黃汐威， 程 濤， 丁誠翔， 王 翔， 高海軍， 蘇江濤

(杭州電子科技大學 射頻電路與系統(tǒng)教育部重點實驗室，浙江 杭州 310018)

無透鏡微流控成像流動細胞檢測與計數(shù)系統(tǒng)*

黃汐威， 程 濤， 丁誠翔， 王 翔， 高海軍， 蘇江濤

(杭州電子科技大學 射頻電路與系統(tǒng)教育部重點實驗室，浙江 杭州 310018)

在未來面向個人化的生物醫(yī)療診斷中，實時的細胞檢測與計數(shù)具有重要需求。現(xiàn)有的細胞檢測和計數(shù)系統(tǒng)例如流式細胞儀和血細胞計數(shù)器不適用于小型化流動細胞實時檢測和計數(shù)。通過將CMOS圖像傳感器芯片和微流控芯片結合，提出了一種用于流動細胞檢測和計數(shù)的無透鏡微流控成像系統(tǒng)，與用于計數(shù)靜態(tài)細胞的其它無透鏡微流控成像系統(tǒng)不同，該系統(tǒng)可以通過基于時域差分的運動檢測算法檢測和計數(shù)微流體通道中連續(xù)流動的細胞樣本。測試結果表明：該系統(tǒng)可以對微流控通道中流動的人體骨髓基質(zhì)細胞實現(xiàn)自動檢測和計數(shù)，并具有-6.53 %的低統(tǒng)計錯誤率。該系統(tǒng)提供了面向未來即時應用的細胞檢測和計數(shù)解決方案。

CMOS圖像傳感器； 微流控； 無透鏡成像； 流動細胞檢測和計數(shù)

0 引 言

在未來面向個人化的生物醫(yī)療診斷中，實時的細胞檢測與計數(shù)具有重要需求[1～6]。例如:需要檢測和計數(shù)血紅細胞RBC以獲得患者健康狀況的信息，或通過對血液中的CD4+ T淋巴細胞的檢測和計數(shù)監(jiān)測HIV/AIDS的治療狀況[7～9]。傳統(tǒng)的用于細胞檢測和計數(shù)的設備有血細胞計數(shù)板和流式細胞儀[10,11]。目前,血細胞計數(shù)板采用基于顯微鏡的手動計數(shù)，對于高通量和大規(guī)模測試來說并非是實時或自動的。流式細胞儀雖然可以通過激光器和光學檢測器精確和高效地計數(shù)聚焦流動流中的細胞，然而其體積龐大、操作復雜以及價格昂貴，限制了其在資源有限區(qū)域的即時應用。

針對上述問題，小型化的無透鏡微流成像系統(tǒng)可以提供有效的解決方案[12～14]。待檢測細胞可放置在顯微鏡載玻片上或微流控通道中，剛好位于CCD/CMOS圖像傳感器感應陣列上方，并與感應像素陣列保持緊密貼近的距離。當光源投射到細胞上時，細胞的陰影圖像可以由其下方的圖像傳感器直接捕獲。圖像傳感器的像素陣列和細胞的位置之間的距離稱為物距。由衍射效應可知，物距是確定成像細胞的直徑和對比度的關鍵參數(shù)[15]。與血細胞計數(shù)器不同，該系統(tǒng)在高通量下的細胞檢測和計數(shù)仍以自動化方式進行。而與流式細胞儀相比，該系統(tǒng)沒有大體積的光學透鏡，其尺寸、重量和成本均得到了優(yōu)化。

本文介紹了一種實時無透鏡微流控成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要針對高通量自動檢測和在連續(xù)流動微流管道中細胞或微生物的計數(shù)。與僅需要一幀的靜態(tài)細胞計數(shù)不同，流動細胞計數(shù)接收一系列幀。因為連續(xù)幀中的細胞運動受到微流體流速和傳感器幀速率二者的影響，所以，使用一個基于快速時域差分的背景減法來進行運動估計?；谏鲜鲈泶罱ǖ臒o透鏡微流控成像系統(tǒng)成功實現(xiàn)了對流動人體骨髓基質(zhì)細胞的檢測和計數(shù)，經(jīng)實驗驗證，系統(tǒng)的誤差率僅為-6.53 %。

