徐孝東 綜述 劉志紅 審校

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

外泌體的生物學(xué)功能及其研究方法

徐孝東 綜述 劉志紅 審校

外泌體(exosomes)是由細(xì)胞中的內(nèi)涵體所分泌的一類直徑40～150 nm的微小囊泡，可通過受體介導(dǎo)的交互作用直接刺激靶細(xì)胞，或通過向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移各種生物活性分子等方式發(fā)揮其生物學(xué)功能。近年越來越多的研究投向利用exosomes進行疾病診斷、治療及預(yù)后判斷。然而目前對exosomes的分離及純化方法尚存在一些技術(shù)上的制約，缺乏公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，在一定程度上影響了exosomes的研究及其應(yīng)用。本文就exosomes的研究現(xiàn)狀和分離、純化方法方面做一簡要綜述。

exosomes 腎臟疾病

Johnstone等[1]在1987年首次在網(wǎng)織紅細(xì)胞培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)并報道外泌體(exosomes)，此后研究相繼發(fā)現(xiàn)exosomes可由多種細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)釋放和分泌，并廣泛存在于外周血、尿液及腹水等體液中，一度被認(rèn)為是細(xì)胞為維持自身生存而被釋放到外界的廢棄物[2]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，B淋巴細(xì)胞來源exosomes具有促進T淋巴細(xì)胞增殖、活化和抑制腫瘤細(xì)胞生長等能力[3]，表明exosomes不僅是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，而且在機體生理病理過程中扮演一定的生物學(xué)功能。

exosomes生物學(xué)功能

exosomes主要經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)體途徑生成(圖1)[4]。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)胞吞作用將外源性抗原吞入并形成早期核內(nèi)體后，隨即向內(nèi)出芽形成管腔狀囊泡，并選擇性地分揀細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白及脂質(zhì)成分，形成晚期核內(nèi)體，即具有動態(tài)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的多囊體，多囊體去向主要有3個方面：(1)直接與溶酶體結(jié)合降解內(nèi)載物；(2)接受細(xì)胞質(zhì)中的大分子和囊泡結(jié)構(gòu)形成內(nèi)涵體，內(nèi)涵體與溶酶體融合將內(nèi)載物降解；(3)以Ca2+依賴的方式與細(xì)胞膜融合，將其內(nèi)部所包含的囊泡結(jié)構(gòu)釋放至細(xì)胞外基質(zhì)中，即形成exosomes。細(xì)胞所分泌的exosomes進入外環(huán)境后，可通過自分泌或旁分泌途徑被細(xì)胞吸收，也可經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)被遠(yuǎn)距離靶組織或器官所吸收。而且，不同細(xì)胞來源exosomes表面可攜帶相似的保守蛋白(CD9、CD63、CD81等)，作為exosomes標(biāo)志物對其分析和鑒定；此外，exosomes還攜帶來源細(xì)胞相關(guān)的特異性生物學(xué)物質(zhì)，這些物質(zhì)不僅能反映來源細(xì)胞類型，更重要的是還與來源細(xì)胞的生理功能或病理改變密切相關(guān)，目前以exosomes為代表的體液活檢已可用于對腫瘤患者的早期診斷及病情監(jiān)測等。

exosomes由磷脂雙分子層膜和其包裹的蛋白質(zhì)、脂類及核酸等大分子生物信息物質(zhì)所構(gòu)成，可作為納米載體來介導(dǎo)細(xì)胞間的信息傳遞，而發(fā)揮信息傳遞作用的方式主要由以下4種：(1)exosomes作為信號復(fù)合物，通過配體-受體介導(dǎo)的方式刺激受體細(xì)胞。例如中性粒細(xì)胞來源的exosomes可通過表達Mac-1分子來激活血小板，促進凝血進程[5]；(2)exosomes在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移受體。如血小板來源exosomes可將黏附分子CD41轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞，增強內(nèi)皮細(xì)胞的連接功能[6]；(3)exosomes向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移功能蛋白或傳染性顆粒。腫瘤細(xì)胞可通過exosome將HSP70轉(zhuǎn)移到自然殺傷(NK)細(xì)胞，誘導(dǎo)NK細(xì)胞激活，促進機體發(fā)揮抗腫瘤免疫作用[7]；(4)exosomes通過膜融合方式向受體細(xì)胞傳遞mRNA、microRNA 或轉(zhuǎn)錄因子等遺傳信息。一旦exosomes被受體細(xì)胞所接受后，其內(nèi)載脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸等成分即可通過改變受體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯等程序來影響受體細(xì)胞表型和功能的改變。如exosomes可通過介導(dǎo)let-7a來降低腫瘤細(xì)胞的增殖水平，發(fā)揮機體抗腫瘤作用[8]。

