趙 媛 曹澤星

酶催化過程的全程模擬

趙 媛1曹澤星2,*

(1河南大學(xué)天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南開封475004；
2廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建省理論與計(jì)算化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361005)

酶催化包括底物到活性區(qū)的輸運(yùn)、選擇催化化學(xué)反應(yīng)及產(chǎn)物釋放等復(fù)雜過程，由于復(fù)雜的蛋白質(zhì)環(huán)境效應(yīng)，任一化學(xué)和非化學(xué)過程都有可能是決定酶活性的關(guān)鍵步驟。為了全面認(rèn)識酶催化活性，我們對幾類酶催化過程進(jìn)行了廣泛的組合量子/分子力學(xué)(QM/MM)和經(jīng)典分子力學(xué)(MM)動(dòng)力學(xué)模擬(MD)研究，詳細(xì)地討論了整個(gè)酶催化過程的分子機(jī)制、關(guān)鍵殘基的作用和蛋白質(zhì)環(huán)境效應(yīng)，豐富了對酶催化活性的認(rèn)識。隨著多尺度模型和計(jì)算模擬方法的進(jìn)一步完善與發(fā)展，有望實(shí)現(xiàn)超大復(fù)雜生物酶催化過程的全程模擬研究，為酶工程領(lǐng)域的相關(guān)研究提供支持。

酶催化；底物輸運(yùn)；自由能計(jì)算；QM/MM MD模擬；隨機(jī)加速動(dòng)力學(xué)模擬

1 引言

1.1 酶催化特點(diǎn)及其調(diào)控因素

酶是一種具有生物催化功能的復(fù)雜高分子體系，是生物體中不可缺少的催化劑。如果酶缺失或酶活性降低，生命活動(dòng)將發(fā)生紊亂，甚至無法維持1－9。通常酶催化具有很高的活性，其催化過程具有高度的專一性，即一種酶僅催化一種或一類底物參與的生物化學(xué)過程，并生成特定的產(chǎn)物。酶催化可以在溫和的條件下進(jìn)行，其活性與環(huán)境溫度和pH值密切相關(guān)，溫度和pH偏高或者偏低，都會(huì)顯著影響酶的催化活性。如果遇到過酸、過堿或溫度升高，酶的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，就會(huì)導(dǎo)致酶變性失活。此外，催化活性還會(huì)受到多種其它因素調(diào)控，如抑制劑和激活劑調(diào)節(jié)、反饋抑制調(diào)節(jié)、變構(gòu)調(diào)節(jié)和共價(jià)修飾調(diào)節(jié)等，有些酶的催化活性還與輔酶因子有關(guān)10。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，保守殘基對底物結(jié)合和催化活性調(diào)控的作用機(jī)制、蛋白質(zhì)構(gòu)象的pH依賴性、底物和殘基質(zhì)子化狀態(tài)等對酶催化效率的影響也是不可忽視的11－18。如6-磷酸葡糖胺脫氨酶(glucosamine 6-phosphate deaminase，NagB)中的催化三聯(lián)體(catalytic triad)Asn128-His130-Glu135以及羥氰裂解酶(hydroxynitrile lyase，HNL)中的三聯(lián)體Ser80-His235-Asp207，在催化過程中起著十分重要的作用，其酶催化最初的質(zhì)子轉(zhuǎn)移就是由這些保守殘基的協(xié)同作用引發(fā)的16－18。HbHNL酶中的Thr11、Ile12、Ser80、Cys81、Leu157、His235和Lys236等殘基通過與底物相互作用，將其限域在酶催化活性位點(diǎn)16；HbHNL和MeHNL酶中的殘基Trp128在反應(yīng)物進(jìn)入活性位點(diǎn)及產(chǎn)物釋放中，起到門控“開-關(guān)”的作用16,17；活性區(qū)賴氨酸質(zhì)子化狀態(tài)可以改變整個(gè)酶催化反應(yīng)機(jī)制16,17；NagB中底物氨基的質(zhì)子化狀態(tài)將顯著影響其催化N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)開環(huán)的機(jī)理，且反應(yīng)活性口袋側(cè)鏈殘基His145的質(zhì)子化狀態(tài)會(huì)影響其lid motif區(qū)的“開-關(guān)”動(dòng)力學(xué)行為，進(jìn)而控制底物的結(jié)合，改變酶的活性18。

1.2 底物/產(chǎn)物輸運(yùn)與酶催化

在蛋白質(zhì)環(huán)境中，酶催化全過程通常由一系列的化學(xué)步和非化學(xué)步組成，其中非化學(xué)步主要包括底物結(jié)合到活性位點(diǎn)的輸運(yùn)和產(chǎn)物從反應(yīng)區(qū)域的釋放(見圖1)1－7,9,19。由于復(fù)雜的蛋白質(zhì)環(huán)境效應(yīng)，其中任何一個(gè)步驟都可能對酶催化效率產(chǎn)生重要影響。理論上，通過對酶催化過程的全程模擬，可以構(gòu)造酶催化過程相對自由能變化的全景圖，準(zhǔn)確預(yù)測催化過程的決速步驟，深入了解酶催化微觀機(jī)理，全面認(rèn)識蛋白質(zhì)環(huán)境中酶催化特性，進(jìn)而有針對性地調(diào)控酶催化劑的活性。這將有利于仿酶催化體系的設(shè)計(jì)和相關(guān)的應(yīng)用研究，在酶工程領(lǐng)域的研究中具有重要意義。

底物到活性區(qū)域的輸運(yùn)是酶催化過程的第一步，對酶催化過程有著不可忽視的影響，甚至有可能成為整個(gè)酶催化效率的決定性因素，近年來備受關(guān)注16,17,20－28。實(shí)驗(yàn)上主要通過晶體結(jié)構(gòu)和殘基突變分析等方法，推測可能的輸運(yùn)通道及關(guān)鍵殘基，并結(jié)合瞬態(tài)動(dòng)力學(xué)等方法預(yù)測底物傳遞的kcat值。比如在羥氰裂解酶(HNL)的研究中，實(shí)驗(yàn)研究組就通過晶體結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測了可能的底物傳遞通道，并通過將通道關(guān)鍵殘基突變的方法，對其進(jìn)一步驗(yàn)證29,30；在胞嘧啶脫氨酶的研究中，Yao等28通過瞬態(tài)動(dòng)力學(xué)研究，推測產(chǎn)物釋放可能是酶催化過程的決速步驟。然而，盡管如此，在實(shí)驗(yàn)上仍然很難獲取底物或產(chǎn)物進(jìn)出酶活性位點(diǎn)時(shí)的結(jié)構(gòu)和酶構(gòu)象的變化信息。理論上，隨著分子動(dòng)力學(xué)理論方法的發(fā)展，不但可以找到最為可能的反應(yīng)通道，而且可以獲取底物傳遞過程中的熱動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、關(guān)鍵殘基和蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，為實(shí)驗(yàn)研究提供理論支持20－27。最近，我們通過隨機(jī)加速分子動(dòng)力學(xué)(random acceleration molecular dynamics，RAMD)和傳統(tǒng)分子動(dòng)力學(xué)(classical molecular dynamics，MD)模擬，獲得了HNLs酶催化過程中底物/產(chǎn)物輸運(yùn)的可能通道及傳遞過程中蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化等信息16,17。

趙媛，1987年生。2015年于廈門大學(xué)獲取理學(xué)博士學(xué)位，現(xiàn)為河南大學(xué)天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室講師?，F(xiàn)主要從事生物體系多尺度計(jì)算模擬及計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)相關(guān)領(lǐng)域的研究。

