陳星，丁永利，李現林，趙明明

（河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

川芎嗪對急性脊髓損傷大鼠模型GFAP、cPLA2表達的影響

陳星，丁永利，李現林，趙明明

（河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

目的 研究川芎嗪對SD大鼠急性脊髓損傷模型的保護作用及其對損傷段脊髓膠質纖維酸蛋白（GFAP）及胞漿型磷脂酶A2（cPLA2）表達的影響。方法SD大鼠87只，隨機分成假手術組（n=9）、生理鹽水組（n=39）、川芎嗪組（n=39）。其中，假手術組行椎板切除術，生理鹽水組及川芎嗪組采用改良Allen打擊法復制大鼠急性脊髓損傷模型，以BBB（Basso，Beattie，Bresnahan）評分評價各組大鼠脊髓功能；術后川芎嗪組按200mg/kg注射川芎嗪，假手術組、生理鹽水組注射等量生理鹽水，并于術后1、3、7、14和21 d處死部分大鼠獲取脊髓損傷標本，采用免疫組織化學比較GFAP、cPLA2表達情況，采用蘇木精-伊紅染色法（HE）染色觀察組織受損情況，并對GFAP、cPLA2進行相關性分析。結果術后第7天起，川芎嗪組BBB評分均高于生理鹽水組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；術后各時間段川芎嗪組GFAP及cPLA2表達陽性面積均低于生理鹽水組，差異具有統(tǒng)計學意義，且GFAP與cPLA2表達陽性面積呈正相關（r=0.826，P=0.043），而從HE染色可知，脊髓損傷21 d，生理鹽水組已經出現膠質瘢痕，川芎嗪組僅為缺血性改變。結論川芎嗪可通過下調GFAP、cPLA2表達，并對急性脊髓損傷起到一定保護作用。

川芎嗪；急性脊髓損傷；膠質纖維酸蛋白；組織胞漿型磷脂酶A2

長久以來，促進中樞神經損傷后的神經再生一直是治療脊髓繼發(fā)性損傷的主要方向，膠質瘢痕的形成作為阻礙神經再生的重要因素，對于其發(fā)生機制的研究也獲得了一定成果[1]。如星形膠質細胞（Astrocyte，AS）的增殖及肥大即是引起膠質瘢痕形成的因素之一[2]。川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）是中藥川芎中提取有活性單體，有研究指出川芎嗪具有抗缺血、改善微循環(huán)等作用，可應用于脊髓損傷治療[3]，但人們對于其具體作用機制尚不清楚。而膠質纖維酸蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）作為AS骨架蛋白，研究其表達量變化，有助于更好地了解川芎嗪的作用機制。此外，有研究指出[4]，炎癥反應中關鍵酶胞漿型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2，cPLA2)可通過水解包膜磷脂酸來釋放花生四烯酸，進而促進炎癥級聯反應的發(fā)生，而炎癥反應、缺血、缺氧等因素本身即可促進脊髓損傷的加劇發(fā)生。因此，本文通過復制大鼠急性脊髓損傷模型，通過監(jiān)測給藥后不同時間點各組GFAP及cPLA2表達水平差異，從而更好地了解川芎嗪在治療脊髓損傷中的臨床機制。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器及試劑

鹽酸川芎嗪氯化鈉注射液購自珠海聯邦制藥股份有限公司中山分公司，GFAP、cPLA2兔抗鼠多克隆抗體、生物素標記羊抗兔二抗購自英國Abcam公司，鏈霉親和素-生物素復合物試劑盒購自武漢博士德公司，其余所用常規(guī)試劑均購自廣州鼎國生物技術有限公司。

1.2 模型復制及分組

將87只SD大鼠隨機分成假手術組（n=9）、生理鹽水組（n=39）和川芎嗪組（n=39）。其中，生理鹽水組及川芎嗪組模型依照改良Allen重物打擊法[5]復制大鼠脊髓損傷模型，方法如下：按30mg/kg劑量腹腔注射3%戊巴比妥鈉，待大鼠麻痹后，固定于手術操作臺，提起背部毛發(fā)消毒后，從T10棘突處切出約2～3 cm切口，剝離椎盤肌肉，暴露棘突及椎板，將長×寬×厚為3mm×2mm×1mm塑料墊片彎曲至符合大鼠背側脊髓屈曲度，并將此放置在T10處，以自制打擊裝置，采用7 g打擊棒從4 cm處以自由落體的方式撞擊墊片，并對脊髓造成損傷，以大鼠出現尾部痙攣擺動、下肢及軀體回縮為復制模型成功，隨后按順序逐層縫合、消毒。假手術組僅進行椎板切除術且不對脊髓造成損傷，隨后縫合傷口。為預防大鼠感染，術后常規(guī)大腿內側肌注4萬u青霉素，連續(xù)給藥3 d。

