王 宇 江 黎 （上海町碩花卉有限公司，上海市浦東新區(qū) 201302）

朱頂紅花梗與子房組織培養(yǎng)技術(shù)研究

王 宇 江 黎 （上海町碩花卉有限公司，上海市浦東新區(qū) 201302）

為探索適合朱頂紅組織培養(yǎng)的方法，從而為朱頂紅工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)，以朱頂紅花梗和子房為外植體，探究了不同培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響、不同激素配比對不定芽誘導(dǎo)的影響、不同激素配比對試管苗繼代增殖的影響、不同基質(zhì)對組培苗成活的影響。結(jié)果表明，朱頂紅花梗最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為1/2 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 g/L AC，子房最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為1/2 MS+4.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 g/L AC。繼代增殖培養(yǎng)基配方為1/2 MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+2.0～4.0 mg/L PP333+0.5 g/L AC。移栽基質(zhì)為純沙∶田園土=1∶1。

朱頂紅；花梗；子房；組織培養(yǎng)；技術(shù)研究

朱頂紅別名朱頂蘭、孤挺花、華胄蘭、百子蓮，為單子葉亞綱石蒜科朱頂紅屬多年生具鱗莖的觀賞植物。雜種朱頂紅花大色艷、高貴美觀，具有極高的觀賞價值；再加上朱頂紅商品球容易運輸、栽培相對簡單，隨著網(wǎng)絡(luò)購物的發(fā)展，成為了網(wǎng)絡(luò)園藝店主的首推品種，雜交朱頂紅商品種球的需求也越來越大[1]。

目前，國產(chǎn)的朱頂紅種球數(shù)量極少且質(zhì)量較差，生產(chǎn)中多依賴于進(jìn)口，價格昂貴；同時，朱頂紅鱗莖的自然繁殖率較低，多數(shù)雜交品種不產(chǎn)子球。因此，建立優(yōu)質(zhì)高效的朱頂紅種球繁殖技術(shù)體系是提高其種球數(shù)量和質(zhì)量的關(guān)鍵。近年來，國內(nèi)外已廣泛采用鱗莖扦插和刻傷法進(jìn)行朱頂紅繁殖，但鱗莖扦插和刻傷法操作程序繁瑣、成本高、生根率低、扦插苗長勢弱、成苗率低。組織培養(yǎng)技術(shù)是目前植物快繁的有效方法之一，具有繁殖系數(shù)高、成苗時間短和便于商品化和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢。

目前，雖然國內(nèi)外關(guān)于朱頂紅組織培養(yǎng)的研究一直不斷，且在用朱頂紅鱗莖盤和雙鱗片誘導(dǎo)不定芽等方面取得了良好的效果，但使用鱗莖為外植體代價太大、污染嚴(yán)重、死亡率和褐化率較高[2、3]，對比傳統(tǒng)的鱗莖扦插沒有太大優(yōu)勢[4]。除鱗莖盤和雙鱗片外，也有關(guān)于用朱頂紅花梗和子房作外植體誘導(dǎo)植株成功的報道研究，但均未成系統(tǒng)、再現(xiàn)性差[5-7]。為此，本試驗在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，以朱頂紅花梗和子房為外植體，探究了不同培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響、不同激素配比對不定芽誘導(dǎo)的影響、不同激素配比對試管苗繼代增殖的影響、不同基質(zhì)對組培苗成活的影響，以期系統(tǒng)地探索適合朱頂紅組織培養(yǎng)的方法，旨在通過組織培養(yǎng)提高朱頂紅的繁殖速度，為朱頂紅工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與地點

本試驗所用材料為荷蘭朱頂紅雜交品種“花孔雀”。試驗設(shè)在上海町碩花卉有限公司園藝場進(jìn)行。

1.2 試驗設(shè)計

從朱頂紅母株上采集未開放的花蕾，放入燒杯中用自來水沖洗10 min，然后在超凈工作臺上，把材料放入75%酒精中消毒30 s，再用0.1%HgCl2處理8 min，然后用無菌水沖洗5次。用無菌刀將花蕾剝開，將花序分開，把花梗和子房分別切成1 mm左右切片（以1朵花序平均具4朵花計算，大概可切得100～120片），用鑷子將切片平鋪在培養(yǎng)基上，每瓶接種5片。

