蔡 薇，支添添，任春梅，2*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128）

擬南芥HGO基因啟動(dòng)子與GUS融合表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化鑒定

蔡 薇1，支添添1，任春梅1，2*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128）

HGO基因編碼的尿黑酸1，2雙加氧酶催化酪氨酸降解途徑中的倒數(shù)第三步。本研究構(gòu)建了擬南芥HGO基因啟動(dòng)子與GUS的融合表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因株系。經(jīng)GUS組織化學(xué)染色鑒定，證明擬南芥HGO基因啟動(dòng)子與GUS的融合表達(dá)載體成功構(gòu)建且能正常啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)，為深入研究擬南芥HGO基因的表達(dá)特征創(chuàng)建了有價(jià)值的材料。

擬南芥；HGO；啟動(dòng)子；同源重組；基因克隆

酪氨酸降解途徑在動(dòng)物體內(nèi)是必不可少的一條代謝途徑［1］，尿黑酸1，2雙加氧酶（homogentisate dioxygenase，HGO）是酪氨酸降解途徑中倒數(shù)第三步，可將尿黑酸氧化分解成馬來(lái)酰乙酰乙酸，再經(jīng)馬來(lái)酰乙酰乙酸異構(gòu)酶作用形成延胡索酰乙酰乙酸，最后在延胡索酰乙酰乙酸酶（fumarylacetoacetate hydrolase，F(xiàn)AH）的作用下形成乙酰乙酸和延胡索酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)徹底分解［2］。在動(dòng)物中，HGO基因是不可缺少的，HGO的缺失會(huì)導(dǎo)致尿黑酸血癥［3］。在植物中，除發(fā)現(xiàn)HGO基因突變可以促進(jìn)擬南芥幼苗的生長(zhǎng)［4］外，無(wú)其他研究成果。

本試驗(yàn)以模式植物擬南芥為材料，構(gòu)建了HGO基因啟動(dòng)子與GUS的融合表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入擬南芥中，抗性篩選獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系，利用GUS染色檢測(cè)到擬南芥HGO基因啟動(dòng)子成功轉(zhuǎn)入植株內(nèi)且能正常啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Col-0和載體pCAMBIA1301由作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物信號(hào)傳導(dǎo)課題組保存，ClonExpressⅡ重組試劑盒從Vazyme公司購(gòu)買。

1.2 植物的培養(yǎng)和生長(zhǎng)條件

將擬南芥種子用消毒液（20%bleach＋0.1% Triton100）浸泡10 min后，在超凈臺(tái)上用無(wú)菌水清洗4～5次，直接播種在含1%蔗糖的MS固體培養(yǎng)基上。4℃黑暗處理3 d后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室生長(zhǎng)，培養(yǎng)溫度（22±2）℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗［5］。待其生長(zhǎng)7 d后，移栽到營(yíng)養(yǎng)土（東北黑土與蛭石的體積比為1∶1）中并蓋上透明塑料蓋培養(yǎng)1～2 d，生長(zhǎng)條件同上。

1.3 表達(dá)載體的構(gòu)建

1.3.1 設(shè)計(jì)引物及目的片段的擴(kuò)增

在TAIR網(wǎng)站上找到已公布的擬南芥HGO基因啟動(dòng)子序列，經(jīng)plantcare在線分析軟件分析后選取ATG前2000 bp序列，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier5設(shè)計(jì)特異性引物PstⅠ-F/NcoⅠ-R。因所選表達(dá)載體需含有GUS報(bào)告基因，而所有含GUS報(bào)告基因的載體在35S啟動(dòng)子下游都只含NcoⅠ和BglⅡ這兩個(gè)可選限制性酶切位點(diǎn)，BglⅡ酶切位點(diǎn)包含在GUS基因內(nèi)，而NcoⅠ與目的基因中存在同源序列。針對(duì)這一問(wèn)題采用同源重組法構(gòu)建載體，先將載體線性化，選取兩個(gè)限制性內(nèi)切酶PstⅠ和NcoⅠ對(duì)載體進(jìn)行雙酶切。因此需要在引物5′端引入線性化載體末端同源序列，使得插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物5′和3′最末端分別帶有和線性化載體兩末端對(duì)應(yīng)的完全一致的序列［6］，引物為：

下劃線部分為酶切位點(diǎn)，5′端前端為入線性化載體末端同源序列。根據(jù)引物合成時(shí)預(yù)測(cè)的退火溫度，選用67℃為PstⅠ-F/NcoⅠ-R退火溫度。用SDS法［7］提取擬南芥Col-0野生型葉片基因組DNA，以此為模板用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切膠回收并純化。