圖1 exosomes的生成途徑[4]細(xì)胞外環(huán)境的改變可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞作用形成早期核內(nèi)體，早期核內(nèi)體經(jīng)歷成熟后形成多泡體或晚期核內(nèi)體，隨后細(xì)胞膜發(fā)生內(nèi)陷并將exosomes釋放至胞外

exosomes的分離純化方法

目前exosomes在疾病早期診斷和靶向治療方面展現(xiàn)出日趨重要的作用，但對其分離和純化方法尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。目前較為常用的方法包括差速離心法、蔗糖密度梯度離心法、磁珠分選法、微流控技術(shù)和提取試劑盒等，而不同提取方法獲得exosomes產(chǎn)量、純度和顆粒完整性等方面差異較大[9]。

差速離心法 是目前較為公認(rèn)的分離exosomes的方法，且被廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)液及體液exosomes的分離。盡管不同實驗室的分離步驟有所差異，但主要步驟包括：(1)首先對樣本低速離心(300g，10 min)，去除細(xì)胞及大的顆粒；(2)對上清液進行高速離心(2 000～10 000g，30 min)，去除死亡細(xì)胞及細(xì)胞碎片；(3)最后進行超速離心(～100 000g， 70 min)，所得沉淀即為exosomes。但此方法所獲得exosomes純度低，常伴雜蛋白污染，若想提高exosomes純度，可用PBS重懸后重復(fù)離心一次。然而，差速離心法不僅耗時，而且會很大程度降低exosomes 產(chǎn)量和破壞其形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，對后續(xù)功能學(xué)研究帶來一定影響[10]。

蔗糖密度梯度離心法 根據(jù)不同物質(zhì)密度不同進一步純化由差速離心法所得到的exosomes。exosomes在蔗糖溶液中的浮選密度為1.08～1.22 g/ml，而微泡浮選密度為1.18～1.25 g/ml，所以可根據(jù)需要來配置不同密度梯度的蔗糖溶液對exosomes進一步純化，主要步驟如下：首先重懸差速離心法所獲得的exosomes，并加入適當(dāng)濃度的蔗糖溶液，然后對其超速離心(100 000g，70 min)；離心結(jié)束后，抽取適當(dāng)濃度蔗糖溶液，用PBS 稀釋后再次超速離心，所得沉淀即為純化后的exosomes。此法所獲得exosomes純度較高，而且蔗糖墊還可保護超速離心力對exosomes結(jié)構(gòu)的破壞，適用于exosomes形態(tài)學(xué)的鑒定；但此方法前期準(zhǔn)備工作繁雜，耗時，且產(chǎn)量較低[9]。

免疫磁珠法 通過用抗體標(biāo)記磁珠識別exosomes表面特異性標(biāo)記分子來對其進行分離，其主要步驟包括[11]：首先將待測樣本與抗體包被的免疫磁珠混勻，室溫孵育后將待分離樣本緩緩加入到分離柱中；然后將分離柱移出磁性分離器，并用緩沖液沖洗exosomes。這種方法簡單省時，且分離純度較高；但并不適用于大體積樣本的分離，且分離得到的exosomes 活性受到一定影響，不利于后續(xù)功能學(xué)研究[9,11]。