1.2.1 不同處理對朱頂紅外植體褐變的抑制效果

組培過程中外植體褐變現(xiàn)象嚴(yán)重，為抑制褐變程度，在采取不定芽誘導(dǎo)的同時，結(jié)合暗培養(yǎng)48 h，在培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的Vc與活性炭（AC），以不添加作對照，觀察外植體褐變情況與生長狀態(tài)，Vc濃度分別為0.2、0.5、1.0 g/L；活性炭濃度分別為0.2、0.5、1.0 g/L。每個培養(yǎng)基配方中均添加瓊脂粉5.2 g/L、蔗糖30 g/L，pH為5.8～6.0。每個處理接種10瓶，每處理重復(fù)3次。

1.2.2 不同培養(yǎng)基對朱頂紅花梗、子房誘導(dǎo)不定芽的影響

誘導(dǎo)不定芽試驗采用的3種基本培養(yǎng)基分別為MS、1/2 MS、B5，NAA設(shè)0.1、0.5、1.0 mg/L三個水平，6-BA設(shè)0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L四個水平。每個培養(yǎng)基配方中均添加瓊脂粉 5.2 g/L、蔗糖 30 g/L、活性炭0.5 g/ L，pH為5.8～6.0。培養(yǎng)溫度24 ℃，先暗培養(yǎng)48 h，再進(jìn)行光照培養(yǎng)（光照時間為16 h/d，光照強度為1500 Lx）。每個處理接種10瓶，每處理重復(fù)3次。

1.2.3 不同激素配比對朱頂紅繼代增殖培養(yǎng)的影響

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，研究不同濃度6-BA、NAA、多效唑（PP333）對朱頂紅繼代增殖培養(yǎng)的影響。NAA設(shè)0.1、0.2、0.5 mg/L三個水平，6-BA設(shè)1.0、2.0、4.0 mg/L三個水平，PP333設(shè)1.0、2.0、4.0、6.0 mg/L四個水平。每個培養(yǎng)基配方中均添加蔗糖45 g/L、瓊脂粉5.2 g/L，pH為5.8～6.0。

1.2.4 不同基質(zhì)對朱頂紅移栽的影響

選擇繼代增殖獲得的朱頂紅生根苗移到大棚，開蓋煉苗3 d，然后取出洗凈根部培養(yǎng)基，浸入多菌靈1000倍液中消毒3 mim，稍晾干，移栽至3種基質(zhì)中（純沙，蛭石，純沙∶田園土=1∶1）。保證苗床溫度在22～28 ℃，適當(dāng)遮陰，光強強度為10000 Lx，每2 d澆水1次。4周后觀察朱頂紅幼苗生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對朱頂紅外植體褐變的抑制效果

據(jù)觀察，朱頂紅花梗和子房在接種1 d后，培養(yǎng)基上部的外植體表層會出現(xiàn)輕微的褐化現(xiàn)象，顏色呈淺黃色，而與培養(yǎng)基接觸的部位未變色；到第3天，鱗莖盤外層褐化加重，與培養(yǎng)基接觸的部位也出現(xiàn)輕微褐色。由表1可知，朱頂紅外植體褐變現(xiàn)象嚴(yán)重，在不添加附加物的條件下，褐變死亡率達(dá)64.2%。添加不同濃度的Vc與AC，對外植體褐變均有一定的抑制效果，其中添加1.0 g/L Vc和1.0 g/L AC處理的褐變死亡率明顯低于對照，分別為16.3%和0，添加1.0 g/L AC處理的褐變死亡率雖為最低，但外植體生長狀態(tài)較對照緩慢，誘導(dǎo)率明顯降低；而Vc控制褐化效果不佳，且容易導(dǎo)致愈傷組織玻璃化，降低誘導(dǎo)率。因此，以在培養(yǎng)基中加入0.5 g/L AC為宜，可取得理想的褐變抑制效果。

表1 不同處理對朱頂紅外植體褐變的抑制效果

2.2 不同培養(yǎng)基配方對朱頂紅花梗、子房誘導(dǎo)不定芽的影響

朱頂紅花梗和子房在接種1周后，有的外植體開始膨大、變綠，到第3周時，有的外植體變褐死亡，有的開始出現(xiàn)玻璃化，有的繼續(xù)膨大形成綠色突狀物，到第5周時，部分外植體開始長出根或不定芽，于第8周統(tǒng)計各處理的不定芽誘導(dǎo)率、平均不定芽數(shù)量。

