，28日齡達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)[27]。本試驗(yàn)根據(jù)前人研究，選取盲腸對(duì)肉雞進(jìn)行腸道菌群多樣性的研究。

本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)第7天，85%RH降低了盲腸總菌數(shù)量，減少了肉雞盲腸菌群的多樣性；試驗(yàn)第14天，30%、85%RH增加了盲腸總菌數(shù)量，改變了肉雞盲腸菌群的多樣性。30%、85%RH組條帶在試驗(yàn)第14天比第7天增加5條，60%RH組則減少1條。這說(shuō)明在30%、85%RH組中，處理時(shí)間對(duì)肉雞盲腸菌群多樣性影響較大，60%RH組中則影響較小。前人研究表明，間歇性偏熱(26、31℃) 環(huán)境和RH誘導(dǎo)顯著影響肉雞的生長(zhǎng)性能、體溫和酸堿平衡；而且85%RH顯著降低肉雞的平均日采食量和平均日增重，但對(duì)料重比都沒(méi)有顯著影響，顯著升高肉雞的體溫，造成酸堿平衡紊亂[12]。Adams等[30]闡述，持續(xù)29 ℃時(shí)，高濕(80% vs. 40%)降低了4～8周齡肉雞的生長(zhǎng)率。本試驗(yàn)研究表明，85%RH先減少后增加肉雞盲腸菌群多樣性，可能由于85%RH改變了肉雞腸道酸堿平衡，導(dǎo)致使腸道菌群平衡遭到破壞，從而降低了機(jī)體應(yīng)對(duì)不良因素的能力。

3.2 持續(xù)偏熱環(huán)境對(duì)肉雞盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響

家禽腸道中的細(xì)菌主要是厚壁門(mén)菌[27]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，間歇性26 ℃環(huán)境下，30%RH減少了Faecalibacteriumprausnitzii、Stomatobaculumlongum的生長(zhǎng)，85%RH減少了Clostridiumthermosuccinogenes的定植。Faecalibacteriumprausnitzii能代謝腸道未吸收的糖類(lèi)產(chǎn)品產(chǎn)生大量丁酸，是腸道產(chǎn)生丁酸的主要細(xì)菌。它也可以分泌某種尚不明確的物質(zhì)與丁酸產(chǎn)生抗炎作用，并且可以糾正腸道菌群失調(diào)[31-32]。Stomatobaculumlongum在基礎(chǔ)厭氧培養(yǎng)基主要的終末代謝產(chǎn)物是丁酸、乳酸、異戊酸和乙酸[33]。Clostridiumthermosuccinogenes主要發(fā)酵各種碳水化合物，主要產(chǎn)物為琥珀酸、醋酸和甲酸[33]。這3種細(xì)菌都屬于不可培養(yǎng)的厚壁門(mén)細(xì)菌，厚壁門(mén)菌和擬桿門(mén)菌中的大部分菌可產(chǎn)生降解植物細(xì)胞壁的酶，參與植物細(xì)胞壁的降解，從而與腸道的消化功能有關(guān)。研究表明，丁酸對(duì)宿主的腸道健康起到重要作用[34-37]。試驗(yàn)第14天，30%、85%RH組條帶比試驗(yàn)第7天增加5條，而60%RH組僅減少1條，由此可見(jiàn)，30%、85%RH對(duì)肉雞盲腸菌群多樣性影響較大，60%RH則影響較小。高濕和低濕應(yīng)激導(dǎo)致的肉雞腸道菌群數(shù)量和種類(lèi)的改變，目前工作只是對(duì)部分條帶進(jìn)行分析，菌種對(duì)其消化吸收是正效應(yīng)亦或負(fù)效應(yīng)有待進(jìn)一步全面研究。

4 結(jié) 論

① 間歇性26 ℃環(huán)境下，30%、85%RH改變了肉雞盲腸菌群多樣性。

② 間歇性26 ℃環(huán)境下，30%RH處理下的特異性菌是Stomatobaculumlongum和Faecalibacteriumprausnitzii，85%RH抑制了Clostridiumthermosuccinogenes的定植。

參考文獻(xiàn)：

[1] MACKIE R,WHITE B,ISAACSON R E.Gastrointestinal microbiology:gastrointestinal microbes and host interactions[M].New York:Springer,1997.

[2] LUMPKINS B S,BATAL A B,LEE M D.Evaluation of the bacterial community and intestinal development of different genetic lines of chickens[J].Poultry Science,2010,89(8):1614-1621.

[3] NICHOLSON J K,HOLMES E,KINROSS J,et al.Host-gut microbiota metabolic interactions[J].Science,2012,336(6086):1262-1267.

[4] SJ?GREN Y M,TOMICIC S,LUNDBERG A,et al.Influence of early gut microbiota on the maturation of childhood mucosal and systemic immune responses[J].Clinical & Experimental Allergy,2009,39(12):1842-1851.