曹澤星，1962年生?，F(xiàn)為廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師。研究興趣包括：激發(fā)態(tài)與光化學(xué)、無機(jī)與金屬有機(jī)化學(xué)反應(yīng)機(jī)理、復(fù)雜體系與酶催化過程的多尺度模擬、低維納米材料的計(jì)算設(shè)計(jì)與模擬。

圖1 酶催化過程(底物結(jié)合、化學(xué)反應(yīng)、產(chǎn)物釋放)Fig.1 Enzymatic process(substrate binding,chemical reaction,and product release)

酶催化反應(yīng)機(jī)理是實(shí)驗(yàn)和理論都非常關(guān)注的焦點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)上，主要采用X射線晶體衍射和核磁共振等實(shí)驗(yàn)手段，獲取生物酶體系的結(jié)構(gòu)，并通過同位素示蹤、殘基突變、酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定等方法表征酶催化反應(yīng)機(jī)理。但是，由于很難捕捉催化過程中的過渡態(tài)和瞬時(shí)中間體的結(jié)構(gòu)信息，加之酶靜態(tài)晶體結(jié)構(gòu)和活性態(tài)的結(jié)構(gòu)差異，導(dǎo)致催化機(jī)制推測上的多樣性及不準(zhǔn)確性。隨著理論與計(jì)算化學(xué)的發(fā)展，尤其是量子-經(jīng)典力學(xué)組合方法(combined quantum mechanics/molecular mechanics，QM/MM)的不斷完善，使得從原子和電子水平上解釋酶催化反應(yīng)機(jī)理成為可能，彌補(bǔ)了實(shí)驗(yàn)方法的局限性31,32。比如來自橡樹和木薯的羥氰裂解酶(HbHNL&MeHNL)在碳碳鍵生物逆合成方面具有重要作用，二者高度同源，但是實(shí)驗(yàn)基于獲取的原生態(tài)和突變體的晶體結(jié)構(gòu)，推測兩個(gè)酶具有不同的催化機(jī)制，且活性位點(diǎn)賴氨酸質(zhì)子化對它們的調(diào)控作用也不一致33。而在理論上，基于酶相關(guān)的晶體結(jié)構(gòu)，采用MM MD和QM/MM MD方法，建立了這兩類酶活性態(tài)的初始結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)地研究了賴氨酸質(zhì)子化狀態(tài)對兩類酶催化活性的影響，對實(shí)驗(yàn)推測的酶催化機(jī)理進(jìn)行了一定修正，使之更能合理地解釋有關(guān)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象16,17。

2 計(jì)算方法

2.1 MM MD與RAMD方法

分子動(dòng)力學(xué)(molecular mechanics molecular dynamics，MM MD)方法主要基于牛頓經(jīng)典力學(xué)建立多粒子系統(tǒng)的運(yùn)動(dòng)方程組，通過數(shù)值求解，模擬系統(tǒng)隨時(shí)間推進(jìn)的微觀過程，獲得系統(tǒng)粒子相軌跡，進(jìn)而研究該系統(tǒng)的平衡熱力學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)等。在MM MD模擬中，首先要搭建初始模型，并對其進(jìn)行優(yōu)化，消除初始模型中的不合理構(gòu)象；然后對模型進(jìn)行長時(shí)間分子動(dòng)力學(xué)模擬，使系統(tǒng)達(dá)到平衡，并收集平衡后的數(shù)據(jù)，通過統(tǒng)計(jì)方法對系統(tǒng)的熱力學(xué)性質(zhì)等進(jìn)行分析。其中，合理選取系統(tǒng)邊界和粒子間作用勢能模型、設(shè)定粒子初態(tài)、建立模擬算法計(jì)算粒子間作用力和各粒子的速度和位置等都有助于改進(jìn)分子動(dòng)力學(xué)模擬。常用的分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件有Amber34、Namd35、Gromacs36－39、Charmm40、Tinker41和Lammps42等。

隨機(jī)加速分子動(dòng)力學(xué)方法核心在于對體系中處于活性位點(diǎn)的底物或產(chǎn)物分子質(zhì)心或某個(gè)自定義原子上額外施加一個(gè)隨機(jī)方向的力，推動(dòng)其移動(dòng)，直至離開整個(gè)酶體系，使其暴露于外部溶劑中，以此尋找底物或產(chǎn)物傳遞通道。在RAMD模擬中，給定初始的加速度及距離閾值，在一段時(shí)間內(nèi)，當(dāng)?shù)孜锘虍a(chǎn)物達(dá)到或超過設(shè)定閾值，方向繼續(xù)保持；否則，將施加另一個(gè)隨機(jī)方向的力，以此來獲取底物或產(chǎn)物分子傳遞的可能通道。但是，當(dāng)隨機(jī)作用力大于蛋白質(zhì)系統(tǒng)對底物或產(chǎn)物約束力時(shí)，就有可能推動(dòng)其朝向錯(cuò)誤的方向，此時(shí)，就需要RAMD結(jié)合MD的方法來解決這個(gè)問題。當(dāng)?shù)孜锘虍a(chǎn)物受力逃離初始位置，經(jīng)典MD模擬就會(huì)開啟平衡整個(gè)體系，在一定程度上糾正過強(qiáng)的隨機(jī)作用力，使底物朝正確方向移動(dòng)。在RAMD模擬中，加速度和閾值的設(shè)定非常重要，為了獲得合理可行的模擬結(jié)果，通常需要設(shè)置多個(gè)加速度、多個(gè)閾值，根據(jù)軌跡統(tǒng)計(jì)，來獲取通道情況。目前可用Amber34、Namd35、Gromacs36－39和Charmm40來實(shí)現(xiàn)RAMD的計(jì)算。

目前，將MM MD和RAMD相結(jié)合是研究底物輸運(yùn)可能通道及其相應(yīng)熱動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的重要方法之一，在酶催化過程的全程模擬研究中具有重要意義15－17。

2.2 QM/MM與QM/MM MD方法

近年來，量子-經(jīng)典力學(xué)(quantum mechanics/ molecular mechanics，QM/MM)方法已經(jīng)成為研究酶催化過程中化學(xué)反應(yīng)步的強(qiáng)大工具43－60。其中，QM方法用來描述關(guān)鍵區(qū)域(quantum mechanics subsystem，QS)，如化學(xué)反應(yīng)活性區(qū)域，MM方法用來描述活性區(qū)域環(huán)境(molecular mechanics subsystem，MS)，如周圍蛋白質(zhì)環(huán)境及溶劑。QM/ MM方法可以在考慮蛋白質(zhì)和介質(zhì)環(huán)境的前提下，從原子及電子水平上合理描述酶催化體系的結(jié)構(gòu)、反應(yīng)機(jī)理及其能量學(xué)性質(zhì)(圖2)。而QM/MM MD則是在QM/MM的水平上進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，并結(jié)合傘形采樣(umbrella sampling，US)等技術(shù)，可以獲得蛋白質(zhì)和介質(zhì)環(huán)境動(dòng)力學(xué)對催化反應(yīng)過程的影響及其反應(yīng)過程的自由能性質(zhì)，相對于QM/MM計(jì)算獲得的靜態(tài)結(jié)構(gòu)和能量信息而言，自由能變化可以更加合理地描述酶催化反應(yīng)的特征。值得注意的是，當(dāng)體系劃分為QS區(qū)和MS區(qū)之后，二者之間會(huì)形成邊界，如何描述兩個(gè)區(qū)域間的邊界相互作用也是QM/MM方法一直關(guān)注的問題。