按照以上分組，川芎嗪組術后30 min即按200mg/kg注射川芎嗪，假手術組及生理鹽水組則注射等量生理鹽水，隨后每天給藥1次，持續(xù)5 d。

1.3 評估標準

1.3.1 行為學評分 按照BBB（Basso-Beattie-Bresnahan）行為學評分標準，即從后肢關節(jié)活動情況、運動協同情況及承重情況等，對術后1、3、7、14和21 d處死大鼠進行評分[6]?？偡?1分，分值越高，提示大鼠行為能力越正常。本評分由2名非本實驗參與人員進行獨立評分后，所得平均值為大鼠最終BBB評分結果。

1.3.2 GFAP、cPLA2免疫組織化學實驗 分別于術后1、3、7、14和21 d取處死后大鼠的脊髓損傷中心組織，經切片脫蠟水化處理后，以3%過氧化氫H2O2孵育10min，羊血清封閉20min后，加入1∶100兔抗鼠GFAP多抗或1∶200兔抗鼠cPLA2，4℃過夜。磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3次，加入生物素二抗，室溫孵育20min，PBS洗滌，二氨基聯苯胺顯色，PBS沖洗終止顯色反應、蘇木素復染、二甲苯透明、中性樹膠封片。隨機采用Motic image Advanced軟件對以上切片進行分析，其方法為選取5個在×200下不重疊區(qū)域，將呈棕黃色細胞作為陽性細胞，計算總的陽性染色面積。

1.3.3 蘇木精 -伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色 采取標本，脫水、透明、包埋，切成厚度為5μm石蠟切片，隨后按照HE染色步驟，依次放入二甲苯及不同濃度乙醇中，并經PBS漂洗，加入蘇木精染色，自來水清洗、鹽酸乙醇分化、再次清洗后使用伊紅染色，清洗，經不同濃度乙醇處理至無水乙醇中，二甲苯透明，樹脂封片，并在尼康顯微鏡下觀察，采集圖片。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數資料采用χ2檢驗，計量資料以均數±標準差（±s）表示，進行成組t檢驗、重復測量方差分析或LSD-t檢驗，并采用Pearson相關性分析GFAP、cPLA2的相關性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BBB評分結果

術后，生理鹽水組及川芎嗪組大鼠均出現脊髓休克現象，表現為雙后肢功能喪失，無肌力，并以俯臥行走、尿潴留。但隨著術后恢復時間增加，脊髓休克現象有所緩解。以BBB評分可知，川芎嗪組大鼠恢復速度快于生理鹽水組，從術后7 d起，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 cPLA2表達情況

術后1 d，生理鹽水組及川芎嗪組的cPLA2陽性面積同樣均高于假手術組（185.4±14.3）μm2，且差異具有統(tǒng)計學意義（t生理鹽水組vs假手術組=4.353，P＜0.05；t川芎嗪組vs假手術組=3.952，P＜0.05），且隨著治療時間的延長，生理鹽水組cPLA2陽性面積逐漸增大，而川芎嗪組cPLA2陽性面積則逐漸減?。‵組別=5.535，P＜0.05；F時間點=4.453，P＜0.05；F組別*時間點=3.745，P＜0.05），且在同一檢測時點，兩組間差異均有統(tǒng)計學意義。見圖1、表2。

2.3 GFAP表達情況

術后第1天，生理鹽水組及川芎嗪組的GFAP陽性面積均高于假手術組（249.8±9.8）μm2，且差異具有統(tǒng)計學意義（t生理鹽水組vs假手術組=3.743，P＜0.05；t川芎嗪組vs假手術組=3.321，P＜0.05），而隨著治療時間的延長，生理鹽水組GFAP陽性面積逐漸增大，而川芎嗪組GFAP陽性面積則逐漸減小（F組別=4.976，P＜0.05；F時間點=4.134，P＜0.05；F組別*時間點=3.663，P＜0.05），且在同一檢測時點，兩組間差異均有統(tǒng)計學意義。見圖2、表3。

表1 兩組術后不同時間點BBB評分比較 （n=39，分，±s）

表1 兩組術后不同時間點BBB評分比較 （n=39，分，±s）

21 d生理鹽水組 1.7±0.7 3.1±0.8 5.9±1.0 8.7±0.9 9.9±1.5川芎嗪組 2.0±0.6 4.7±0.5 8.9±0.4 13.7±0.4 16.4±0.5t值 3.242 4.342 6.464 8.542 10.443P值 0.894 0.435 0.046 0.025 0.008組別1 d 3 d 7 d 14 d