微流控技術(shù) 是在微觀領(lǐng)域研究和操控液體流動的技術(shù)，這種微流控技術(shù)和微型化的芯片裝置對于臨床診斷和血液分析非常有用。微流控裝置可利用exosomes與抗體包被界面的特異性結(jié)合來對其進行分離。將待測樣本加入裝置后，裝置內(nèi)微型泵促使液體流過芯片，在流動過程中達到分離exosomes的目的[12]。該分離方法具有快捷、省時、高效的特點，但樣品引入前處理研究不成熟，而且儀器昂貴，不適合普通實驗室和體積較大樣本的分離[9]。

流式細(xì)胞分選法 在功能水平上對生物顆粒或單細(xì)胞進行定量分析分選的一種高效檢測儀器，通過檢測生物顆粒表面的發(fā)光度或熒光散射程度來達到分離和分選的目的。與傳統(tǒng)分選方法相比，流式分選法具有極高的精確度，而且可同時標(biāo)記多種熒光抗體來分選體液中特定細(xì)胞來源的exosomes[13]；目前我們實驗室已成功建立起一套從患者外周血或尿液中分選淋巴細(xì)胞或足細(xì)胞來源exosomes的方案(未發(fā)表資料)。此提取方法不僅純度高，還能特異性分選某種細(xì)胞來源的exosomes，適合后續(xù)功能學(xué)研究。但儀器價格昂貴，不適合大體積樣本的分選。

ExoQuickTM試劑盒 由美國Biosciences公司研究的成熟試劑盒，作用原理至今尚未公開，但此試劑盒能夠克服傳統(tǒng)方法耗時長和產(chǎn)率低的缺點。通過比較發(fā)現(xiàn)，使用ExoQuickTM試劑盒得到的exosomes純度及數(shù)量方面要明顯高于其他方法[14]。此方法具有快捷、省時和高效的特點，但價格較昂貴，限制了實驗室及臨床上的使用。目前市場上各類exosomes提取試劑盒分離效果良莠不齊，尚無絕對能滿足從各類樣品中分離到理想exosomes的方法或試劑盒。

exosomes與疾病的關(guān)系

exosomes與腫瘤 近年來針對exosomes與疾病診療的研究逐年增長，而70%以上是在腫瘤學(xué)領(lǐng)域。研究表明，機體所有類型體液均可檢出exosomes的存在，且exosomes含有來源細(xì)胞特異性的標(biāo)志分子，所以通過分析腫瘤細(xì)胞所釋放的exosomes分子特征就可部分反映其來源細(xì)胞表型[15]。如exosomes攜帶的腫瘤特異性抗原或miRNA等可以作為腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用到臨床診斷中。Melo SA等發(fā)現(xiàn)，胰腺腫瘤患者外周血中Glypican-1+exosomes所占比例及數(shù)量要明顯高于健康對照者，而且用外周血中Glypican-1+exosomes診斷胰腺腫瘤患者的特異性及敏感性要優(yōu)于傳統(tǒng)診斷指標(biāo)CA19-9[15]。MiR-141在前列腺腫瘤患者外周血中主要以exosomes包裹的形式存在，且用exosomes內(nèi)miR-141的水平更能顯著性地區(qū)分惡性腫瘤與良性腫瘤間的差異[16]。

除了用于早期診斷生物標(biāo)志物，腫瘤細(xì)胞來源exosomes對還可影響機體抗腫瘤免疫和腫瘤生長[17]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者體內(nèi)樹突狀細(xì)胞可對腫瘤細(xì)胞來源的exosomes進行加工處理，并將其以MHC-抗原肽復(fù)合物形式提程給T細(xì)胞，誘導(dǎo)T細(xì)胞激活，增強機體抗腫瘤免疫水平[17]。腫瘤細(xì)胞來源exosomes還可直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，如胰腺腫瘤患者腫瘤細(xì)胞所分泌的exosomes可上調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)Bax表達水平，促進腫瘤細(xì)胞凋亡[18]。在晚期腫瘤患者研究中，更多的證據(jù)腫瘤細(xì)胞所分泌的exosomes具有促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。如黑色素瘤患者腫瘤細(xì)胞來源exosomes高水平表達FasL，并可通過Fas-FasL介導(dǎo)的方式上調(diào)Jurkat T細(xì)胞的凋亡水平，從而對機體抗腫瘤免疫起到一定拮抗作用[19]。