QM/MM方法計(jì)算體系的能量時(shí)，通常采用減法方案和加法方案。減法方案的能量表達(dá)式為：

EQM/MM=EMM(MS+QS)+EQM(QS)－EMM(QS)其中，EMM(MS+QS)為MM水平下獲得的MS和QS區(qū)域的總能量，EQM(QS)為QM水平下QS區(qū)域的能量，EMM(QS)為MM水平下QS區(qū)域的能量。它的優(yōu)點(diǎn)是在QS區(qū)和MS區(qū)之間沒有耦合項(xiàng)，處理較為簡單直接。缺點(diǎn)是在QS區(qū)也采用力場來處理，在一些情況中不可行。而且當(dāng)有化學(xué)反應(yīng)發(fā)生時(shí)，QS區(qū)電荷分布會(huì)發(fā)生變化，在處理靜電相互作用中，用固定原子點(diǎn)電荷描述是不準(zhǔn)確的。此外，無法考慮MS區(qū)對QS區(qū)電子密度的極化。Morokuma等61,62提出的ONIOM方法運(yùn)用此種方案。加法方案的能量表達(dá)式為：

圖2 QM/MM系統(tǒng)Fig.2 General QM/MM system

EQM/MM=EQM(QS)+EMM(MS)+EQM/MM(QS/MS)其中，EQM(QS)和EMM(MS)為QS區(qū)域和MS區(qū)域能量項(xiàng)，EQM/MM(QS/MS)為QS和MS區(qū)域相互作用能，一般包括成鍵相互作用項(xiàng)和非鍵相互作用項(xiàng)，而非鍵相互作用項(xiàng)又包括靜電相互作用和范德華相互作用。靜電相互作用是處理耦合的關(guān)鍵，通常采用機(jī)械嵌入(mechanical embedding)、靜電嵌入(electrostatic embedding)和極化嵌入(polarized embedding)來處理。在大多數(shù)機(jī)械嵌入中，QS區(qū)域是孤立的，其電子密度不會(huì)受到MS區(qū)域的影響，且處理QS及MS之間相互作用是在MM水平下進(jìn)行的。其優(yōu)勢是減小了計(jì)算量，但較為粗糙。ONIOM(MO:MM)方法61,62則通過這種嵌入方案來處理QS和MS區(qū)域間的靜電耦合。靜電嵌入方案則是機(jī)械嵌入方案的改進(jìn)，在此方案中，將QS與MS之間靜電相互作用當(dāng)做單電子算符考慮到QM哈密頓算符中。此時(shí)，QS區(qū)電子結(jié)構(gòu)會(huì)被MS區(qū)的電荷分布所極化，提高了計(jì)算精度。在極化嵌入方案中，兩個(gè)區(qū)域可以相互極化，即MS區(qū)也會(huì)被QS區(qū)域所極化。常用的模型有charge-on-aspring model63，induced dipole model64和fluctuating charge model65。在這種方案下，要獲取總能量，在QM波函數(shù)每一步自洽場迭代都需要進(jìn)行一次MM極化計(jì)算。這種處理非常耗時(shí)，也會(huì)帶來收斂問題。因此，此方案往往適用于MS區(qū)域較小的體系66。

針對邊界處理，目前較為流行的處理方法有：連接原子法(link-atom scheme)67-72，邊界原子法(boundary-atom scheme)60,73-78和定域軌道法(localizedorbital scheme)43,46,53,79-84(圖3)。連接原子法是處理QM與MM邊界問題最直接的方法。它在QM與MM切斷處Q1―M1引入一個(gè)額外的原子中心或一個(gè)懸空的鍵B來滿足Q1的自由價(jià)態(tài)。通常采用氫原子，但也可以是任何單價(jià)原子或基團(tuán)。其中，電子飽和部分包括B和Q，采用QM處理；Q1―M1鍵用MM描述。邊界原子法是利用一個(gè)特殊的類似“兩面神”的邊界原子Cps來代替M1原子，既作為正常的MM原子參與MM計(jì)算，又用來飽和Q1的自由價(jià)態(tài)，出現(xiàn)在QM計(jì)算中。它可以避免連接原子法中引入額外原子的問題，還能夠模仿邊界上MM基團(tuán)的電子特征。大多數(shù)邊界原子法的提出都基于單價(jià)贗勢(或有效勢)，贗勢局域在M1原子的位置，可利用參數(shù)化來重現(xiàn)特定期望的性質(zhì)，如利用C―C單鍵的截?cái)鄟砟７录谆?。目前，這類方法也有許多發(fā)展，如調(diào)節(jié)原子(adjusted connection atom)75、贗鍵(pseudobond)60,73,74,85、有效團(tuán)勢(effective group potentials)76,86－88、量子覆蓋勢(quantum capping potentials)78,89、極小原理有效哈密頓(effective hamiltontians from a minimum principle)77、多中心價(jià)電子有效勢(multicentred valence-electron effective potentials)90等。定域軌道法是采用一個(gè)凍結(jié)的雜化軌道來飽和QM-MM邊界的懸空鍵。其共同點(diǎn)是在一個(gè)前線原子上設(shè)置一組合適的定域軌道，并保持這些軌道凍結(jié)，不參與SCF迭代。這類方法主要有局域自洽場(local self-consistent field)80－82,84,91、凍結(jié)軌道(frozen orbitals)53,54,92、廣義雜化軌道(generalized hybrid orbitals)46,83,93－95和有效碎片勢(ffective fragment potentials)79,96－98等。

圖3 (a)連接原子法；(b)邊界原子法；(c)定域軌道法Fig.3 (a)Link-atom scheme;(b)boundary-atom scheme; (c)localized-orbital scheme

2.3 自由能計(jì)算方法

自由能與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有直接可比性，是構(gòu)造酶催化過程全景圖不可缺少的數(shù)據(jù)之一，通?？煞譃楹ツ坊羝澴杂赡?A)或吉布斯自由能(G)。亥姆霍茲自由能適合正則系綜(canonical ensemble，即NVT系綜)，吉布斯自由能適合NPT系綜，其中，ΔG=ΔA+ΔPV。生物大分子是一個(gè)凝聚相體系，因此，可將ΔPV近似為0，那么ΔG≈ΔA。對于蛋白質(zhì)環(huán)境中的化學(xué)反應(yīng)，自由能不能只基于靜態(tài)電子結(jié)構(gòu)計(jì)算獲取相對能量值，而需考慮到體系的漲落，合理描述反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過程。

目前，自由能計(jì)算方法種類較多，如傘形采樣99－102、自由能微擾103－105、熱力學(xué)積分(thermodynamic integration，TDI)106、metadynamics107－109和Jarzynski equality110－113等。US主要通過施加偏勢來改變勢函數(shù)，使得體系能夠在高能區(qū)采樣，而后根據(jù)概率密度求解自由能數(shù)據(jù)，較多應(yīng)用于對新提出的自由能計(jì)算方法準(zhǔn)確性檢驗(yàn)111,112,114－116；FEP基本思想是在初末態(tài)間插入若干中間態(tài)，通過獲取各態(tài)間自由能變化，來獲取初末態(tài)自由能變化，這種方法原理嚴(yán)格，不需要規(guī)定反應(yīng)路徑，對于小分子來說較為精確117－119；TDI與FEP類似，只是對兩個(gè)狀態(tài)間自由能差的定義不同，利用各態(tài)能量系綜平均值獲得自由能，近年來，自適應(yīng)偏置力(adaptive biasing force，ABF)方法120－122就是在TDI的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它引入了偏置力概念，提高采樣效率，且采樣均勻；metadynamics方法主要通過對體系低自由能區(qū)不斷施加額外的高斯型排斥勢能函數(shù)，使其到達(dá)高自由能區(qū)域，進(jìn)而通過施加的勢能函數(shù)來對自由能進(jìn)行計(jì)算，此方法不需要事先對反應(yīng)路徑有預(yù)先判斷，因此，在尋找最優(yōu)反應(yīng)路徑方面有較大優(yōu)勢123；Jarzynski equality方法是需要施加額外的恒速運(yùn)動(dòng)諧振勢使得體系到達(dá)高自由能區(qū)進(jìn)行采樣，由大量的不可逆功的系統(tǒng)平均來求解反應(yīng)過程的自由能，在操作便捷及計(jì)算效率上有較大優(yōu)勢111。上述幾種方法在自由能勢能面構(gòu)造中，均得到了廣泛應(yīng)用111,112,114－124。