[5] SAMUEL B S,SHAITO A,MOTOIKE T,et al.Effects of the gut microbiota on host adiposity are modulated by the short-chain fatty-acid binding G protein-coupled receptor,Gpr41[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2008,105(43):16767-16772.

[6] 賀紹君,趙書(shū)景,李靜,等.甜菜堿對(duì)熱應(yīng)激肉雞生長(zhǎng)性能、十二指腸消化酶活性及盲腸微生物區(qū)系的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2014,26(12):3731-3739.

[7] 王麗鳳,張家超,馬晨,等.雞腸道微生物研究進(jìn)展[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2013,25(3):494-502.

[8] BARROW P A.Probiotics for chickens[M]//FULLER R.Probiotics:the scientific basis.Netherlands:Springer,1992:225-257.

[9] BARNES E M,MEAD G C,BARNUML D A,et al.The intestinal flora of the chicken in the period 2 to 6 weeks of age,with particular reference to the anaerobic bacteria[J].British Poultry Science,1972,13(3):311-326.

[10] HOOPER L V,WONG M H,THELIN A,et al.Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine[J].Science,2001,291(5505):881-884.

[11] 彭騫騫,王雪敏,張敏紅,等.持續(xù)偏熱環(huán)境對(duì)肉雞盲腸菌群多樣性的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,49(1):186-194.

[12] 周瑩,彭騫騫,張敏紅,等.相對(duì)濕度對(duì)間歇性偏熱環(huán)境下肉雞體溫、酸堿平衡及生產(chǎn)性能的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2015,27(12):3726-3735.

[13] TOROK V A,OPHEL-KELLER K,LOO M,et al.Application of methods for identifying broiler chicken gut bacterial species linked with increased energy metabolism[J].Applied and Environmental Microbiology,2008,74(3):783-791.

[14] GONG J,YU H,LIU T,et al.Effects of zinc bacitracin,bird age and access to range on bacterial microbiota in the ileum and caeca of broiler chickens[J].Journal of Applied Microbiology,2008,104(5):1372-1382.

[15] FONSECA B B,BELETTI M E,SILVA M S D,et al.Microbiota of the cecum,ileum morphometry,pH of the crop and performance of broiler chickens supplemented with probiotics[J].Revista Brasileira De Zootecnia,2010,39(8):1756-1760.

[16] LU J,IDRIS U,HARMON B,et al.Diversity and succession of the intestinal bacterial community of the maturing broiler chicken[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69(11):6816-6824.

[17] AMIT-ROMACH E,SKLAN D,UNI Z.Microflora ecology of the chicken intestine using 16S ribosomal DNA primers[J].Poultry Science,2004,83(7):1093-1098.

[18] 李永洙,李進(jìn),張寧波,等.熱應(yīng)激環(huán)境下蛋雞腸道微生物菌群多樣性[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(5):1601-1609.

[19] 李永洙.利用PCR-DGGE方法分析不同雞群的盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)變化[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2011,31(21):6513-6521.

[20] 張敏紅,蘇紅光,馮京海,等.采集用于建立肉雞生活環(huán)境舒適性評(píng)價(jià)模型數(shù)據(jù)的方法和專用裝置:中國(guó),CN103404447A[P].2013-11-27.

[21] 胡春紅,張敏紅,馮京海,等.偏熱刺激對(duì)肉雞休息行為、生理及生產(chǎn)性能的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2015,27(7):2070-2076.

[22] 甄龍,石玉祥,張敏紅,等.持續(xù)偏熱環(huán)境對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、糖脂代謝及解偶聯(lián)蛋白mRNA表達(dá)的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2015,27(7):2060-2069.

[23] SHEN W H.Plant molecular biology,a laboratory manual:edited by M.S. Clark,Springer Verlag,Berlin,1997,DM 120.00[J].Plant Science,1997,124(2):223.

[24] MUYZER G,DE WAAL E C,UITTERLINDEN A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J].Applied and Environmental Microbiology,1993,59(3):695-700.

[25] VAN ORSOUW N J,LI D,VIJG J.Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) increases resolution and informativity of Alu-directed inter-repeat PCR[J].Molecular and Cellular Probes,1997,11(2):95-101.

[26] ZHOU H,GONG J,BRISBIN J T,et al.Appropriate chicken sample size for identifying the composition of broiler intestinal microbiota affected by dietary antibiotics,using the polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis technique[J].Poultry Science,2007,86(12):2541-2549.

[27] GONG J H,SI W D,FORSTER R J,et al.16S rRNA gene-based analysis of mucosa-associated bacterial community and phylogeny in the chicken gastrointestinal tracts:from crops to ceca[J].FEMS Microbiology Ecology,2007,59(1):147-157.

[28] 倪學(xué)勤,GONG J,YU H,等.采用PCR-DGGE技術(shù)分析蛋雞腸道細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)及多樣性[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,39(7):955-961.