1 無透鏡微流控成像系統(tǒng)

1.1 系統(tǒng)概述

針對流動細胞檢測和計數(shù)所提出的無透鏡微流控成像系統(tǒng)如圖1所示。它包括一個與CMOS圖像傳感表面貼合的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流體通道。外部的注射泵驅(qū)動微流體進入通道并控制其流速，待檢測細胞樣本在該通道中連續(xù)流動。在微流體通道上方設置的光源采用常規(guī)白色LED，隨著白光從上部投射到下方的細胞，其陰影圖像被圖像傳感器捕獲并輸出，進而通過圖像分析實現(xiàn)細胞的檢測與計數(shù)。

圖1 無透鏡微流控成像系統(tǒng)

圖1(a) 注射泵用于驅(qū)動試劑進入微流體通道并控制流速，圖(b) 與微流體通道結合并進一步組裝在PCB上的CMOS圖像傳感器的結構示意圖，圖(c)微流通道集成的芯片照片與硬幣對比圖，圖 (d) 用于CMOS圖像傳感器讀取和與PC通信的PCB，圖(e) 外部自主開發(fā)的用于細胞檢測計數(shù)的軟件模塊。

1.2 微流體流動模型

如圖2所示，假設細胞在注射泵的驅(qū)動下以RμL/min的流速沿著微流體通道從右向左流動。由于微流通道中的微流體具有穩(wěn)定的層流特性，其中大多數(shù)細胞將以可預測的方式以相近的流速V下通過微流體進行輸送?；诰匦挝⒘黧w通道設計，通道中流體的流速為V=R/W·H，其中，W為通道寬度，H為通道高度。用于系統(tǒng)分析的所有符號和術語匯總如表1。

實時流動細胞檢測和計數(shù)的主要難點為檢測與通道背景相反的物鏡差異的運動檢測[16]。在無透鏡微流控成像系統(tǒng)中，由于細胞通常具有一定的透明度，它們的圖像無法顯示出與背景的高強度差異，二者的對比度不高，易受背景亮度和暗度變化的影響。本文采用基于時域差分的運動檢測[16，17]方法實現(xiàn)一系列幀中的流動細胞檢測和計數(shù)。利用細胞圖像的強度特性，分2個步驟進行：1)對每1幀中的所有單元執(zhí)行運動檢測；2)基于每1幀中的細胞計數(shù)執(zhí)行總細胞計數(shù)。下面給出每個步驟的更詳細的討論。

表1 無透鏡微流控成像系統(tǒng)符號匯總

1.3 細胞檢測

通過利用連續(xù)幀的逐像素強度差來檢測移動細胞區(qū)域。差異主要由通道中的細胞運動或者從傳感器視場(field-of-view,FOV)中添加或去除細胞引起。1個完整幀包括對應于傳感器FOV的m(H)×n(V)個像素。圖2(a)和圖2(b)僅顯示出通道中單個細胞圖的一部分。

圖2 基于時域差分的流動細胞檢測和計數(shù)的流程和相應的圖像

細胞檢測程序如圖2所示。(a)～(f)對應于細胞檢測步驟的細胞圖像，(g)～(k)對應于圖(a)， (c)， (e)，(f)中的小細胞圖像的放大細胞圖像。從右到左流動的1個細胞在2個連續(xù)幀ft-Δt和ft中的2個不同位置被捕獲。其中，ft-Δt為參考幀(或背景幀)，ft為當前幀，如圖2(a)和圖2(b)所示。2個幀ft-Δt和ft之間的時間差是Δt，其由CMOS圖像傳感器幀速率Fps確定，即Δt=1/Fps。假設系統(tǒng)在某個照明下工作，當前幀可以被定義為

ft=It(x,y)+ΔIB(x,y)|x∈m,y∈n

(1)

