王天玉，姚周麟，平新亮，張偉清，馮先橘，林 媚

(浙江省柑桔研究所，浙江 臺州 318026)

QuEChERS-高效液相色譜法測定楊梅果實中苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素的農(nóng)藥多殘留

王天玉，姚周麟，平新亮，張偉清，馮先橘，林 媚*

(浙江省柑桔研究所，浙江 臺州 318026)

解決楊梅果實中苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素的農(nóng)藥殘留問題，建立一種能同時測定楊梅果實中這兩種農(nóng)藥的高效液相色譜分析方法。樣品經(jīng)乙腈提取，QuEChERS法凈化，以乙腈-甲醇-水作為流動相，采用梯度洗脫，在波長254 nm下對待測組分進行檢測，外標法定量。結(jié)果表明，在0.05～10.00 mg·L-1，采用空白基質(zhì)溶液做溶劑配制苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素的標準工作溶液，峰面積與相應(yīng)的質(zhì)量濃度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；在0.08～0.50 mg·kg-1的添加水平下，苯醚甲環(huán)唑平均回收率為86.58%～94.90%，RSD(相對標準偏差)為5.21%～8.64%；乙基多殺菌素平均回收率為86.44%～88.70%，RSD為3.28%～8.31%。這2種農(nóng)藥在楊梅果實中的定量限LOQ均為0.08 mg·kg-1，檢出限LOD均為0.01 mg·kg-1。該方法滿足農(nóng)藥殘留分析要求，簡單易行，且凈化效果好，適用于楊梅果實中苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素的農(nóng)藥多殘留分析。

QuEChERS； 高效液相色譜法； 苯醚甲環(huán)唑； 乙基多殺菌素； 楊梅果實； 農(nóng)藥殘留

楊梅在種植過程中會遭受到各種病蟲害的影響，如癌腫病、褐斑病、白腐病、卷葉蛾、松毛蟲、介殼蟲、果蠅等，農(nóng)藥的大量使用使楊梅果實中的農(nóng)藥超標，嚴重影響人們的健康。因此，低毒易降解農(nóng)藥受到青睞[1]。其中，苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole)和乙基多殺菌素(spinetoram，圖1)對楊梅病蟲害防效較為顯著。苯醚甲環(huán)唑是三唑類甾醇脫甲基化抑制劑，抑制細胞壁甾醇的生物合成，常應(yīng)用于果樹、蔬菜等作物，有效防治黑星病、黑痘病、白腐病、斑點落葉病、白粉病、褐斑病、銹病、條銹病、赤霉病等。乙基多殺菌素是從放線菌刺糖多孢菌(saccharopolyspora spinosa)發(fā)酵產(chǎn)生的，是多殺菌素(spinosad)的換代產(chǎn)品，其原藥的有效成分是乙基多殺菌素-J和乙基多殺菌素-L的混合物(比值為3∶1)，其殺蟲生物活性無顯著差異，可用來防治水果、蔬菜和堅果上的重要害蟲，尤其對蘋果蠢蛾等難防治害蟲效果明顯[2-4]。這兩種農(nóng)藥屬于低毒易降解農(nóng)藥，但使用不合理，仍有農(nóng)藥殘留超標的風險。

目前，國內(nèi)外關(guān)于苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素的原藥及其在水體、土壤、蔬菜、水果等基質(zhì)中的殘留分析方法已有不少報道，如苯醚甲環(huán)唑多采用氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[5-10]。乙基多殺菌素作為近年來新上市的農(nóng)藥，關(guān)于其在環(huán)境中的殘留分析方法報道較少，主要采用液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[11-15]，而在基質(zhì)較為復(fù)雜的楊梅中同時測定苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素殘留的方法尚未見報道。本試驗采用QuEChERS-高效液相色譜法對這兩種農(nóng)藥進行殘留分析方法研究[16-20]，能解決樣品基質(zhì)前處理繁瑣或儀器設(shè)備昂貴等問題，具有簡單、節(jié)省溶劑、分析速度快等特點，能更突出環(huán)境友好和減少污染，對評價與監(jiān)測楊梅果實中的農(nóng)藥殘留狀況提供參考。

圖1 苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及供試樣品

1260高效液相色譜儀(帶VWD紫外檢測器，美國Agilent公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(德國Millipore公司)；DS-1高速組織搗碎機(上海標本模型廠)；MS3旋渦機(德國IKA公司)；SK250KUDOS超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；V-800旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BüCHI公司)；Anke TDL-40B離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

PSA、C18、GCB、MgSO4(美國Agilent公司)；乙腈(AR和HPLC)、甲醇(AR和HPLC)、氯化鈉(AR)均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