[29] 姚琨,張日俊.肉仔雞后腸道菌群多樣性及其演替規(guī)律的研究[C]//中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)分會(huì)第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.杭州:中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì),2008:1.

[30] ADAMS R L,ROGLER J C.The effects of dietary aspirin and humidity on the performance of light and heavy breed chicks[J].Poultry Science,1968,47(4):1344-1348.

[31] SIZOVA M V,MULLER P,PANIKOV N,et al.Stomatobaculumlongumgen. nov.,sp. nov.,an obligately anaerobic bacterium from the human oral cavity[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2013,63(4):1450-1456.

[32] SOKOL H,PIGNEUR B,WATTERLOT L,et al.Faecalibacteriumprausnitziiis an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2008,105(43):16731-16736.

[33] LOUIS P,FLINT H J.Diversity,metabolism and microbial ecology of butyrate-producing bacteria from the human large intestine[J].FEMS Microbiology Letters,2009,294(1):1-8.

[34] SRIDHAR J,EITEMAN M A.Metabolic flux analysis ofClostridiumthermosuccinogenes[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2001,94(1):51-69.

[35] DUNCAN S H,HOLD G L,HARMSEN H J M,et al.Growth requirements and fermentation products ofFusobacteriumprausnitzii,and a proposal to reclassify it asFaecalibacteriumprausnitziigen. nov.,comb. nov[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2002,52(6):2141-2146.

[36] BEN-AMOR K,HEILIG H,SMIDT H,et al.Genetic diversity of viable,injured,and dead fecal bacteria assessed by fluorescence-activated cell sorting and 16S rRNA gene analysis[J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(8):4679-4689.

[37] PRYDE S E,DUNCAN S H,HOLD G L,et al.The microbiology of butyrate formation in the human colon[J].FEMS Microbiology Letters,2002,217(2):133-139.

*Contributed equally

**Corresponding author, professor, E-mail: zmh66@126.com

(責(zé)任編輯 田艷明)

Effects of Different Relative Humidity on Cecal Microflora Diversity of Broilers under Intermittent 26 ℃ Environment

PENG Qianqian1,2ZHOU Ying1*WANG Xuemin2FENG Jinghai1ZHEN Long1,2ZHANG Shaoshuai1CHANG Yu1SHI Yuxiang2ZHANG Minhong1**
(1.StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition,InstituteofAnimalSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China; 2.CollegeofAgriculture,HebeiUniversityof
Engineering,Handan056021,China)

This study was carried out to investigate the effects of different relative humidity (RH) on cecal microflora diversity of broilers under intermittent 26 ℃ environment. One hundred and eighty 29-day-old Arbor Acres (AA) broilers were assigned to three environment chambers (RH were 30%, 60% and 85%, respectively), each chamber contained six cages with ten birds per cage (five males and five females), and each cage as a replicate. When broilers were 29 days of age, the temperature of groups was at 26 ℃, regulating the RH to 30%, 60% and 85%, and the temperature and RH of groups were kept six hours each day at 10:00 to 16:00, and broilers were kept at 21 ℃ and 60% RH in the other time. The trial period lasted for 14 days. The effects of RH on bacterial community and diversity in the cecal digesta of broilers at the 7thand 14thday under intermittent 26 ℃ environment were analyzed by using 16S rDNA-based denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), combined with the cloning and sequencing of DNA recycled by specificity and generality stripe tapping. The results showed as follows: 1) on the 7thday, cecum DGGE bands number (flora abundance) of broilers in 30% RH group was higher than that in 60% RH group, while in 85% RH group was lower than that in 60% RH group; on the 14thday, cecum DGGE bands number of broilers in 30% and 85% RH groups was higher than that in 60% RH group. 2) Cluster analysis showed that on the 7thday, 85% RH affected the cecal microflora obviously, but on the 14thday, 30% RH did. And as treatment time processing, 30% RH made a greater effect on cecal microflora. 3) The common cecal microbiota of different RH groups under intermittent 26 ℃ environment wasFaecalibacteriumprausnitzii, and on the 7thday, the specific cecal microbiota in 30% and 85% RH groups wasStomatobaculumlongum. In conclusion, at the intermittent 26 ℃ environment, 30% and 85% RH can change the structure and diversity of cecal microflora of broilers, and the effects of RH at different processing time are different.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(5)：1527-1534]

relative humidity; intermittent partial heat environment; broilers; cecal microbiota; denaturing gradient gel electrophoresis

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.05.010

2016-11-04

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題“畜禽健康養(yǎng)殖環(huán)境控制關(guān)鍵技術(shù)研究與集成”(2012BAD39B02)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(ASTIP-IAS07)

彭騫騫(1989—)，女，河北邯鄲人，碩士研究生，畜牧學(xué)專業(yè)。E-mail: 18230221210@163.com

S831.4

A

1006-267X(2017)05-1527-08

*同等貢獻(xiàn)作者

**通信作者：張敏紅，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail: zmh66@126.com