式中It(x,y)為由像素坐標(x,y)處的當前幀ft的細胞陰影引起的像素強度的部分，ΔIB(x,y)為由照明確定的背景強度變化以及來自通道或傳感器表面的可能污漬。

由于細胞的透明性，由無透鏡微流控成像系統(tǒng)捕獲的細胞圖像顯示出中心區(qū)域較亮和在細胞邊界處黑暗的特性，如圖2(g)所示。說明中心像素具有比背景更高的強度水平，相對地，邊界處的像素具有比背景更低的強度水平。利用背景減除算法，可以獲得時域差分圖像dt=ft-ft-Δt，并且其對應的強度矩陣為

Dt(x,y)=[It(x,y)+ΔIB(x,y)]-[It-Δt(x,y)+ΔIB(x,y)]=It(x,y)-It-Δt(x,y)

(2)

式中Dt(x,y)為在相同位置(x,y)處的兩個連續(xù)幀之間的強度差。在dt中，只有存在于ft-Δt和ft中的兩個區(qū)域的細胞被清晰地示出來(圖2(c))，并且其他的背景區(qū)域都被減為零。因此，背景變化效應降低。這兩個細胞區(qū)域的差別在于，在當前幀ft中的細胞對應的一個細胞區(qū)域顯示出在中心光亮和在細胞邊界處黑暗的特性，如圖2(h)所示；而由先前的幀ft-Δt中的細胞引起的區(qū)域被反轉，其光亮處位于邊界，而黑暗處位于中心，如圖2(i)所示。這個在圖2(i)中的細胞陰影變成在如圖2(h)所示的流動細胞后面移動的人工“尾巴”。

為了檢測當前幀中的實際細胞，“尾部”需要被去除。人工“尾部”的去除可以通過將Dt(x,y)大于零的部分設置為零來實現(xiàn)

(3)

Bt(x,y)=0,else

(4)

圖2(k)中二進制圖像中顯示白色圓圈的大區(qū)域為當前幀ft(x,y)的實際細胞，圖2(j)中白色像素塊的小區(qū)域為前1幀ft-1(x,y)中的“尾部”細胞。所有這類區(qū)域均已被標記，因此，可以計數(shù)像素個數(shù)。將代表白色區(qū)域面積的像素計數(shù)與預定的去除閾值Tr進行比較，如果像素計數(shù)小于Tr，則對應的白色區(qū)域可以當做“尾部”細胞區(qū)域，故可將該區(qū)域去除如圖2(f)所示。利用這一計數(shù)方法，基于本文實驗體系，得到Tr=8。

圖(x,y)中的2個細胞區(qū)域強度分布

1.4 細胞計數(shù)

在完成每1幀的細胞檢測之后，可以獲得細胞的計數(shù)Nt和它們的質(zhì)心坐標Ct,k(x,y),0≤k≤Nt，k為幀ft中的第k個細胞。為了統(tǒng)計由一系列圖像(從ft=1至ft=M)拍攝的流過微流體通道的N個細胞的總數(shù)，其中M為具有M·Δt持續(xù)時間的一個測試圖像的總數(shù)。N包括了對每1幀中的細胞計數(shù)進行的正時間差的和。

為了獲得流動細胞的總數(shù)，采用時間減法(Nt-Nt-1)以計算在當前幀ft中進入微流體通道的新細胞。與前1幀ft-1相比，當前幀ft中的細胞可以有3種情況：1)新的細胞流入傳感器FOV，細胞計數(shù)超過Nt-1;2)現(xiàn)有細胞流出傳感器FOV，細胞計數(shù)減少Nt-1;3)沒有新細胞流入或現(xiàn)有細胞不流出。因此，只有正時間細胞計數(shù)差能夠有效地表示實際總細胞數(shù)N。在1次測試中處理每個新幀之后，通過將連續(xù)幀中的所有這些正細胞計數(shù)差值相加來獲得最終總細胞計數(shù)N，即