苯醚甲環(huán)唑標準品(98.5%，國家標準物質(zhì)中心)；乙基多殺菌素標準品(95.0%，德國Dr.Ehrensorfer公司)；楊梅樣品(浙江省柑桔研究所實驗田，經(jīng)檢測不含苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的提取

將新鮮的楊梅去核后勻漿，稱取制備樣品10.00 g(精確至0.01 g)，置于25 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈、2 g NaCl，旋渦30 s后，超聲提取5 min，于3 000 r·min-1下離心5 min，待凈化。

1.2.2 提取液的凈化

取全部上清液于15 mL的離心管中，加入萃取劑PSA 200 mg、MgSO4400 mg，旋渦1 min后，靜止沉淀，過0.22 μm有機膜，量取8 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 mL左右，氮氣吹干，乙腈定容至1 mL，待進樣。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-甲醇-水；梯度洗脫程序為0 min(58%∶0∶42%)→15 min(58%∶0∶42%)→17 min(0∶92%∶8%)→38 min(0∶92%∶8%)→40 min(58%∶0∶42%)；流速1 mL·min-1；進樣量20 μL；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；以保留時間定性，基質(zhì)匹配外標法峰面積定量。

1.4 標準溶液的配制和線性相關(guān)性測定

標準儲備溶液。準確稱取苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素標準品0.050 8和0.052 6 g，用乙腈配制成質(zhì)量濃度均為500 mg·L-1的標準溶液，于3 ℃下儲存，備用。

基質(zhì)匹配標準曲線。吸取適量的標準儲備液，分別用乙腈和空白基質(zhì)逐步稀釋成質(zhì)量濃度為10，5，3，1，0.5，0.1和0.05 mg·L-1的一系列標準工作溶液，在1.3的條件下，分別進樣20 μL，平行測定3次，以標準品質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作線性回歸，繪制標準曲線。

1.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)指樣品中除目標分析物以外的其它成分對待測物測定值的影響。楊梅果實中含有大量的糖類、酸類和花色素等成分，這些成分可能對農(nóng)藥的檢測響應(yīng)有一定的干擾，為準確評價基質(zhì)對測定結(jié)果準確度的影響，同時選取乙腈和空白基質(zhì)溶液分別配制的標準工作溶液，比較實際樣品和空白溶劑在色譜分析中的響應(yīng)值，對基質(zhì)效應(yīng)進行評價，根據(jù)公式ME計算基質(zhì)效應(yīng)，當<1時，表現(xiàn)為降低信號響應(yīng)；當>1時，表現(xiàn)為增強信號響應(yīng)。

ME/%=As/Ao×100。

式中，ME表示為基質(zhì)效應(yīng)；As表示為空白基質(zhì)標準品響應(yīng)值；Ao表示為空白溶劑標準品響應(yīng)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素易溶于大多數(shù)有機溶劑，而楊梅樣品中含有大量水分，溶液相似相溶，則選取甲醇和乙腈作為提取溶劑，兩者回收率都在92%以上。且乙腈能夠在提取過程中加入鹽和水進行分層，便于凈化，故選取乙腈作為最終提取溶劑。

2.2 吸附劑的選取

分散固相萃取是近幾年發(fā)展迅速的前處理方法，對脂肪酸、色素、糖類等物質(zhì)的吸附效果好且操作比固相萃取簡單，成本更低，被廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果的農(nóng)藥殘留檢測[15-18]。本試驗根據(jù)2種農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)特點和吸附劑的吸附特性，分別對QuEChERS中的3種吸附劑PSA、C18、GCB進行農(nóng)藥回收率的比較。在3種處理中，分別在離心管中添加2 mL苯醚甲環(huán)唑/乙基多殺菌素混合標樣(1∶4)和不同量的吸附劑(100 mg PSA、100 mg C18、15 mg GCB)，每處理重復(fù)3次。

圖2表明，GCB雖然對一些色素多的樣品具有較好的凈化效果，但其對含有平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥具有很強的親和力，對乙基多殺菌素的吸附較強；C18含碳量10%，具有疏水作用，對非極性組分有一定的吸附作用[19-20]；PSA與氨基有相似的吸附特性，可有效的去除脂肪酸、有機酸和一些極性的雜質(zhì)，對這2種農(nóng)藥的吸附最小，可作為最佳吸附劑。