2.4 關(guān)鍵殘基作用分析方法

關(guān)鍵殘基在底物/產(chǎn)物輸運(yùn)及酶催化化學(xué)反應(yīng)過程中起著十分重要的作用，通常采用殘基突變方法，討論保守殘基在酶催化過程中所扮演的角色。例如，將重要?dú)埢蛔優(yōu)楸彼?，通過QM/ MM計(jì)算或MM MD模擬，以及和原生酶體系結(jié)果的比較，可以探明關(guān)鍵殘基在酶催化過程中不同階段所起的結(jié)構(gòu)或功能作用。

理論上，評估關(guān)鍵殘基在底物結(jié)合中的作用，常采用molecular mechanics generalized born surface/ poisson-boltzmann surface area(MM-GB/PBSA)方法。該方法是基于分子力學(xué)與連續(xù)介質(zhì)模型的一種結(jié)合自由能計(jì)算方法，已成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)－配體125－130，蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)131－133，蛋白質(zhì)－肽相互作用134－136的研究中。配體(L)和受體(R)形成復(fù)合物RL的結(jié)合自由能(ΔGbind)的計(jì)算如下：

ΔGbind=ΔH－TΔS≈ΔEMM+ΔGsol－TΔS

其中，ΔEMM、ΔGsol和－TΔS分別代表氣相MM能量變化、溶劑自由能變化和結(jié)合熵變。ΔEMM包括鍵長、鍵角和二面角能量、靜電相互作用能和范德華相互作用能。ΔGsol是溶劑化能總和，包括采用GB和PB模型計(jì)算得到的極化溶劑化能(極化部分)和采用溶劑可及表面積(solvent accessible surface area，SASA)得到的非靜電溶劑化能(非極化部分)。

3 計(jì)算研究進(jìn)展

3.1 羥氰裂解酶催化過程中自由能變化全景圖的構(gòu)造

羥氰裂解酶(hydroxynitrile lyases，HNLs)能夠催化氰醇生成相應(yīng)醛(酮)及氫氰酸(HCN)，HCN的釋放不僅可以幫助植物抵御食草動(dòng)物及微生物的侵害137，而且能夠?yàn)樘於彼岬纳锖铣商峁┑?38。此外，其逆反應(yīng)可以用來合成手性化合物，并具有較高選擇性139－142。近幾年，HNLs已經(jīng)成功應(yīng)用于藥物的生物逆催化合成143－149。因此，對HNLs催化過程的深入研究將有助于工業(yè)產(chǎn)物優(yōu)化及生物催化設(shè)計(jì)。最近，我們采用MM和QM/ MM MD的方法，結(jié)合傘形采樣技術(shù)，對來自木薯的羥氰裂解酶(hydroxynitrile lyases from Manihot esculent，MeHNL)催化過程進(jìn)行了全程模擬，獲得的自由能變化全景圖見圖4(a)17。整個(gè)酶催化過程包括底物氰醇到酶活性位點(diǎn)的輸運(yùn)、羥氰裂解成丙酮和氫氰酸和產(chǎn)物釋放三個(gè)步驟。

對于底物/產(chǎn)物的輸運(yùn)等非化學(xué)步，通過RAMD MD模擬，探明了反應(yīng)物進(jìn)入活性位點(diǎn)和產(chǎn)物釋放的可能通道及其重要性17。計(jì)算模擬中，定義中心碳原子為丙酮氰醇、丙酮和HCN的近似質(zhì)心，采用 20.9、18.8、16.7、14.65、12.56、10.47和8.37 kJ·nm－1·g－1的加速度和0.0005 nm的閾值來驅(qū)動(dòng)底物/產(chǎn)物的傳遞和可能通道確定。對于底物輸運(yùn)和產(chǎn)物釋放，分別獲得28條軌跡，并發(fā)現(xiàn)三條可能通道(分別定義為通道A、B、C)。通道A位于殘基180－190和Trp128之間，通道B位于殘基115－130和Trp128之間，通道C位于殘基115－130和210－225之間，三個(gè)通道距離蛋白質(zhì)邊緣的距離分別為1.2、1.2和1.5 nm。而且，通道A的口袋比B和C寬，由此推測通道A是最具有優(yōu)勢的傳遞通道(見圖4(b))。通過對底物的通過幾率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，進(jìn)一步驗(yàn)證了通道A具有絕對的優(yōu)勢。在底物和產(chǎn)物的輸運(yùn)過程中，通道A的貢獻(xiàn)在百分之八十以上，而落到通道B和通道C的軌跡非常少。在此基礎(chǔ)上，通過MM MD方法結(jié)合傘形采樣技術(shù)，對底物/產(chǎn)物通過主要通道輸運(yùn)的能量性質(zhì)進(jìn)行了計(jì)算分析，分別獲得了一維和二維相對自由能圖(見圖4(c))及其詳細(xì)的輸運(yùn)機(jī)制。

計(jì)算模擬揭示，反應(yīng)物結(jié)合至活性位點(diǎn)依據(jù)Trp128的翻轉(zhuǎn)可分為四步(見圖4(b))。首先，反應(yīng)物逐漸靠近蛋白質(zhì)，并與Gln181和Trp128分別形成氫鍵和非鍵相互作用，推動(dòng)底物進(jìn)入蛋白質(zhì)通道，此時(shí)，Trp128和Met147處于關(guān)閉的狀態(tài)；然后，Trp128逐漸翻轉(zhuǎn)，通道打開，底物和Trp128的共軛環(huán)形成lone pair…π和π…π相互作用，并與Met147形成靜電相互作用；接下來，底物的―CH3基團(tuán)和Trp128形成―CH3…π相互作用，Trp128逐漸關(guān)閉；最后，底物結(jié)合至活性位點(diǎn)，與Thr11、Ser80和 Lys237形成氫鍵相互作用，Ile12、Leu149、Leu158和Ile120形成疏水口袋來容納反應(yīng)物的―CH3基團(tuán)，此時(shí)，Trp128完全關(guān)閉。

HCN和丙酮的釋放可分為六個(gè)階段。第一階段，HCN離開活性位點(diǎn)，朝著通道開關(guān)移動(dòng)，Trp128在“開-關(guān)”態(tài)之間轉(zhuǎn)換；第二階段，HCN穿過通道開關(guān)區(qū)域，Trp128逐漸關(guān)閉；第三階段，HCN完全釋放，體系能量到達(dá)局域最小值點(diǎn)；第四階段，丙酮試圖離開活性位點(diǎn)，并與Trp128形成―CH3…π、lone pair…π和π…π相互作用，驅(qū)使Trp128由閉態(tài)轉(zhuǎn)換為開態(tài)；第五階段，丙酮沿通道離出，Trp128逐漸恢復(fù)關(guān)閉狀態(tài)；最后，丙酮完全釋放，暴露于水環(huán)境中，通道完全關(guān)閉。