1.3.2 擬南芥HGO基因與GUS融合載體的重組及鑒定

選用PstⅠ和NcoⅠ限制性內(nèi)切酶將pCAMBIA1301載體線性化（載體線性化方式可以為限制性內(nèi)切酶酶切消化，也可以為反向PCR擴(kuò)增）。利用ClonExpressⅡ試劑盒進(jìn)行重組反應(yīng)。體系為5 ×CEⅡBuffer 4μL，線性化載體8μL，插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物1μL，ExnaseⅡ2μL，ddH2O 5μL。將配置好的體系置于37℃反應(yīng)30 min，反應(yīng)完后將反應(yīng)管立即置于冰上冷卻5 min。將20μL冷卻反應(yīng)液，加入到200μL的感受態(tài)中，輕彈管壁混勻，在冰上放置30 min。42℃熱激60～90 s，冰水浴孵育2 min。加入900μL LB液體培養(yǎng)基，37℃孵育10 min充分復(fù)蘇。37℃150 rmp搖菌45 min。6000 g離心2 min，去部分上清液，將其充分混勻，取100μL混勻后的菌液涂布在含有50 mg/L kan的LB培養(yǎng)基上。37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)［8～11］。取陽(yáng)性克隆送華大基因公司測(cè)序。采用電擊法將測(cè)序驗(yàn)證正確的重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.3.3 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選

挑選菌落PCR驗(yàn)證正確的農(nóng)桿菌單菌落于含有卡那霉素（50 mg/L）、慶大霉素（50 mg/L）和利福平（25 mg/L）的YEB液體培養(yǎng)基里進(jìn)行活化處理，28℃、220 rpm振蕩培養(yǎng)18～24 h。6000 g離心大量活化菌液2 min，棄上清，用農(nóng)桿菌懸浮液（5%蔗糖＋1/2 MS＋0.02%Silwet-L77＋0.01%6-BA）將菌體重懸至OD600在0.6～1.0之間。利用浸花法［12］轉(zhuǎn)化擬南芥，收取T0代種子，在含有潮霉素（25 mg/L）的MS培養(yǎng)基上篩選成功轉(zhuǎn)入pHGO：：GUS表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)一步采用PCR進(jìn)行植株鑒定，用GUS組織化學(xué)法檢測(cè)啟動(dòng)子活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥HGO基因啟動(dòng)子的克隆

根據(jù)已知的序列信息，設(shè)計(jì)帶特異酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增引物分別含PstⅠ和NcoI的酶切位點(diǎn)，以擬南芥Col-0野生型基因組DNA為模板，采用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物預(yù)期大小為2002 bp。將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物符合預(yù)期大?。▓D1）。這表明PstⅠ-F和NcoⅠ-R能成功擴(kuò)增出目的片段。

圖1 HGO基因啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR result of HGO promoter

2.2 pHGO∶∶GUS融合表達(dá)載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物和線性化載體用ClonExpressⅡ試劑盒重組，構(gòu)建重組后產(chǎn)物采用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli DH5α，隨機(jī)挑選單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖2）。菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小在2000 bp左右，與預(yù)期結(jié)果一致。2號(hào)泳道加入的模板為水，此泳道沒(méi)有出現(xiàn)條帶，說(shuō)明PCR體系沒(méi)有DNA污染；3～6號(hào)泳道條帶大小均在2000 bp左右，與預(yù)期大小相似。選取條帶最亮的6號(hào)大腸桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒送至上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果顯示：6號(hào)菌種插入片段大小為2002 bp，經(jīng)過(guò)DNAMAN軟件序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)目的基因與GUS之間的結(jié)合位點(diǎn)與預(yù)期一致，且沒(méi)有移碼亂碼現(xiàn)象，這表明pHGO∶∶GUS融合表達(dá)載體（圖3）成功構(gòu)建。

圖2 融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.coli DH5α后的菌落PCR檢測(cè)Fig.2 PCR result of fusion expression vector was transformed into E.coli DH5α

圖3 pHGO∶∶GUS融合表達(dá)載體示意圖Fig.3 Schematic diagram of pHGO∶∶GUS vector

2.3 pHGO∶∶GUS融合表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化及鑒定

將pHGO∶∶GUS重組表達(dá)載體通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，進(jìn)行融合基因的穩(wěn)定表達(dá)實(shí)驗(yàn)。融合表達(dá)載體具有潮霉素抗性，將浸染后當(dāng)代成熟的種子鋪種在MS培養(yǎng)基上春化后在長(zhǎng)日照下生長(zhǎng)，具有潮霉素抗性的植株正常生長(zhǎng)。將抗性苗移栽至人工土壤中，簡(jiǎn)易SDS法提取潮霉素抗性植株基因組DNA，以引物對(duì)pC1301-F/pC1301-R進(jìn)行特異性擴(kuò)增，引物為：