(5)

由上式便可獲得在一個測試中由一系列圖像拍攝的流經(jīng)微流體通道的總細胞數(shù)N。

1.5 性能分析

無細胞微流控成像的細胞檢測和計數(shù)的目的是為了獲得更高通量。單位時間內(nèi)檢測到的細胞數(shù)即細胞吞吐量，定義為P=W·H·L·ρ/t=W·H·ρ·V，其中ρ為檢測試劑中的細胞濃度。顯見流速V與微流體中的細胞通過量P成正比。由于V具有層流特性，因此1幀時間內(nèi)細胞的最大流動距離不能超過通道長度L的1/2

(6)

如果使用高幀速率傳感器，可以減輕微流泵流量的限制，同時也將提高最大總吞吐量P=WHLρFps/2。然而，在無透鏡微流成像系統(tǒng)中，高流速V可能在時間差方法中引起誤差。

在細胞檢測的過程中，由于來自CMOS圖像傳感器的慢快門速度或長曝光時間的限制，高流速V可能引起運動模糊效應并導致細胞成像中的對比度損失。這種情況下，每1幀的細胞檢測期間，模糊細胞將被錯誤地判斷為背景區(qū)域，進一步導致該幀中的計數(shù)誤差。為了減少這種誤差，需適當?shù)乜刂屏魉賄并減小傳感器曝光時間。

在細胞計數(shù)過程中，基于時域差分的計數(shù)精度不僅與流速V有關，而且與傳感器幀速率Fps有關。若在1幀中捕獲現(xiàn)有細胞并且在下1幀中檢測到的所有細胞都是新細胞，這種情況下，無論什么減法結果，計數(shù)都是錯誤的，因為這2幀之間沒有時間連續(xù)性。為了消除這種錯誤計數(shù)，需要適當?shù)乜刂茙俣萔，使得通過至少2個連續(xù)幀捕獲1個細胞以保證時間連續(xù)性。

2 系統(tǒng)搭建

2.1 微流控通道制造

微流控通道通過PDMS軟刻蝕圖案化制造。為了充分使用有源像素區(qū)域，選擇微流通道長度為4.5mm，通道寬度設為100μm，確保細胞能夠在通道中平穩(wěn)流動，通道的高度為30μm，恰好高于一般細胞的直徑。這一設置保證了細胞流動靠近傳感器表面，可以產(chǎn)生更好的投影圖像對比度[15]。

為了簡化微流控芯片與圖像傳感器芯片的集成，微流控通道芯片直接貼合在CMOS圖像傳感器(AptinaMT9V032,SanJose,CA)的保護玻璃的頂部，其像素尺寸為11.5mm(W)×11.5mm(L)×2.3mm(H)。CMOS圖像傳感器具有4.5mm(H)×2.9mm(V)的光檢測面積。傳感器在全分辨率下的幀速率為60幀/s。傳感器芯片焊接在一個低成本的6cm×6cm的PCB上，該PCB為傳感器提供電源和數(shù)字控制信號。傳感器通過USB接口傳輸數(shù)據(jù)到PC，可以確保高速成像和讀取數(shù)據(jù)。讀出幀存儲在PC中，并且進行基于Matlab的數(shù)字圖像處理以進行實時地細胞檢測和計數(shù)。

3 實驗結果

為了檢查無透鏡微流控成像系統(tǒng)的成像和檢測效果，采用骨髓基質(zhì)細胞進行檢測與技術驗證。圖4(a)～(d)分別給出了靜止低速(0.003m/s)、中速(0.036m/s)和高速(0.056m/s)狀態(tài)下的成像結果。作為參考，圖4(e)為10倍顯微鏡下的成像結果。傳感器的幀速率為16幀/s。每個實驗組拍攝4s的圖像。