圖2 不同吸附劑對苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素回收率的影響

2.3 吸附劑量的優(yōu)化選擇

按照1.2的試驗方法，分別對楊梅樣品進行不同PSA吸附量(100、200、300、400 mg)的試驗；研究表明，隨著PSA量的加大，楊梅樣品提取液顏色會越來越淺，當加入一定量的時候再無顏色變化，液相色譜測定表明，色素的干擾也隨著吸附劑量的加大逐漸減少?？紤]成本因素，當PSA的量為200 mg時，能得到較好的除雜效果，最終選取此量作為最佳用量。

2.4 進樣條件的優(yōu)化

楊梅樣品含有復(fù)雜的基質(zhì)，對樣品干擾較大，故選取合適的流動相是關(guān)鍵。試驗表明，由于苯醚甲環(huán)唑含有同分異構(gòu)體，當選取甲醇和水作為流動相時，在雜質(zhì)不影響出樣峰的情況下，2種異構(gòu)體出現(xiàn)交叉干擾；當選取乙腈和水時，其強的洗脫能力，則出現(xiàn)好的峰型；乙基多殺菌素出峰時間較晚，當選取乙腈作為流動相時，強的洗脫效果引起雜質(zhì)對峰的干擾較大，不易把峰分開，而甲醇則有良好的峰型；通過改變乙腈、甲醇、水三種溶劑的比例，按照1.3進樣條件，采用梯度洗脫能夠得到這兩種農(nóng)藥在楊梅樣品中較好的峰型。

2.5 方法的線性范圍和基質(zhì)效應(yīng)

樣品基質(zhì)對不同的農(nóng)藥大多數(shù)情況下存在抑制效應(yīng)。一般認為，這種效應(yīng)在85%～115%不存在基質(zhì)效應(yīng)。本試驗結(jié)果表明，楊梅樣品對苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素均存在一定基質(zhì)效應(yīng)；通常采用基質(zhì)匹配標準曲線可有效消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，這2種農(nóng)藥在 0.05～10.00 mg·L-1均具有良好的線性關(guān)系(表1)。

表1 2種農(nóng)藥的線性回歸方程和基質(zhì)效應(yīng)評價

2.6 方法的準確度和精密度

選取不含苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素的楊梅樣品進行回收率的測定，稱取勻漿的樣品10.00 g(精確到0.01 g)，3個處理樣品中各添加一定量的農(nóng)藥，每處理樣品重復(fù)6次，按1.2節(jié)的試驗方法進行樣品的提取、凈化和檢測，試驗結(jié)果表明，苯醚甲環(huán)唑的平均回收率在86.58%～94.90%，RSD(相對標準偏差)5.21%～8.64%；乙基多殺菌素的回收率在86.44%～88.70%，RSD在3.28%～8.31%(表2)，結(jié)果準確度高，精密度好；以3倍空白樣品基線噪音來確定檢出限(LOD)均為0.01 mg·kg-1，以最小添加水平確定方法的定量限(LOQ)均為0.08 mg·kg-1，色譜圖見圖3～4。

2.7 實際樣品的驗證結(jié)果

通過本試驗方法，分別于水果市場、超市、農(nóng)貿(mào)市場和農(nóng)戶采集20幾個批次楊梅樣品進行苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素的農(nóng)藥殘留檢測，結(jié)果均未檢測出這2種農(nóng)藥殘留。

表2 苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素在楊梅果實中的 平均添加回收率及相對標準偏差

圖3 空白樣品的色譜

圖4 添加0.08 mg·kg-1農(nóng)藥樣品的色譜

3 小結(jié)

本研究建立以乙腈為提取劑，經(jīng)QuEChERS方法凈化，液相色譜檢測楊梅樣品中苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素兩種農(nóng)藥的殘留分析方法。由于楊梅樣品中復(fù)雜的基質(zhì)，對農(nóng)藥檢測的干擾較大，通過對各種吸附劑的篩選，優(yōu)化前處理過程，并對流動相采用了梯度洗脫方式，取得良好的目標化合物和雜質(zhì)分離，填補了楊梅樣品上面這兩種農(nóng)藥的殘留分析方法空白，基質(zhì)空白校正減少了樣品的基質(zhì)效應(yīng)。該方法操作簡單、分析快速、靈敏度高、實用性強；同時樣品前處理中有機溶劑的少量使用，可以降低了成本，減少污染；通過液相色譜分析，可以更好的解決設(shè)備昂貴方面的限制，方便方法的應(yīng)用，也為各種水果中苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素的農(nóng)藥殘留分析提供參考依據(jù)。

[1] 顏麗菊，徐春燕，王康強. 楊梅栽培技術(shù)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.