結(jié)果表明，大部分潮霉素抗性植株能產(chǎn)生特異擴(kuò)增帶（圖4），說(shuō)明融合表達(dá)載體已成功整合到擬南芥基因組中。

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的PCR檢測(cè)Fig.4 Result of genetic transformation

2.4 轉(zhuǎn)基因植株GUS檢測(cè)

為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中的HGO啟動(dòng)子是否具有活性，隨機(jī)挑選具潮霉素抗性和PCR陽(yáng)性的T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行報(bào)告基因的檢測(cè)。將檢測(cè)植株的種子鋪種在含有潮霉素（25 mg/L）的MS培養(yǎng)基上，置于長(zhǎng)日照（16 h光照/8 h黑暗）下培養(yǎng)7～9 d，取無(wú)菌苗進(jìn)行GUS組織化學(xué)法檢測(cè)，通過(guò)實(shí)體顯微鏡觀察染色結(jié)果。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)入pCAMBIA1301質(zhì)粒（含35S啟動(dòng)子）的陽(yáng)性對(duì)照（圖5A）幼苗中，GUS基因在根、下胚軸、葉中都高度表達(dá)；轉(zhuǎn)入擬南芥HGO基因啟動(dòng)子與GUS融合表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株幼苗（圖5B），GUS基因在根、下胚軸及子葉中表達(dá)較強(qiáng)，在真葉中的表達(dá)較弱；而GUS基因未在陰性對(duì)照幼苗中表達(dá)（圖5C）。

3 結(jié)論與討論

在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，需要精心選擇酶切位點(diǎn)及標(biāo)記基因。當(dāng)目的基因中含有較多的常用酶切位點(diǎn)時(shí)，不得不選擇酶切效率低、價(jià)格昂貴的非常用限制性內(nèi)切酶或構(gòu)建中間載體，這樣會(huì)大幅度降低實(shí)驗(yàn)成功率。本研究中因目的基因內(nèi)含較多常用酶切位點(diǎn)，所以選用了Vazyme公司ClonExpressⅡ重組試劑盒，此試劑盒采用同源重組的原理，不受酶切位點(diǎn)的限制，降低了載體的局限性。

本研究成功構(gòu)建了擬南芥HGO基因啟動(dòng)子與GUS載體的融合表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)電泳及測(cè)序檢測(cè)，證實(shí)目的片段與pCAMBIA1301在預(yù)測(cè)位點(diǎn)重組且插入片段無(wú)錯(cuò)配現(xiàn)象，大小正確。對(duì)擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化后代進(jìn)行篩選，在含有潮霉素（25 mg/L）的MS培養(yǎng)基上獲得抗性苗，GUS染色結(jié)果表明，擬南芥HGO基因啟動(dòng)子成功轉(zhuǎn)入植株中且能正常啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)，為深入研究擬南芥HGO基因的表達(dá)特征創(chuàng)建了有價(jià)值的材料。

GUS染色結(jié)果顯示，擬南芥HGO基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入擬南芥，在根、下胚軸和子葉中表達(dá)較強(qiáng)，在真葉中表達(dá)較弱，表明在根、下胚軸和子葉中酪氨酸的積累較多，酪氨酸降解途徑較活躍；而真葉中酪氨酸的積累較少，酪氨酸降解途徑較緩慢。這也說(shuō)明為什么HGO基因的突變使得擬南芥只在幼苗期長(zhǎng)勢(shì)較野生型更為健碩。因生命活動(dòng)或功能的不同需求，同種物質(zhì)在擬南芥的不同組織部位有著其特異性的表達(dá)，但這特異性的表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。

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Cloning and Transformation of the HGO Promoter from Arabidopsis thaliana

CAIWei1，ZHITiantian1，REN Chunmei1，2*
（1 College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province，Changsha，Hunan 410128，China）

The HGO gene encodes the1，2-homogentisate dioxygenase，which catalyzes the last third step in the Tyr degradation pathway.In this study，a fusion expression vector of Arabidopsis thaliana HGO gene promoter and GUSgene was constructed and transformed into Arabidopsis thaliana by Agrobacterium-mediated transformation.Results from histochemical GUS assay suggested that fusion expression vector of HGO gene promoter and GUSgene was successfully constructed and it drives the expression of GUSgene successfully.Our results create valuablematerials for studying the expression characteristics of HGO gene in Arabidopsis thaliana.

Arabidopsis thaliana；HGO；promoter；homologous recombination；gene cloning

Q784

A

1001-5280（2017）03-0256-04 DO I：10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2017.03.09

2016- 11- 30

蔡 薇（1992-），女，碩士研究生，Email：416382074＠qq.com。*通信作者：任春梅，教授，博士，主要從事植物分子遺傳學(xué)研究，Email：rencm66＠163.com。

國(guó)家973計(jì)劃前期研究專項(xiàng)（2014CB160308）。