圖4 無透鏡微流控成像系統(tǒng)分別在靜態(tài)和不同流速狀態(tài)下拍攝的骨髓細胞圖像以及在10倍顯微鏡下的細胞圖像

圖5 在靜態(tài)以及不同流速下無透鏡細胞圖像直徑線強度分布

以0.3 μL/min和1.3 μL/min的不同泵流速進行流動的人體骨髓基質(zhì)細胞的計數(shù)實驗，以證明系統(tǒng)的計數(shù)精確度。每個實驗組都包括系統(tǒng)在4 s內(nèi)捕獲的64個無透鏡圖像。檢測期間，捕獲到的圖像通過USB輸出到外部計算機以進行實時處理。由于僅在1幀通道區(qū)域進行選擇和處理，所以有用數(shù)據(jù)減少到原始全圖像數(shù)據(jù)的約5 %，因為該通道僅覆蓋整個傳感器有源FOV圖像數(shù)據(jù)的4 % 。而總的處理時間約為2 s。因此，本文系統(tǒng)可以全自動、實時地面向高通量工作。

如表2所示，與通過人眼觀察所捕獲的圖像的人工計數(shù)結果比較，自動計數(shù)，在0.3 μL/min的低流速下的平均細胞通過量為6個細胞/s，錯誤率為-1.6 %;在1.3 μL/min的高流速下，平均細胞吞吐量為12個細胞/s，錯誤率為-8.9 %。2種精度都在10 %的誤差區(qū)域內(nèi)。證明了系統(tǒng)的流動細胞檢測和計數(shù)的有效性。錯誤率來自一些具有低對比度或噪聲的誤檢測細胞。每個實驗組的細胞吞吐量有限，因為目前的模型僅使用了1個100 μm寬的微流單通道，所以并沒有充分利用有源傳感器FOV?？梢酝ㄟ^使用多個并行通道與更大FOV的傳感器進行改進。此外，采用較高的幀速率傳感器可以增加系統(tǒng)的最大允許流速，有助于提高吞吐量。

表2 無透鏡微流控成像系統(tǒng)計數(shù)結果

*錯誤率=(自動計數(shù)-人工計數(shù))/人工計數(shù)

4 結束語

將CMOS圖像傳感器與微流控芯片結合，實時無透鏡微流控成像系統(tǒng)可用于自動流動細胞檢測和計數(shù)。通過采用基于時域差分的運動檢測方法，可以有效地檢測和計數(shù)流動細胞，并具有-6.53 %的低統(tǒng)計錯誤率。與其它用于計數(shù)顯微鏡載玻片之間靜態(tài)細胞的無透鏡成像系統(tǒng)不同，該系統(tǒng)主要對連續(xù)流動環(huán)境中的細胞進行檢測和計數(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)實時、自動化及便攜即時的生物醫(yī)學診斷。下一步工作主要是通過使用多個并行通道和更高幀速率CMOS圖像傳感器來提高吞吐量。

[1] June W,Han J,Choi J W,et al.Point-of-care testing(POCT)diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologie-s[J].Microelectronic Engineering,2015,132(25):46-57.

[2] Hassan U,Watkins N,Reddy B,et al.Microfluidic differential immunocapture biochip for specific leukocyte counting[J].Nature Protocols,2016,11(4):714-726.

[3] Berry S B,Fernandes S C,Rajaratnam A,et al.Measurement of the hematocrit using paper-based microfluidic devices[J].Lab on a Chip,2016,16(19):3689-3694.

[4] Derda R,Gitaka J,Klapperich C M,et al.Enabling the development and deployment of next generation point-of-care diagnostic-s[J].PLOS Neglected Tropical Diseases,2015,9(5):e0003676.

[5] Wang S,Lifson M A,Inci F,et al.Advances in addressing technical challenges of point-of-care diagnostics in resource-limited settings[J].Expert Review of Molecular Diagnostics,2016,16(4):449-459.