[2] 王遠，邢麗杰，郝家勇，等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中苯醚甲環(huán)唑的殘留量[J]. 食品科學(xué)，2011，32(18)：296-299.

[3] 陳國，朱勇，趙健，等. 乙基多殺菌素在稻田水、土壤和水稻植株中的殘留及消解動態(tài)[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2014，16(2)：153-158.

[4] 夏華興，陳明亮，劉維新，等. 氟啶蟲胺腈與乙基多殺菌素混用防治水稻遷移性害蟲田間藥效試驗[J]. 現(xiàn)代農(nóng)藥，2013，12(3)：52-53，56.

[5] GUO C，LI J Z，GUO B Y，et al. Determination and safety evaluation of difenoconazole residues in apples and soils[J]. Bull Environ Contam Toxicol，2010，85(4)：427-431.

[6] FERREIRA J A, SANTOS L F, SOUZA N R, et al. MSPD sample preparation approach for reversed-phase liquid chromatographic analysis of pesticide residues in stem of coconut palm[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2013, 91(2):160-164.

[7] 王軍，劉豐茂，溫家鈞，等. 苯醚甲環(huán)唑在茶葉中的殘留量及其在茶湯中的浸出動態(tài)研究[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2010，12(3)：299-302.

[8] 安晶晶，劉新剛，董豐收，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定土壤、蔬菜及水果中苯醚甲環(huán)唑和丙環(huán)唑殘留[J]. 農(nóng)藥，2009，48(7)：506-508.

[9] 薛曉航，戴守輝，張璐珊，等. QuEChERS/GC-MS快速分析土壤中的苯醚甲環(huán)唑殘留[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2010，12(3)：309-312.

[10] 王軍，溫家鈞,邊俠玲，等.柑橘和土壤中苯醚甲環(huán)唑殘留動態(tài)研究及安全性評價[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，22(3)：644-647.

[11] LIU X，EL-ATY A M A，PARK J Y，et al. Determination of spinetoram in leafy vegetable crops using liquid chromatography and confirmation via tandem mass spectrometry [J]. Biomedical Chromatography，2011，25(10)：1099-1106.

[12] PARK K H，CHOI J H，EI-ATY A M A，et al. Determination of spinetoram and its metabolites in amaranth and parsley using QuEChERS-based extraction and liquid chromatograpy-tandem mass spectrometry[J]. Food Chem，2012，134(4)：2552-2559.

[13] 趙瑤瑤，秦旭，秦冬梅，等. XDE-175及其代謝物在甘藍和土壤中的殘留動態(tài)研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2009，28(5)：1032-1036.

[14] MALHAT F M. Simultaneous determination of spinetoram residues in tomato by high performance liquid chromatography combined with QuEChERS method [J]. Bull Environ Contam Toxicol，2013，90：222-226.

[15] 孫敏，曹趙云，劉慧，等. PSA分散固相萃取和高效液相色譜-質(zhì)譜法測定蔬菜中多殺菌素的殘留量[J]. 分析試驗室，2010，29(8)：70-74.

[16] 粟有志，周均，孟茹，等. QuEChERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定果蔬及其制品中噻霉酮殘留[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2016，18(1)：135-140.

[17] BIZIUK M，STOCKA J. Multiresidue methods for determination of currently used pesticides in fruits and vegetables using QuEChERS technique [J]. Int J Environ Sci Dev，2015，6(1)：18-22.

[18] HU M F，LIU X G，DONG F S，et al. Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick，easy，cheap，effective，rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Food Chem，2015，175：395-400.

[19] ANASTASSIADES M，LEHOTAY S J，STAJNBAHER D，et al. Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and “dispersive solid-phase extraction” for the determination of pesticide residues in produce[J]. Journal of AOAC International，2003，86(2)：412-431.

[20] 董靜，潘玉香，朱莉萍，等. 果蔬中54種農(nóng)藥殘留的QuEChERS/GC-MS快速分析[J]. 分析測試學(xué)報，2008，27(1)：66-69.

(責任編輯：張瑞麟)

2017-01-11

臺州市科學(xué)技術(shù)局資助項目(162ny12)

王天玉，男，湖北襄陽人，助理研究員，碩士，從事農(nóng)藥與環(huán)境毒理學(xué)研究工作，E-mail：wangtianyu2011@163.com。

林 媚，E-mail：1311219778@qq.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170410

S667.6

B

0528-9017(2017)04-0583-04

文獻著錄格式：王天玉，姚周麟，平新亮，等. QuEChERS-高效液相色譜法測定楊梅果實中苯醚甲環(huán)唑和乙基多殺菌素的農(nóng)藥多殘留[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(4)：583-586，589.