酶催化化學(xué)反應(yīng)過程可分為三步(見圖4(d))，首先是雙質(zhì)子轉(zhuǎn)移，即質(zhì)子由底物傳遞給Ser80，Ser80又將自身的質(zhì)子傳遞給His236，形成兩性離子中間體組態(tài)IM1，經(jīng)過采樣統(tǒng)計(jì)，明確了雙質(zhì)子轉(zhuǎn)移是同時(shí)發(fā)生的；其次是C―CN鍵斷裂，形成中間體IM2，此時(shí)，氰根陰離子(CN－)形成，并被Lys237的―NH3+基團(tuán)穩(wěn)定，形成強(qiáng)靜電相互作用；最后是HCN的生成，即Pc態(tài)，也經(jīng)歷了雙質(zhì)子轉(zhuǎn)移，即質(zhì)子由His236傳遞至Ser80，隨后Ser80將自身質(zhì)子傳遞給CN－。

從構(gòu)造的自由能變化全景圖來看，反應(yīng)物從酶外部進(jìn)入活性位點(diǎn)，形成底物結(jié)合的B態(tài)，釋放51.9 kJ·mol－1能量，是整個(gè)酶催化過程的驅(qū)動(dòng)力之一；催化化學(xué)反應(yīng)步的能壘主要來自于C―C鍵的斷裂和HCN的生成，自由能跨度約為71.6 kJ· mol－1，決定了整個(gè)酶催化的進(jìn)程；產(chǎn)物釋放二維自由能圖(見圖4(c))揭示，HCN的釋放先于丙酮，HCN釋放能壘約為8.4 kJ·mol－1，且放熱19.7 kJ· mol－1；丙酮釋放能壘約為41.9 kJ·mol－1，在一定程度上影響了酶催化效率，當(dāng)釋放的產(chǎn)物分子進(jìn)入到水介質(zhì)環(huán)境，強(qiáng)的溶劑化作用將釋放出顯著的能量，有助于酶催化過程的進(jìn)行。

3.2 核苷水解酶催化過程自由能變化全景圖的構(gòu)造

圖4 (a)催化過程自由能變化全景圖17；(b)底物輸運(yùn)過程中具有代表性態(tài)的關(guān)鍵殘基及構(gòu)象變化17；(c)產(chǎn)物釋放自由能變化圖17；(d)酶催化中的化學(xué)反應(yīng)過程17Fig.4 (a)Free energy profile of the whole enzymatic catalysis17;(b)key residues and their conformational changes at the representative states in the main channel17;(c)free energy profile of product release17; (d)chemical reaction steps involved in enzymatic process17

核苷水解酶(nucleoside hydrolases，NHs)是一類含金屬離子Ca2+的金屬酶，在病原生物體嘌呤補(bǔ)救中扮演重要角色150,151，可以有效催化核糖核苷N-糖苷鍵水解生成核糖和堿基，因此，成為非常具有吸引力的抗寄生蟲靶標(biāo)152,153，其水解反應(yīng)過渡態(tài)類似物常用來設(shè)計(jì)NHs抑制劑。肌苷-腺苷-鳥苷-核苷水解酶(IAG-NH)是NHs中的一類，傾向于催化肌苷(inosine)、腺苷(adenosine)和鳥苷(guanosine)的水解154。實(shí)驗(yàn)預(yù)測IAG-NH的催化過程可分為四個(gè)步驟，分別為底物結(jié)合至酶活性位點(diǎn)、化學(xué)反應(yīng)、堿基釋放和核糖釋放155－157，其中核糖釋放可能是整個(gè)過程的決速步驟155,158。近期，Wu等11,15,159對IAGNH的催化過程進(jìn)行了詳細(xì)研究，構(gòu)造了其自由能全景圖(見圖5(a))。

QM/MM計(jì)算模擬表明11，肌苷在IAG-NH的催化作用下水解生成糖環(huán)和堿基，其中，糖環(huán)和堿基之間C―N鍵的斷裂以及糖環(huán)和水分子之間的C―O鍵生成是同時(shí)發(fā)生的(見圖5b)，底物N7位的質(zhì)子化可以顯著地降低化學(xué)步的能壘，預(yù)測的自由能能壘約為29.3 kJ·mol－1；隨后，堿基釋放所需的能量約為23.4 kJ·mol－1，顯然這些過程對整個(gè)酶催化過程影響不大159。最后，核糖的釋放包括核糖脫離Ca2+的配位形成自由態(tài)、周邊水分子替代核糖參與Ca2+配位和核糖穿過酶通道完全釋放三個(gè)步驟15。其中，自由態(tài)核糖通過通道完全釋放能壘約為54.4 kJ·mol－1，與估算的實(shí)驗(yàn)值15569.9 kJ·mol－1較為吻合，是整個(gè)催化過程的決速步驟。

圖5 (a)催化過程自由能變化全景圖11,15,159；(b)IAG-NH催化肌苷水解機(jī)制11；(c)產(chǎn)物傳遞過程具有代表性態(tài)的關(guān)鍵殘基及構(gòu)象變化15Fig.5 (a)Free energy profile of the whole enzymatic catalysis11,15,159;(b)hydrolytic mechanism of inosine catalyzed by IAG-NH11;(c)key residues and their conformational changes at the representative states for the product release15

為了深入了解糖基釋放決速步驟的相關(guān)信息，應(yīng)用RAMD MD方法對核糖釋放通道進(jìn)行了詳細(xì)研究15，動(dòng)力學(xué)模擬采用了20.9、12.6和8.4 kJ·nm－1·g－1的加速度及0.0002和0.0004 nm的閾值，獲得18條軌跡。計(jì)算發(fā)現(xiàn)兩條通道(見圖5b)，主要通道在loop 1和loop 2之間，有13條軌跡落在其中，比例為72%；次要通道在loop 2和殘基17－184之間，軌跡比例為28%。值得注意的是酶活性位點(diǎn)距離主要通道和次要通道的距離分別為1.1和0.6 nm，為了探索距離長的反倒成為主要通道的原因，分別對它們進(jìn)行了詳細(xì)研究，發(fā)現(xiàn)主要通道以極性殘基為主，如Asn12、Asp14、Glu82、His246和Arg252等，而次要通道則以非極性殘基為主，如 Trp185、Trp260、Phe79和Phe175，后者位阻較大，而且從通道寬度而言，主要通道優(yōu)于次要通道。此外，研究通過MM MD方法和傘形采樣技術(shù)獲得了糖環(huán)釋放過程主要通道的熱動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，結(jié)果顯示，隨著Trp83的“開-關(guān)”振動(dòng)，一些水分子逐漸進(jìn)入通道，造成糖環(huán)與通道殘基形成直接或間接的氫鍵相互作用，尤其是與Arg252之間的氫鍵相互作用導(dǎo)致其駐留時(shí)間增長；而且，通道主要?dú)埢鶄?cè)鏈芳環(huán)較大，有較強(qiáng)的位阻效應(yīng)。因此，二者共同阻礙了糖環(huán)的釋放，是核糖釋放能壘的主要來源。

3.3 底物及殘基質(zhì)子化對催化的影響

圖6 SmuNagB催化GlcN6P開環(huán)自由能曲線Fig.6 Relative free energy profiles of the ring-opening reaction along the reaction coordinate for SmuNagB color online