[6] Guo J,Huang X,Ai Y.On-demand lensless single cell imaging activated by differential resistive pulse sensing[J].Analytical Chemistry,2015,87(13):6516-6519.

[7] Mayer K H,Krakower D S.Antiretrovirals for HIV treatment and prevention:The challenges of success[J].Journal of the American Medical Association,2016,316(2):151-153.

[8] Guo J,Liu X,Kang K,et al.A compact optofluidic cytometer for detection and enumeration of tumor cells[J].Journal of Lightwave Technology,2015,33(16):3433-3438.

[9] Huang X,Jiang Y,Liu X,et al.Machine learning based single-frame super-resolution processing for lensless blood cell coun-ting[J].Sensors,16(11):1836.

[10] Chen Y,Nawaz A A,Zhao Y,et al.Standing surface acoustic wave(SSAW)-based microfluidic cytometer[J].Lab on a Chip,2014,14(5):916-923.

[11] 叢玉隆,黃柏興,霍子凌.《臨床檢驗裝備大全》儀器與設備卷[M].北京:科學出版社,2015:74-96.

[12] Huang X,Guo J,Yan M,et al.A contact-imaging based microfluidic cytometer with machine-learning for single-frame super-resolution processing[J].PLOS ONE,2014,9:e104539.

[13] Huang X,Yu H,Liu X,et al.A dual-mode large-arrayed CMOS ISFET sensor for accurate and high-throughput pH sensing in biomedical diagnosis[J].IEEE Transactions on Biomedical Engineering,2015,62:2224-2233.

[14] Aydogan O,Euan M.Lensless imaging and sensing[J].Annual Review of Biomedical Engineering,2016,18:77-102.

[15] Ji H,Sander D,Haas A,et al.Contact imaging: Simulation and experiment[J].IEEE Transactions on Circuits and Systems-I Regular Papers,2007,54:1698-1710.

[16] Lipton A J,Fujiyoshi H,Patil R S.Moving target classification and tracking from real-time video[C]∥Proceedings of the Fourth IEEE Workshop on Applications of Computer Vision,1998:8-14.

[17] Piccardi M.Background subtraction techniques:A review[C]∥Proceedings of IEEE International Conference on Systems,Man and Cybernetics,2004:3099-3104.

Lensless microfluidic imaging based cell detection and counting system*

HUANG Xi-wei, CHENG Tao, DING Cheng-xiang, WANG Xiang, GAO Hai-jun, SU Jiang-tao

(Key Laboratory of RF Circuits and Systems,Ministry of Education,Hangzhou Dianzi University,Hangzhou 310018,China)

The existing cell detection and counting systems such as flow cytometer and haemocytometer are not designed towards real-time for cells in flowing microfluid.Based on the integration of a CMOS image sensor and a microfluidic chip,a lensless microfluidic imaging system for detection and counting of flowing cells is presented.Different from the other lensless microfluidic imaging systems designed for counting static cells,the developed system can detect and count continuously flowing cells in microfluidic channel by temporal-differencing based motion detection algorithms.Measured experiment results show that human bone marrow stromal cells flowing in the microfluidic channel can be automatically detected and counted with low statistical error rate of -6.53 %.The developed system thereby provides cell detection and counting solutions for point-of-care applications.

CMOS image sensor; microfluidics; lensless imaging; cell detection and counting

10.13873/J.1000—9787(2017)05—0094—05

2017—03—28

國家自然科學基金資助項目(61501156，61372021)；浙江省公益性技術應用研究計劃項目(2017C31064)；浙江省自然科學基金資助項目(LQ15F010005，LY17F010016)

TP 30

A

1000—9787(2017)05—0094—05

黃汐威(1987-)，男，博士研究生，副研究員，主要研究方向為CMOS傳感器與片上實驗室系統(tǒng)。

王 翔(1984-)，男，通訊作者，博士研究生，講師，主要研究方向為集成電路設計研究工作，E—mail:wangxiang@hdu.edu.cn。