exosomes與腎臟疾病 有關(guān)exosomes與腎臟疾病的研究相對較少。目前主要是通過腎小球濾過率、肌酐清除率、血清肌酐和尿蛋白定量等指標(biāo)來評估腎臟功能，仍缺乏疾病早期診斷和反映疾病進展及預(yù)后的標(biāo)志物。腎穿刺活檢能夠為疾病診斷、判斷病情及預(yù)后提供重要的組織學(xué)依據(jù)。但是，作為一種創(chuàng)傷性檢查，無法將其用于實時動態(tài)的疾病觀察中。

在尋找新生物標(biāo)志物的過程中，尿液標(biāo)本因取材簡便、來源豐富，有著很大的優(yōu)越性。但尿液組分復(fù)雜，其中含量豐富卻缺乏特異性的成分勢必會干擾量微但特異性強的組分檢測，而尿液中exosomes(uExos)卻因富集相對特異組分而克服了該劣勢。研究證實所有腎臟細(xì)胞均可分泌exosomes，所以通過對uExos進行組學(xué)分析即可尋找出腎臟特異性的生物標(biāo)志物。如腎小管疾病方面，急性腎損傷(AKI)小鼠模型中uExos中胎球蛋白A、活化轉(zhuǎn)錄因子3[20]和足細(xì)胞骨架巢蛋白[21]在損傷早期即出現(xiàn)高表達，比傳統(tǒng)指標(biāo)血清肌酐提前18～48h出現(xiàn)改變；另外，uExos中水通道蛋白1(AQP-1)及鈉氫交換體在疾病早期出現(xiàn)下降，與傳統(tǒng)檢測指標(biāo)鈉排泄分?jǐn)?shù)及尿視黃醇結(jié)合蛋白相比具有更高的敏感度和特異度[22]。其次，uExos在腎小管通道損傷或突變?nèi)笔嚓P(guān)的家族性高鉀性高血壓患者[23]等疾病診斷方面均顯示出具有提高早期疾病診斷率的優(yōu)勢。如在經(jīng)典腎小管酸中毒囊泡型H+-ATPase B1亞基(V-ATPase B1)基因敲除小鼠模型中顯示，uExos數(shù)量與腎組織中的V-ATPase B1 mRNA 和AQP-2 mRNA 表達水平具有顯著相關(guān)性[24]。另外，機體腎小球來源的exosomes可源源不斷地釋放到尿液中，所以uExos改變可作為診斷腎小球疾病的生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，uExos中WT-1表達水平在局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)小鼠模型中顯著上調(diào)，并早于蛋白尿的出現(xiàn)[20]。而且臨床實驗也證實，F(xiàn)SGS患者uExos中WT-1水平較正常對照者顯著上調(diào)，且FSGS患者經(jīng)激素治療后，激素敏感型患者uExos中WT-1水平較激素抵抗者顯著下調(diào)[25]。結(jié)果提示，uExos中WT-1水平可用作預(yù)測FSGS療效及疾病進展相關(guān)的生物標(biāo)志物應(yīng)用到臨床中。另外，有研究表明uExos中miRNA也可作為生物標(biāo)志物應(yīng)用到臨床，如慢性腎臟病患者uExos中miR-29及miR-200水平較正常對照者相比明顯下調(diào)，且下調(diào)水平與腎功能、小管-間質(zhì)纖維化損傷程度具有顯著相關(guān)性[26]。上述研究均提示uExos可作為腎臟早期診斷的生物標(biāo)志物應(yīng)用到臨床中。