2.2.1 對花梗誘導(dǎo)不定芽的影響

由表2可知，以花梗為外植體，在基本培養(yǎng)基1/2 MS中，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)48.1%、不定芽數(shù)量為4.1個，明顯高于在MS和B5培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)基配方對朱頂紅花梗誘導(dǎo)不定芽的影響

由表3可知，在NAA濃度一定時，隨著6-BA濃度的增大，平均不定芽增殖數(shù)量增大。以0.5 mg/L NAA、4.0 mg/L 6-BA時不定芽增殖數(shù)量最大，達(dá)7.2個，但此處理不定芽誘導(dǎo)率不是最高。以0.5 mg/L NAA、2.0 mg/L 6-BA時不定芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)84.3%，表明6-BA繼續(xù)增加濃度會導(dǎo)致不定芽誘導(dǎo)率下降。當(dāng)NAA濃度為1.0 mg/ L時，不定芽誘導(dǎo)率、不定芽增殖數(shù)量均很低。綜合考慮，最佳組合為2.0 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA。

表3 不同激素配比對朱頂紅花梗誘導(dǎo)不定芽的影響

2.2.2 對子房誘導(dǎo)不定芽的影響

由表4可知，以子房為外植體，在基本培養(yǎng)基1/2 MS中，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)52.6%、不定芽數(shù)量為6.4個，明顯高于MS和B5培養(yǎng)基。

表4 不同培養(yǎng)基配方對朱頂紅子房誘導(dǎo)不定芽的影響

由表5可知，在NAA濃度為0.5 mg/L時，隨著6-BA濃度的增大，平均不定芽誘導(dǎo)率增大，于6-BA濃度為4.0 mg/L時，達(dá)到最高值（86.2%），此時不定芽數(shù)量也較大（8.2個），均高于NAA濃度為0.1、1.0 mg/L的處理。因此，最佳組合為4.0 mg/L 6-BA與0.5 mg/L NAA。

表5 不同激素配比對朱頂紅子房誘導(dǎo)不定芽的影響

2.3 不同激素配比對朱頂紅繼代增殖培養(yǎng)的影響

2.3.1 6-BA、NAA不同濃度配比對朱頂紅繼代增殖培養(yǎng)的影響

通過初代培養(yǎng)，從花梗和子房外植體誘導(dǎo)出的朱頂紅小鱗莖需要進(jìn)一步切割進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，以獲得更多無菌植株。將小鱗莖對半切成0.5 cm2大小的方塊，接種到6-BA、NAA不同濃度配比的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計結(jié)果（見表6）。在NAA濃度一定時，隨著6-BA濃度的增加，增殖系數(shù)明顯增加，均以6-BA濃度為4.0 mg/L時達(dá)最佳。NAA濃度為0.1 mg/L、0.2 mg/L間增殖系數(shù)差異不明顯，而NAA濃度為0.5 mg/L時，增殖系數(shù)急劇下降，這是因為小鱗莖長了很多愈傷組織，抑制了小鱗莖的產(chǎn)生。

表6 不同濃度6-BA、NAA配比對朱頂紅繼代增殖培養(yǎng)的影響

2.3.2 不同濃度PP333對朱頂紅繼代增殖培養(yǎng)的影響

薛寒青在百合組培試驗中得出，PP333能改變同化物的分配，將同化物運輸?shù)秸谏L的球莖上，促進(jìn)百合球莖或鱗莖的形成與生長[8，9]。由表7可知，PP333對朱頂紅的鱗莖生長有明顯促進(jìn)作用，對朱頂紅鱗莖的分化與形成也有一定促進(jìn)作用。其中處理（2）、（3）相比對照，鱗莖直徑和增殖系數(shù)均明顯增加，但當(dāng)PP333濃度超過4.0 mg/L時，鱗莖直徑和增殖系數(shù)明顯下降，根系變短且少，表明過大濃度的PP333會抑制葉片和根的生長，從而對鱗莖的形成和生長產(chǎn)生抑制作用。因此，PP333最適濃度為2.0～4.0 mg/L。

表7 不同濃度PP333對朱頂紅繼代增殖培養(yǎng)的影響

2.4 不同基質(zhì)對朱頂紅移栽的影響

朱頂紅生根苗移栽至3種基質(zhì)中，據(jù)4周后觀察結(jié)果（見表8），朱頂紅生根苗在純沙中成活率最低，但也達(dá)87.3%，表明朱頂紅移栽成活較容易；在純沙與田園土混合基質(zhì)中，朱頂紅生根苗生長情況最好，生長量最大，葉片長度達(dá)12.2 cm、鱗莖直徑達(dá)19.2 mm。分析其原因是純砂透水性好，但保濕性差，干燥后結(jié)構(gòu)緊實，會對根部造成擠壓，使根系不容易往下伸展，而田園土與純沙混和，則能有效利用田園土中的養(yǎng)分，同時拌合了純沙，能提高基質(zhì)的透水性，更有利于植株的旺盛生長。蛭石透水性、保水性適中，但本身不含營養(yǎng)，只能維持植株的一般性生長。