圖1 兩組不同時間點cPLA2表達 （×400）

表2 兩組不同時間點cPLA2表達陽性面積比較 （n=39，μm2，±s）

表2 兩組不同時間點cPLA2表達陽性面積比較 （n=39，μm2，±s）

21 d生理鹽水組 210.4±20.3 233.7±19.8 259.8±19.8 389.7±20.6 364.1±18.9川芎嗪組 194.8±19.4 214.7±20.5 236.7±19.3 240.9±18.6 246.5±19.5t值 3.053 4.531 4.684 8.244 10.443P值 0.093 0.049 0.046 0.033 0.009組別1 d 3 d 7 d 14 d

圖2 兩組不同時間點GFAP表達 （×400）

表3 兩組不同時間點GFAP表達陽性面積比較 （n=39，μm2，±s）

表3 兩組不同時間點GFAP表達陽性面積比較 （n=39，μm2，±s）

21 d生理鹽水組 362.8±13.8 375.2±15.9 384.2±18.4 496.2±23.8 464.2±27.5川芎嗪組 345.7±11.3 323.4±11.1 302.8±10.7 344.8±10.4 359.7±9.5t值 3.645 4.642 5.332 6.564 9.963P值 0.062 0.045 0.044 0.042 0.014組別1 d 3 d 7 d 14 d

2.4 GFAP、cPLA2相關性分析

對川芎嗪組及生理鹽水組GFAP及cPLA2表達陽性面積進行相關性分析，結果顯示，GFAP及cPLA2在整個治療周期中呈正相關，相關系數r=0.826，P=0.043。見圖3。

2.5 HE染色結果

對術后21 d假手術組、生理鹽水組、川芎嗪組進行HE染色。其中圖4A為假手術組，其脊髓組織可見清晰灰白質界限，灰質內神經細胞體大，核仁豐富，可見尼氏小體；圖4B為生理鹽水組，可見損傷區(qū)域已經塌陷且重建基本完成，可見片膠質瘢痕；圖4C為川芎嗪組，其灰質內可見部分出血，紅細胞堆積現象，但未見明顯膠質瘢痕生成。

圖3 GFAP、cPLA2相關性分析

圖4 3組損傷區(qū)脊髓組織染色結果 （HE染色×400）

3 討論

臨床上，大致可將急性脊髓損傷分為急性創(chuàng)傷期、繼發(fā)損傷期和慢性損傷期3個時期[5]。而當脊髓損傷患者送至醫(yī)院時，多數原創(chuàng)損傷已不可逆轉，因此，治療上也以繼發(fā)損傷期及慢性損傷期為主。而研究表明[7]，多數因脊髓損傷致殘的主要原因在于繼發(fā)損傷期未得到及時、有效地治療，以至于損傷擴大，加重脊髓神經功能受損。此外，繼發(fā)性損傷期牽涉因素較多，致損機制繁多且相互影響，也給目前治療方案增大了難度。而當病程進入慢性損傷期，此時，神經系統(tǒng)的再生則對于扭轉脊髓損傷，改善脊髓功能具有重要意義。然而，由于神經組織損傷不可逆行，使得目前對于誘發(fā)神經再生未能取得實時性成果，但是，有一點筆者可以確認，即脊髓組織的修復及功能恢復必須依賴良好的血液微環(huán)境為受損血管及組織提供營養(yǎng)[8]。TMP正好具有此類功能，TMP是川芎根莖提取的一種生物活性單體，因其具有擴張血管、抑制血小板聚集、拮抗Ca2+內流、消除氧氣自由基等作用已被廣泛應用于心血管及神經內科治療。但是，對于其在急性脊髓損傷中的保護作用機制仍不明確，因此，仍有必要從分子水平分析TMP在脊髓損傷中的保護機制。