近年來，exosomes除可以作為生物標(biāo)志物外，將其作為新興腎臟疾病的干預(yù)目標(biāo)和靶向治療載體方面也有了新進展。體內(nèi)外研究顯示，骨髓細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)和內(nèi)皮祖細(xì)胞來源的exosomes能介導(dǎo)miRNAs的靶向運輸并促進小鼠AKI后形態(tài)學(xué)和功能上的恢復(fù)[27-28]。人MSC-exosomes可降低順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激強度和腎臟上皮細(xì)胞凋亡[29]。缺血/再灌注(I/R)誘導(dǎo)的AKI小鼠模型中，內(nèi)皮集落形成細(xì)胞來源的exosomes可顯著降低血清肌酐、腎小管壞死、巨噬細(xì)胞浸潤、氧化應(yīng)激和腎組織細(xì)胞凋亡水平，對腎臟I/R損傷起到一定保護作用[30]。其次，給鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠連續(xù)尾靜脈注射人尿液來源干細(xì)胞所分泌的exosomes能顯著降低其尿白蛋水平，組織病理也提示系膜細(xì)胞增生情況得到緩解；體外實驗證實上述exosomes可通過caspase-3途徑來下調(diào)足細(xì)胞凋亡水平[31]，結(jié)果提示干細(xì)胞來源的exosomes為糖尿病腎病的治療提供了新的思路。

exosomes與其他疾病 心肌梗死后功能性心肌細(xì)胞丟失是導(dǎo)致心室重塑及心力衰竭的主要原因。Exosoms作為干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)的主要組分，在促進心肌細(xì)胞增殖及血管再生方面起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，將人心臟祖細(xì)胞來源exosomes 注入動物心梗模型后，能顯著降低心肌細(xì)胞的凋亡水平和促血管的生成效應(yīng)[32]。隨后研究相繼發(fā)現(xiàn)，在I/R大鼠心臟中注入MSC-exosomes可顯著降低心臟纖維化進展[33]。此外，exosomes還可通過血腦屏障并發(fā)揮對靶基因的表達調(diào)控。如MSC-exosomes可介導(dǎo)miR-146抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長作用[34]。神經(jīng)元也可借助exosomes轉(zhuǎn)移miR-124b到星形膠質(zhì)細(xì)胞，促進葡糖糖轉(zhuǎn)運蛋白1的表達，調(diào)控突觸活性[35]。

小結(jié)：exosomes作為生物體內(nèi)的一種信息物質(zhì)載體，在機體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演著重要的作用；其穩(wěn)定的生物學(xué)結(jié)構(gòu)，豐富的內(nèi)含物和在體液中的廣泛分布，使exosomes成為生命科學(xué)研究的一個重要領(lǐng)域，不僅可以幫助我們揭開許多疾病的發(fā)病機制，并有望使其成為新型生物標(biāo)志物而被應(yīng)用到臨床診斷和治療中。

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(本文編輯 加 則 青 松)

Biological function and isolation methods of exosomes

XUXiaodong,LIUZhihong

NationalClinicalResearchCenterofKidneyDiseases，JinlingHospital，NanjingUniversitySchoolofMedicine，Nanjing210016，China

Exosomes are a class of extracellular vesicles released by cells, with a size range of 40-150 nm and a lipid bilayer membrane. Exosomes contain membrane receptor, mRNA and microRNA, and may mediate specific cell-to-cell communication and activate signaling pathways in cells they fuse or interact with. With the deepening of its research in recent years, emerging evidence suggests that exosomes can be used as liquid biopsies and noninvasive biomarkers for early detection, diagnosis, and treatment of patients. However, there is no “gold standard” for the separation and purification of exosomes, which limits the research progress. This paper will review the research progress of exosomes, and the method of exosomes separation and purification in recent years．

exosomes renal disease

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2017.02.013

國家自然科學(xué)基金青年基金(81600560)；南京總醫(yī)院院管課題(2016031)；江蘇省科技計劃項目(BE2016747)

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腎臟科 國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 全軍腎臟病研究所(南京，210016)

2016-12-23