6-磷酸葡糖胺脫氨酶(NagB)屬于醛酮異構(gòu)酶，能夠催化6-磷酸葡糖胺(GlcN6P)轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖(F6P)和氨分子，決定了N-乙酰胺葡萄糖(GlcNAc)的代謝方向160。實(shí)驗(yàn)上對其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、lid區(qū)柔韌度、變構(gòu)調(diào)節(jié)、基因重組、功能分析和催化機(jī)理進(jìn)行了廣泛研究161－167，并發(fā)現(xiàn)其催化活性與pH值密切相關(guān)，在pH=7.5－9.5時(shí)，酶的催化速率達(dá)到最大(kcat＞30 s－1)，當(dāng)pH〈6時(shí)，完全失去酶活性162。根據(jù)質(zhì)子化葡糖胺的pKa值168，GlcN6P的氨基存在兩種質(zhì)子化態(tài)，分別為―NH2和―NH3+。因此，理論上，針對這兩個(gè)態(tài)，分別建立去質(zhì)子化態(tài)模型和質(zhì)子化態(tài)模型，并采用QM/MM MD方法結(jié)合傘形采樣技術(shù)對兩個(gè)模型的GlcN6P的催化開環(huán)機(jī)理進(jìn)行研究，獲得了二者參與開環(huán)過程的自由能圖(見圖6)。QM/MM MD結(jié)果顯示，對于去質(zhì)子化態(tài)模型而言，GlcN6P將質(zhì)子傳遞給His130與環(huán)C1―O5鍵斷裂是同時(shí)發(fā)生的，能壘約為87.9 kJ·mol－1。對于質(zhì)子化態(tài)的底物模型，開環(huán)為分步過程。首先，質(zhì)子從底物的O1轉(zhuǎn)移至His130的Nε，產(chǎn)生兩性離子中間體(IM1)，能壘為8.8 kJ·mol－1，此時(shí)，底物―NH3+能夠穩(wěn)定O1－。隨后，六元環(huán)C1―O5鍵斷裂，形成開環(huán)中間體IM2，能壘為75.4 kJ·mol－1，為開環(huán)反應(yīng)的決速步驟。因此，質(zhì)子化的底物GlcN6P比去質(zhì)子化態(tài)的形式更易發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，且形成的中間體更穩(wěn)定。開環(huán)產(chǎn)物分解釋放氨并與介質(zhì)水強(qiáng)的溶劑化作用，將顯著地穩(wěn)定產(chǎn)物態(tài)，促進(jìn)酶催化開環(huán)過程。

對于來自橡樹(HbHNL)和木薯(MeHNL)的羥氰裂解酶(hydroxynitrile lyases，HNLs)，兩類酶具有很高的同源性(77%sequence identity)33，然而，基于酶與復(fù)合物突變體系的晶體結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)上建議兩類酶催化具有不同的反應(yīng)機(jī)制。在HbHNL催化過程中，活性區(qū)域賴氨酸的質(zhì)子化態(tài)被認(rèn)為具有十分重要的作用，然而對于MeHNL催化，實(shí)驗(yàn)基于Ser80Ala突變體與氰醇復(fù)合物的晶體構(gòu)型(PDB ID:1E8D)，認(rèn)為活性位點(diǎn)賴氨酸對催化并無作用33。為了探明兩類酶催化機(jī)制的差異，基于MM MD模擬獲取的wild type酶與底物復(fù)合物的穩(wěn)定構(gòu)象，采用QM/MM MD方法，并結(jié)合傘形采樣技術(shù)，我們對HbHNL和MeHNL的催化反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)研究16,17。計(jì)算模擬中，通過指定活性位點(diǎn)關(guān)鍵殘基賴氨酸不同的質(zhì)子化狀態(tài)，構(gòu)建兩類酶的質(zhì)子化和去質(zhì)子化計(jì)算模型，以調(diào)查賴氨酸在催化過程中扮演的角色。我們的研究表明，對兩類酶催化過程，賴氨酸的質(zhì)子化狀態(tài)顯著地影響酶催化微觀機(jī)制。當(dāng)酶活性區(qū)的賴氨酸處于質(zhì)子化狀態(tài)時(shí)，其化學(xué)步包含雙質(zhì)子傳遞(底物→Ser80→His236)、C―C鍵斷裂和HCN形成三個(gè)步驟，其中，一個(gè)顯著特點(diǎn)是在C―C斷裂之后，氰根陰離子(CN－)生成，并與活性位點(diǎn)賴氨酸的形成強(qiáng)靜電相互作用；對于去質(zhì)子化態(tài)模型而言，首先經(jīng)歷了雙質(zhì)子傳遞，隨后，C―C鍵斷裂和HCN生成是同時(shí)發(fā)生的，并且由于賴氨酸的―NH2基團(tuán)為中性，無法穩(wěn)定CN－，因此，催化反應(yīng)中并無CN－

生成。從反應(yīng)能壘上看，HbHNL和MeHNL的質(zhì)子化態(tài)模型的總能壘分別為75.4和71.2 kJ·mol－1，而去質(zhì)子化態(tài)模型分別為92.1和129.8 kJ·mol－1。由此可見，活性位點(diǎn)賴氨酸的質(zhì)子化態(tài)在兩類酶催化反應(yīng)中都具有重要作用。

上述實(shí)例討論了底物或殘基質(zhì)子化狀態(tài)的改變對酶催化過程的影響，很明顯，關(guān)鍵基團(tuán)質(zhì)子化形式的改變，不但影響了整個(gè)酶催化效率，甚至完全改變了催化反應(yīng)機(jī)制，這種現(xiàn)象是酶催化蛋白質(zhì)環(huán)境效應(yīng)之一，也可能出現(xiàn)在其他的酶催化體系中。

3.4 殘基質(zhì)子化態(tài)對酶關(guān)鍵區(qū)域構(gòu)象動(dòng)態(tài)行為的影響

近幾年，來自大腸桿菌(Escherichia coli)和人類(Homo sapiens)的NagB六聚體及來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和變形鏈球菌(Streptococcus mutants)的NagB單體的晶體結(jié)構(gòu)被相繼確定，但在現(xiàn)有的晶體中，僅有一個(gè)為酶-底物復(fù)合物的形式(PDB ID:2RI1)162(來 自 Streptococcus mutants，SmuNagB)，它是在酸性溶液中獲得的。晶體結(jié)構(gòu)揭示，在活性區(qū)域結(jié)合口袋開口邊緣處存在一個(gè)靈活易變的lid motif，可以導(dǎo)致結(jié)合口袋處于“開態(tài)(open state)”或穩(wěn)定的“閉態(tài)(close state)”161,169。一旦活性口袋處在閉態(tài)，底物和產(chǎn)物無法進(jìn)出酶催化活性區(qū)域。實(shí)驗(yàn)上，SmuNagB酶催化D-葡糖胺-6-磷酸(GLcN6P)脫氨的活性與pH值密切相關(guān)，最高活性出現(xiàn)在pH=8.0－8.5的區(qū)間。為了理解lid motif調(diào)控活性口袋開關(guān)態(tài)的微觀機(jī)制及酶催化活性與pH值關(guān)系的本質(zhì)，我們對這類酶催化進(jìn)行了廣泛的計(jì)算模擬研究。

基于SmuNgaB酶的apo態(tài)及SmuNagB-GlcN6P酶-底物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:2RI0，2RI1)162，建立了兩類計(jì)算模型18，分別代表酶的自由態(tài)和復(fù)合態(tài)，酸性條件下模型為Model A和Model B，堿性條件下的模型為Model C和Model D。為了減少計(jì)算量，僅考慮其中一條鏈。模擬研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體系平衡之后，底物進(jìn)入酶的活性位點(diǎn)(Model B)，lid motif處于結(jié)合口袋上方，形成close態(tài)；然而在其他三個(gè)模型中，活性區(qū)域口袋均為open態(tài)。殘基結(jié)構(gòu)漲落(RMSF)分析顯示，對于Model B，lid motif(由殘基152－168組成)的柔韌度非常小，而Model C和D柔韌度相似。進(jìn)一步，活性區(qū)域結(jié)合口袋體積估算結(jié)果顯示，在酸溶液中，當(dāng)?shù)孜锝Y(jié)合至活性位點(diǎn)時(shí)，lid motif經(jīng)歷了從open到close的動(dòng)態(tài)變化(圖7)。但是，Liu研究組162獲得的酶-底物復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中的lid motif構(gòu)型與apo態(tài)近似。通過比較MD模擬中不同階段的構(gòu)象變化及RMSF值，我們發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，隨著模擬的進(jìn)行，lid motif逐漸靠近底物存在的結(jié)合口袋，逐漸導(dǎo)致close態(tài)的形成，其柔韌度也逐漸降低，與EcoNagB及BsuNagB類似，都在底物結(jié)合時(shí)經(jīng)歷了類似的構(gòu)象變化。和酸性溶液中不同的是，在堿性條件下，酶結(jié)合底物后，lid motif仍遠(yuǎn)離活性通道，結(jié)合口袋處于open態(tài)。