本研究通過改良Allen重物打擊法復制大鼠急性脊髓損傷模型，以假手術組作為模型復制對照組，并以BBB評價模型復制情況，從而保證了后期實驗的真實性。而通過免疫組織化學結果可知，隨著術后時間的延遲，生理鹽水組及川芎嗪組cPLA2陽性產物均呈現上升趨勢，但后者上升趨勢較為緩慢。由于cPLA2主要介導炎癥反應及氧化應激反應，屬于急性期反應蛋白，兩組在術后第1天，表達cPLA2陽性產物均高于假手術組。隨后兩組cPLA2表達陽性率差異逐漸明顯。由于炎癥因子釋放多為旁分泌或自分泌，即大量炎癥因子可導致炎癥細胞進一步釋放炎癥因子[9]。生理鹽水組因自身短期內炎癥因子釋放增加而得不到有效抑制，以至于cPLA2表達陽性細胞在術后14 d增加迅猛；而川芎嗪組，由于TMP可降低前列腺素合成，并抑制淋巴細胞、中性粒細胞等釋放腫瘤壞死因子-α及白細胞介素-1β等炎癥因子，從而減輕了炎癥反應；此外cPLA2具有明顯Ca2+依賴性，而TMP其作用之一即是拮抗Ca2+內流[10]。另外，TMP還具有改善缺血部位血流速度，減少血管外周阻力，從而改善局部血液微循環(huán)，而這也有利于減少白細胞浸潤，避免組織受到反復刺激產生炎癥因子[11]。

對GFAP，其與cPLA2呈正相關。在AS增殖早期，其能分泌如bFGF等促神經生長因子來減少脊髓損傷，因此，早期cPLA2高表達時，往往也可出現GFAP表達增高，但是當AS細胞過度增殖乃至形變后，其將形成膠質瘢痕，從而成為阻礙脊髓修復的物理及化學屏障，以至于一旦膠質瘢痕形成，脊髓功能修復往往效果較差[12]。而從本研究看，生理鹽水組隨著術后時間延長，GFAP表達增加，但在術后21 d，其表達陽性面積反而有所下降；川芎嗪組則GFAP表達則一直緩慢增加，并在SCI后14 d及21 d無明顯差別。由于GFAP是AS細胞骨架中起支承功能的結構蛋白，其大量表達，可以說明AS細胞不僅增殖還可能出現了腫脹和形變。而生理鹽水組在術后21 d出現了GFAP表達陽性面積下調，其很有可能是部分AS細胞已經出現凋亡，并形成膠質瘢痕。而川芎嗪組GFAP表達量則維持較小增幅，并未出現表達陽性面積突增或下調。因此筆者認為AS大多是出現增殖現象。而通過HE染色更直觀的證實了以上觀點。生理鹽水組細胞呈現增多，密集且形態(tài)不規(guī)則，而川芎嗪組雖然AS細胞也有所增加，但仍可見清晰完整的膠質細胞結構。

綜上所述，cPLA2與GFAP在表達量具有一定的相關性，而川芎嗪又可以作用cPLA2，從而對急性脊髓損傷起到一定治療效果。

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（張蕾 編輯）

Effect of Ligustrazine on GFAP and cPLA2 expressions in ratmodel of acute spinal cord injury

Xing Chen，Yong-liDing,Xian-lin Li,Ming-ming Zhao
(The First Affiliated Hospital,Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou,Henan 450000,China)

ObjectiveTo investigate the effects of Ligustrazine(Tetramethylpyrazine,TMP)on acute spinal cord injury in SD ratmodel and the expressions of glial fibrillary acidic protein(GAFP)and cytosolic phospholipase A2 (cPLA2)in the injuried spinal cord.MethodsEighty-seven SD ratswere randomly divided into sham group(n=9), saline group(n=39)and TMP group (n=39).The sham group underwent laminectomy,while in the saline group and the TMP group modified Allen's combat was used to make ratmodel of acute spinal cord injury.BBB(Basso, Beattie,Bresnahan)scores were applied to evaluate the spinal cord function of the rats.After operation,the TMP group was treated with TMP injection by 200 mg/kg,and the sham group and the saline group were injected with equal amount of saline.Part of the rats were sacrificed on postoperative day 1,3,7,14 or 21 to obtain the specimens of injuried spinal cord.By immunohistochemistry GFAP and cPLA2 expressions were compared.Tissue damage was observed in each group by HE staining.The correlation of GFAP and cPLA2 was analyzed.ResultsFrom the 7th postoperative day,BBB scores of the TMP group were higher than those of the saline group,the differencewas statistically significant(P＜0.05).In addition,the expressions of cPLA2 and GFAP in the TMP group were significantly lower than those in the normal saline group at each time period.The expressions of GFAP andcPLA2 are positively correlated(r=0.826,P=0.043).On the 21st day of spinal cord injury,HE staining revealed glial scar in the saline group and only ischemic changes in the TMP group.ConclusionsTMP can down-regulate the expressions of GFAP and cPLA2,and play a protective role in acute spinal cord injury.

Tetramethylpyrazine;acute spinal cord injury;glial fibrillary acidic protein;cytosolic phospholipase A2

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.003

1005-8982（2017）07-0009-06

2016-09-30