表8 不同基質(zhì)對朱頂紅移栽的影響

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，采用未開放的朱頂紅花序作外植體進(jìn)行消毒，因為其外層有未展開的花瓣包裹，消毒后污染率接近0。與其它部位外植體相比，花器官不需要破壞種球，且子房和花梗平均可切得100～120片外植體，而1個直徑20 cm的種球最多只能切得60片左右雙鱗片或鱗莖盤外植體[3]。因此，利用子房和花梗作外植體成本優(yōu)勢明顯。對于外植體褐化的抑制效果，王培軍[10]在外植體接種5 d后，取出刮去外層褐色部分，轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基里，每5 d轉(zhuǎn)接1次，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，可基本控制褐變。而本文通過暗培養(yǎng)48 h與添加0.5 g/L的活性炭也能有效控制外植體褐化現(xiàn)象，但Vc的褐化抑制效果不明顯，且易導(dǎo)致外植體玻璃化，這與李萍等[11]人對牡丹使用防褐劑的研究一致。同時，在繼代增殖培養(yǎng)中，采用0.5 g/L活性炭能在抑制褐變的同時，有利于根系的生長，省去了生根的環(huán)節(jié)。朱頂紅生根苗的移栽只要保證適宜的溫度（22～28 ℃）、避免過強的光照（光照強度≤10000 Lx）和定期澆水，無論在純沙、蛭石還是純沙與田園土混合基質(zhì)中，成活率都較高，其中以純沙與田園土比例為1∶1混合的基質(zhì)最有利于生長。

綜合考慮，得出結(jié)論如下：朱頂紅花梗最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為1/2MS+2.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 g/L AC，子房最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為1/2MS+4.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 g/LAC。繼代增殖培養(yǎng)基配方為1/2MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+2.0～4.0 mg/ L PP333+0.5 g/L AC。移栽基質(zhì)為純沙∶田園土=1∶1。

[1] 馬媛媛,吳沙沙,焦雪輝,等.朱頂紅的栽培與應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)工程技術(shù)·溫室園藝,2010(8)：55-61.

[2] 婁曉鳴,周玉珍,孔賢,等.雜交朱頂紅鱗莖不定芽誘導(dǎo)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(34)：16769-16770.

[3] 原雅玲,張延龍,趙錦麗,等.朱頂紅鱗莖切塊的繁殖方法[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2008,36(9)：108-112.

[4] 王賢,熊敏,衛(wèi)尊征,等.朱頂紅研究綜述[J].農(nóng)業(yè)科技與信息：現(xiàn)代園林,2014(8)：49-54.

[5] EN O'Rourke, WM Fountain, S Sharghi.Propagation of Hippeastrum from floral tissues by invitroculture[J].Herbertia, 1991,47(1/2）：51-52.

[6] 原雅玲,張亞玲.朱頂紅組織培養(yǎng)最佳繁殖途徑的研究[C]//中國園藝學(xué)會觀賞園藝專業(yè)委員會年會.2006：628-636.

[7] 姜明蘭,鐘文田.朱頂紅愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生[J].植物生理學(xué)報,1984(1)：37-40.

[8] 薛寒青.PP333在百合組織培養(yǎng)中的作用[J].河北林業(yè)科技, 2007(3)：25-26.

[9] 劉冬云,史寶勝,李銀華,等.不同碳源及PP(333)、GA3對山丹組培苗鱗莖增大的影響[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2005,28(2)：32-35.

[10] 王培軍.不同培養(yǎng)基對朱頂紅愈傷組織誘導(dǎo)影響的研究[J].科技創(chuàng)新與生產(chǎn)力,2005(S2)：45-47.

[11] 李萍,成仿云,張穎星.防褐劑對牡丹組培褐化發(fā)生、組培苗生長和增殖的作用[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,30(2)：71-76.

2016-12-22

上海市科委星火富民項目《大花朱頂紅種球國產(chǎn)化繁育與推廣》（編號：153919178000）。