圖7 酸性(a)和堿性(b)溶液中，SmuNagB的apo態(tài)(藍(lán))和復(fù)合態(tài)(紅)的疊合圖、口袋表面圖和對應(yīng)的RMSF值18Fig.7 Overlap for the apo state(blue)and the enzyme-substrate complex(red)in acidic(a)and basic solutions(b)along with RMSF values of the backbone and surface of the active site pocket18RMSF:root mean square fluctuation.color online

為了進(jìn)一步理解lid motif動(dòng)態(tài)行為的pH依賴性，理論上對活性口袋和lid motif之間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。如圖8所示，在酸性溶液中，對復(fù)合態(tài)而言，Asn157和底物之間通過水分子形成了氫鍵網(wǎng)絡(luò)，使lid motif向活性位點(diǎn)靠近。而且Thr150&Glu135，Asn134&Hip145形成氫鍵的概率分別為32%和99.7%。在采樣過程中，四個(gè)殘基對lid motif的關(guān)閉起到誘導(dǎo)作用。但在apo態(tài)中，并未見此現(xiàn)象，lid motif始終停留在open態(tài)。因此，酸性溶液中，lid motif的構(gòu)象變化來源于底物的結(jié)合。在堿性溶液中，無論酶的復(fù)合態(tài)還是apo態(tài)，lid motif總是停留在open態(tài)。而lid motif和活性位點(diǎn)之間的區(qū)域并無氫鍵網(wǎng)絡(luò)使lid區(qū)關(guān)閉，預(yù)測堿性和酸性溶液中的行為有所不同，可能在一定程度上受到了His145質(zhì)子化狀態(tài)的影響。His145雙質(zhì)子化使lid motif區(qū)與活性位點(diǎn)附近殘基形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致酸性溶液中的close狀態(tài)。但是，在堿性溶液中，氫鍵相互作用消失，lid motif區(qū)為open態(tài)。因此，從理論上可以推測出lid motif在酸堿條件下的不同動(dòng)力學(xué)行為主要來源于His145的質(zhì)子化態(tài)及其導(dǎo)致活性位點(diǎn)氫鍵網(wǎng)絡(luò)的重排。

3.5 關(guān)鍵殘基在酶催化過程中的調(diào)控作用

圖8 Model B(a)，ModelA(b)和Model D(c)的活性位點(diǎn)及l(fā)id motif區(qū)氫鍵網(wǎng)絡(luò)詳情18Fig.8 Hydrogen bond networks around the active site and the lid region of Model B(a),ModelA(b),and Model D(c)18

實(shí)驗(yàn)研究表明，催化三聯(lián)體(Asn128-His130-Glu135)，在NagB酶催化GlcN6P的開環(huán)反應(yīng)中扮演了重要角色，其中，His130是中性的，它在開環(huán)過程中，誘發(fā)質(zhì)子轉(zhuǎn)移，且Asn128及Glu135單突變均能完全改變酶反應(yīng)活性162。為了合理評估Asn128及Glu135在催化反應(yīng)中的作用，理論上分別對Asn128Ala和Glu135Ala的單突變及雙突變體系進(jìn)行了QM(B3LYP)/MM計(jì)算18。

對于雙突變體而言，去質(zhì)子化態(tài)雙突變體系能壘比原生物酶體系高42.7 kJ·mol－1，質(zhì)子化態(tài)雙突變體系質(zhì)子傳遞及C5―O1鍵斷裂比原生物酶體系高18.0和167.1 kJ·mol－1。酶活性消失主要來自于突變造成的活性位點(diǎn)氫鍵及極化相互作用的改變。對質(zhì)子化態(tài)模型而言，Asn128和Glu135突變將明顯降低酶活性，這與實(shí)驗(yàn)觀測一致，同時(shí)也意味著質(zhì)子化態(tài)模型在催化過程中比重較大。在單突變體中，對去質(zhì)子化模型而言，Asn128Ala突變體的能壘比原生體系高40.0 kJ·mol－1，而Glu135Ala突變體則與原生體系較為接近；對質(zhì)子化模型而言，Asn128Ala和Glu135Ala單突變體系質(zhì)子轉(zhuǎn)移的能壘相對原生物酶體系分別增加25.5和12.6 kJ·mol－1，C5―O1鍵斷裂的能壘則分別增加210.2和193.8 kJ·mol－1。兩個(gè)結(jié)果都顯示Asn128在催化過程中比Glu135起到更重要的作用。此外，電荷分析證明Glu135Ala突變體較Asn128Ala而言，更能加強(qiáng)C1―O5鍵的極化作用，在一定程度上解釋了Glu135Ala單突變體鍵斷裂能壘與Asn128Ala相比較低的現(xiàn)象。

對于HbHNL酶催化，實(shí)驗(yàn)上推測，如果將Trp128突變?yōu)锳la，將有利于更大的芳香氰醇進(jìn)入活性位點(diǎn)170,171。理論上，通過MM MD模擬并結(jié)合傘形采樣技術(shù)，也證實(shí)Trp128在底物輸運(yùn)中起到開-關(guān)的作用16。為了進(jìn)一步探索Trp 128在底物結(jié)合及產(chǎn)物釋放中的功能及其對酶催化效率的影響，預(yù)測了Trp128Ala突變體系中底物輸運(yùn)的自由能圖，發(fā)現(xiàn)底物釋放需要跨過33.5 kJ·mol－1的能壘，僅是原生酶體系(～67.0 kJ·mol－1)的一半。很明顯，雖然其他疏水殘基氫鍵網(wǎng)絡(luò)在一定程度上影響了底物傳遞，但Trp128的吲哚環(huán)帶來的位阻效應(yīng)及其翻轉(zhuǎn)仍是能壘的主要來源。

除此之外，關(guān)鍵殘基在底物結(jié)合中同樣起著十分重要的作用。例如，在HbHNL酶催化的反應(yīng)機(jī)理研究中，Gruber等33指出，Lys236、Ser80和Thr11與底物存在強(qiáng)的氫鍵及靜電相互作用，在底物結(jié)合中起著重要作用。為了進(jìn)一步了解每個(gè)殘基的影響，我們對K236A、S80A、T11A突變體系和原生HbHNL體系的底物結(jié)合自由能進(jìn)行了估算與分析16。計(jì)算結(jié)果表明，范德華、靜電相互作用和非極性溶劑效應(yīng)為底物結(jié)合提供了主要驅(qū)動(dòng)力；而極性溶劑化能和熵效應(yīng)則起了負(fù)作用。強(qiáng)靜電相互作用抵消了極性溶劑化能的作用，對C―CN鍵的活化及斷裂而言非常重要。和原生HbHNL體系相比，K236A，S80A和T11A突變體系的結(jié)合自由能分別減小了12.4、19.8和5.1 kJ·mol－1，這可能主要來自于靜電相互作用。此外，從per-residue模式對各個(gè)殘基進(jìn)行了自由能能量分解來看，位于活性位點(diǎn)的Ile12、Cys81、Leu157和His235對底物結(jié)合有顯著作用，其中，范德華及非極化溶劑能為主要貢獻(xiàn)。

