常瑞剛，劉麗霞

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

八眉豬基因組DNA提取方法比較

常瑞剛，劉麗霞*

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

動物遺傳育種的研究以及基因工程等分子水平的操作均需從生物體中提取基因組DNA。提取的DNA質(zhì)量會影響后續(xù)實驗結(jié)果的可靠性，提取方法是影響DNA質(zhì)量的一個重要因素。本實驗采用酚-氯仿抽提法與DNA提取試劑盒法在相同溫度條件下(4 ℃)提取豬耳組織DNA，以探討不同提取方法對DNA質(zhì)量的影響。結(jié)果表明：用酚-氯仿抽提法所提取的DNA經(jīng)凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)分析顯示其條帶更寬更亮，說明含量較高，濃度更大，但點樣孔有少許污染，蛋白質(zhì)未除干凈；而用新興的試劑盒所提取的DNA雖然濃度不是很高，但無污染，可直接用于PCR以及酶切等后續(xù)實驗。

DNA提取； 八眉豬； 酚-氯仿抽提法； DNA提取試劑盒法

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，動物遺傳育種的研究以及基因工程等分子水平的操作均需從生物體中提取基因組DNA。提取的DNA質(zhì)量會影響后續(xù)實驗結(jié)果的可靠性，而提取過程中DNA的質(zhì)量受多種因素的影響，其中不同提取方法是影響其質(zhì)量的一個重要因素。本實驗采用酚-氯仿抽提法與DNA提取試劑盒法在相同溫度條件下(4 ℃)提取豬耳組織DNA，探討不同提取方法對DNA質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以青海互助種豬場的八眉豬為試驗動物。取仔豬耳組織5～6塊，置于盛有75%乙醇的EP管中，放入冰盒中帶回實驗室，在-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

基因組DNA提取試劑盒、蛋白酶K、Tris平衡酚、氯仿-異戊醇、NaAc、冰無水乙醇、75%乙醇、1×TE緩沖液。

自動平衡離心機Labofuge 200和高速冷凍離心機D-37520(德國Eppendorf公司)，低溫冰箱MDF-U541(日本SANYO電子有限公司)，微量移液器(德國Eppendorf公司)，普通PCR儀T1(德國Biometra公司)，凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)BiO-BEST 140E(美國西蒙公司)等。

1.2 方法

試劑盒法。依據(jù)TIANamp Genomic DNA Kit(離心柱型)說明書進(jìn)行操作。

酚-氯仿抽提法。根據(jù)《分子克隆實驗指南》中DNA提取方法進(jìn)行操作[1]。取約30 mg的豬耳組織樣品，放入1.5 mL離心管中，用手術(shù)剪刀剪碎(盡量剪的細(xì)小，便于消化)。加入600 μL DNA提取液，上下翻轉(zhuǎn)混勻。加入10 μL蛋白酶K，封口后置于55 ℃水浴中震蕩12 h 或更長，直至組織完全消化。待耳組織全部被消化后將樣品從水浴鍋中取出，冷卻至室溫后加入600 μL Tris平衡酚，緩慢顛倒搖晃10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min。吸取上清液，加入600 μL Tris平衡酚，緩慢顛倒搖晃10 min，4 ℃ 1 2 000 r·min-1離心10 min。吸取上清液，加入300 μL Tris平衡酚和300 μL氯仿-異戊醇，緩慢顛倒搖晃10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min。吸取上清液，加600 μL氯仿-異戊醇，緩慢顛倒搖晃10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min。 吸取上清液，加入60 μL NaAc和在-20 ℃充分預(yù)冷的冰無水乙醇1 000 μL，輕微搖晃后即可出現(xiàn)乳白色絲狀DNA絮狀沉淀，然后將樣品置于冰中15 min后取出，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min。 棄去上清液，加75%乙醇1 000 μL，12 000 r·min-1離心2 min，重復(fù)操作1次。然后將離心管置于室溫下自然干燥。待乙醇完全揮發(fā)后，加入30 μL 1×TE緩沖液(參考文獻(xiàn)[1]為加200 μL 1×TE)，4 ℃放置24 h以溶解DNA，后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

本實驗結(jié)果采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示(圖1)，2種方法所提取的DNA含量均較高。但相比之下酚-氯仿抽提法所提取的DNA含量更高，濃度更大，與DNA Marker片段相比，除樣品條帶外未出現(xiàn)其它條帶，表明所提取的DNA未受外源核酸和蛋白質(zhì)的污染，且分子大小相同，均在1 000 bp以上。6個試驗樣品遷移率幾乎相同。

3 小結(jié)

M為1 kb DNA marker；1～3為試劑盒提取的DNA；4～6為酚-氯仿提取的DNA圖1 不同方法提取的DNA電泳圖

本實驗結(jié)果表明，在相同溫度條件下，用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法所提取的DNA含量更高，濃度更大，條帶更亮，但點樣孔有少許污染，蛋白質(zhì)未除干凈；而用新興的試劑盒所提取的DNA雖然濃度不是很高，但無污染，可直接用于PCR以及酶切等后續(xù)實驗。

[1] SAMBROOK J, FRITSCH E F, MANIATIS T. Molecular Cloning. A laboratory Manual [J]. Immunology, 2001, 49(1)：895-909.

(責(zé)任編輯：盧福莊)

2017-01-18

常瑞剛(1995—)，男，陜西岐山人，在讀本科生，E-mail：1220654065@qq.com。

劉麗霞(1983—)，女，甘肅隴南人，高級實驗師，博士，從事動物遺傳育種與繁殖研究工作，E-mail：skllx@xbmu.edu.cn。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170450

S828.8；Q781

B

0528-9017(2017)04-0711-01

文獻(xiàn)著錄格式：常瑞剛，劉麗霞. 八眉豬基因組DNA提取方法比較[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(4)：711，715.