4 結(jié)論與展望

本文簡要總結(jié)了我們近年關(guān)于幾類酶催化過程全程模擬研究的進(jìn)展。通過構(gòu)建合理的MM和QM/MM多尺度模型，基于經(jīng)典和量子-經(jīng)典動(dòng)力學(xué)模擬，實(shí)現(xiàn)了對整個(gè)酶催化過程微觀機(jī)理的理論描述。模擬研究不僅可以預(yù)測酶催化化學(xué)反應(yīng)過程的機(jī)理，而且能夠獲得底物輸運(yùn)與產(chǎn)物釋放過程的分子機(jī)制及其能量學(xué)性質(zhì)，探明蛋白質(zhì)構(gòu)象變化和關(guān)鍵殘基對酶催化的影響，為酶活性的調(diào)控、酶抑制劑的合理設(shè)計(jì)、仿酶催化新體系的發(fā)展等酶工程領(lǐng)域的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

基于全程模擬，可以獲得底物輸運(yùn)通道的完整圖像和關(guān)鍵殘基的作用機(jī)制，有助于對酶和底物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行針對性的改造，加強(qiáng)或減弱底物與通道側(cè)鏈殘基間的相互作用，實(shí)現(xiàn)底物選擇性的傳遞。對生物逆合成有機(jī)分子而言，在關(guān)鍵殘基的驅(qū)使下，使得具有不同官能團(tuán)的有機(jī)分子進(jìn)入酶活性位點(diǎn)，可以在一定程度上豐富分子合成的種類。在藥物分子設(shè)計(jì)中，可以根據(jù)獲得的殘基和底物作用模式，設(shè)計(jì)具有特定官能團(tuán)的藥物分子，延長藥物-靶標(biāo)作用時(shí)間，藥物-靶標(biāo)作用時(shí)間的調(diào)控在藥物結(jié)合動(dòng)力學(xué)中具有重要意義，這也是實(shí)驗(yàn)研究較為關(guān)心的問題之一172。此外，基于對酶催化化學(xué)反應(yīng)步模擬獲得的過渡態(tài)電子結(jié)構(gòu)及其與周圍氨基酸殘基結(jié)合模式等信息，可以設(shè)計(jì)一個(gè)過渡態(tài)類似物，使其與酶緊密結(jié)合，而設(shè)計(jì)出的分子極有可能成為該酶的抑制劑，這也是基于機(jī)制或結(jié)構(gòu)的現(xiàn)代計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法之一173－175。近期，Zhou等176通過QM/MM MD模擬，探明了HDAC酶催化反應(yīng)的微觀機(jī)理，并發(fā)展了一種基于反應(yīng)機(jī)理設(shè)計(jì)抑制劑的策略，設(shè)計(jì)出HDAC2選擇性抑制劑β-羥甲基查爾酮，而且，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其結(jié)合能力較強(qiáng)，是HDAC1的20倍。

量子-經(jīng)典力學(xué)(QM/MM)組合方法是目前研究酶催化反應(yīng)最為流行的方法之一，但隨著QM區(qū)域的增大，計(jì)算量也會(huì)顯著增加，尤其是QM/MM MD模擬，很難采用大的QM分區(qū)。此外，在QM/ MM中，MM部分的原子電荷一般都是非極化的，無法正確地描述QM和MM區(qū)域的相互作用，影響QM/MM的計(jì)算結(jié)果。目前的QM/MM方法仍存在許多挑戰(zhàn)，還需要發(fā)展理論新方法，合理描述QM/MM方法中多尺度邊界和長程QM-MM Coulomb相互作用，實(shí)現(xiàn)低標(biāo)度QM計(jì)算和多尺度的快速Q(mào)M/MM MD模擬，提高QM/MM計(jì)算和QM/ MM MD模擬方法的精確性和效率。

近年來基于分塊的量子力學(xué)計(jì)算方法的發(fā)展為大的QM分區(qū)提供了可能177,178，并在QM/MM計(jì)

算中獲得應(yīng)用。利用大分子體系內(nèi)的“化學(xué)局域性”，將較大的QM區(qū)域分塊處理，在減少計(jì)算量的同時(shí)獲取更為精確的結(jié)果，目前已經(jīng)逐步應(yīng)用于蛋白質(zhì)-配體結(jié)合自由能和蛋白質(zhì)NMR化學(xué)位移等問題的計(jì)算，在藥物設(shè)計(jì)中具有重要應(yīng)用價(jià)值178－181。粗?；肿觿?dòng)力學(xué)能夠在有限的計(jì)算能力下，對大尺度的分子體系進(jìn)行描述，目前已經(jīng)應(yīng)用于生物膜及蛋白質(zhì)生物合成等問題的計(jì)算中，在生物化學(xué)和分子生物學(xué)的理解中具有重要意義182,183，通過和QM/MM方法的結(jié)合，拓展多尺度模擬方法的應(yīng)用。增強(qiáng)抽樣方法的發(fā)展有助于改進(jìn)QM/MM MD方法掃描蛋白質(zhì)構(gòu)象和預(yù)測其熱力學(xué)性質(zhì)的能力，使得理論與實(shí)驗(yàn)的直接可比性更強(qiáng)184－186。介觀動(dòng)力學(xué)的發(fā)展使宏觀熱力學(xué)與微觀動(dòng)力學(xué)有效結(jié)合，在藥物運(yùn)輸?shù)确矫婢哂惺种匾膽?yīng)用價(jià)值187?？傊@些多尺度計(jì)算模擬方法的發(fā)展和結(jié)合，可以突破現(xiàn)有方法在體系大小、時(shí)間尺度、準(zhǔn)確性等方面的局限，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物體系和酶催化過程的多尺度全程模擬。

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Global Simulations of Enzymatic Catalysis

ZHAO Yuan1CAO Ze-Xing2,*
(1KeyLaboratoryofNaturalMedicineandImmuno-Engineering,HenanUniversity,Kaifeng475004,HenanProvince,P.R.China;2Fujian Provincial Key Laboratory of Theoretical and Computational Chemistry,College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University,Xiamen 360015,Fujian Province,P.R.China)

Enzymatic catalytic processes generally involve substrate delivery,selective catalytic reaction,and product release.Owing to the complex protein environment effect,any nonchemical or chemical step may determine the enzyme activity.Herein,to comprehensively understand enzymatic activity,extensive combined quantum mechanics/molecular mechanics(QM/MM)and molecular mechanics(MM)molecular dynamics(MD) simulations were carried out on several kinds of enzymes.Possible reaction mechanisms,roles of the conserved residues,and effects of the protein environment on the whole enzymatic process are discussed in detail,which will enrich the knowledge of reactivity in proteins.With the improvement and development of multiscale models and computational methods,it is expected that global simulations of extremely large and complicated enzymes will enable and lend support to enzyme engineering.

Enzymatic catalysis;Substrate delivery;Free energy calculations;QM/MM MD simulation; Random acceleration molecular dynamics(DAMD)simulation

O641

Zhang,X.;Houk,K.Acc.Chem.Res.2005,38,379.

10.1021/ar040257s

doi:10.3866/PKU.WHXB201612191

Received:October 28,2016;Revised:December 19,2016;Published online:December 19,2016.

*Corresponding author.Email:zxcao@xmu.edu.cn;Tel:+86-592-2186081.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21133007,21373164,21172053).國家自然科學(xué)基金(21133007,21373164,21172053)資助項(xiàng)目