尹曙光+劉曉

摘 要：掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)是納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新近發(fā)展起來的一種掃描探針顯微鏡技術(shù)，可被用來在生理?xiàng)l件下、高分辨率及非接觸地研究活細(xì)胞的表面形貌。掃描用玻璃微探針的性能直接影響掃描探針顯微鏡的分辨率和拓?fù)涑上褓|(zhì)量，因此玻璃微探針的制備在實(shí)現(xiàn)納米生物樣品的高分辨率探測(cè)中具有重要的意義。文章運(yùn)用掃描電子顯微鏡直接觀測(cè)玻璃微探針的幾何形狀進(jìn)而推算電阻值，借助膜片鉗技術(shù)測(cè)量微探針實(shí)際電阻，并通過應(yīng)用該種玻璃探針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行掃描成像來判斷該微探針是否滿足實(shí)驗(yàn)需要，最終綜合上述數(shù)據(jù)對(duì)納米尺度玻璃微探針的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞：掃描離子電導(dǎo)顯微鏡；納米技術(shù)；玻璃微探針

掃描離子電導(dǎo)顯微鏡（Scanning Ion Conductance Microscopy，SICM）憑借探針跳躍的非接觸掃描方式成為了目前最適合在生理液態(tài)環(huán)境中實(shí)時(shí)觀察活體生物樣品表面三維拓?fù)湫蚊驳囊环N極具應(yīng)用前景的掃描探針顯微鏡技術(shù)[1，2]。它采用交流調(diào)制式負(fù)反饋控制技術(shù)和超納米精度的壓電陶瓷控制玻璃微探針在樣品表面以恒定距離掃描，記錄玻璃微探針的運(yùn)動(dòng)軌跡即可獲得樣品表面三維形貌[3]。因此，作為SICM感知樣品表面的唯一工具，玻璃微探針針尖的性能成為決定顯微鏡分辨率的關(guān)鍵性因素。

本文中我們對(duì)激光熔拉法拉[4]制出的玻璃微探針進(jìn)行了高分辨率掃描電鏡觀測(cè)，獲得探針形態(tài)與針尖尺度參數(shù)，通過公式計(jì)算與膜片鉗實(shí)測(cè)針尖電阻的方法來評(píng)價(jià)制備出的納米玻璃微探針的性能。

1 微探針性能在掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)中的重要性

微探針是SICM進(jìn)行納米尺度掃描成像的重要探測(cè)工具，其性能的優(yōu)劣直接影響SICM的成像質(zhì)量。此外，不同的掃描對(duì)象和掃描環(huán)境條件也對(duì)微探針針尖的曲率半徑和縱橫比等性狀提出了不同的要求。因此，對(duì)微探針的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)就顯得十分必要。

SICM玻璃微探針尖端的幾何形狀與采集到的數(shù)據(jù)的真實(shí)性密切相關(guān)。如圖1所示，當(dāng)對(duì)臺(tái)階狀區(qū)域進(jìn)行探測(cè)時(shí)，圓形針尖成像得到的是圓滑臺(tái)階（圖1a）；錐形針尖成像得到的是傾斜臺(tái)階（圖1b）；當(dāng)針尖的錐度大于樣品的微觀尺寸時(shí)，由于針尖的曲率半徑相對(duì)較大，不僅無法準(zhǔn)確探測(cè)樣品的表面形貌（圖1c）；而且還會(huì)產(chǎn)生橫向的位移誤差（圖1d）；針尖的曲率半徑越小，錐度越小，測(cè)量結(jié)果將越接近樣品的真實(shí)形貌（圖1e）。因此，為了提高測(cè)量結(jié)果的精度，在探針制備時(shí)，應(yīng)盡量選擇小曲率半徑和小錐度的微探針。

SICM微探針是由硅酸鹽玻璃或石英玻璃微管（外徑1.00mm， 內(nèi)徑0.59mm）拉制而成的纖細(xì)的玻璃微探針，也稱為玻璃微電極，為了方便向探針針尖內(nèi)充灌液體一般玻璃微管內(nèi)含導(dǎo)液絲（圖2）。借助掃描電鏡對(duì)玻璃微探針針尖的橫截面進(jìn)行成像可以清晰地觀察到玻璃微管中的導(dǎo)液絲。導(dǎo)液絲是一根玻璃纖維原絲，而每根原絲又由成百上千根單絲組成，它利用毛細(xì)現(xiàn)象的引流作用使得液體更容易注入針尖而不形成氣泡。

為了描述的方便，研究人員往往把玻璃微探針人為地分成三個(gè)部分，如圖3所示，為普通光學(xué)顯微鏡下觀察到的玻璃微探針。左側(cè)紅框中是探針的尖部，中間的紅框是探針的頸部，右側(cè)的紅框是探針的肩部。因?yàn)镾ICM的分辨率與玻璃微探針尖端內(nèi)徑尺寸為同一數(shù)量級(jí)，要達(dá)到50-100納米的高分辨率，相應(yīng)的玻璃微探針尖部的內(nèi)徑尺寸應(yīng)在同樣尺度。探針的肩部應(yīng)具有良好的軸對(duì)稱性，如果探針的對(duì)稱性不好，會(huì)使得探針不是垂直于被測(cè)樣品之上，導(dǎo)致探針的定位與掃描產(chǎn)生誤差，直接影響負(fù)反饋控制的靈敏性。此外，為了減少針尖的振動(dòng)增加掃描時(shí)的穩(wěn)定性，探針的頸部也要盡可能短以增加玻璃探針的剛度。

簡(jiǎn)而言之，一支好的SICM微探針應(yīng)具備以下四點(diǎn)：第一，探針針尖的粗細(xì)要滿足分辨率的要求；第二，探針要有大的錐角；第三，探針的肩部要軸對(duì)稱；第四，探針的頸部要盡可能短。

2 微探針的掃描電鏡觀測(cè)與電阻測(cè)量

我們使用美國(guó)Sutter Instrument P-2000型程控水平激光微電極拉制儀拉制硼硅酸鹽或石英玻璃微電極毛細(xì)管來制備SICM微探針。為了檢測(cè)該玻璃微探針尖端內(nèi)徑尺寸是否達(dá)到了50-100 nm，是否具備良好幾何形態(tài)，我們將拉制好的玻璃微探針進(jìn)行噴金處理后，用導(dǎo)電膠帶粘到載物臺(tái)上，借助LEO1530VP 型掃描電鏡直接觀測(cè)玻璃微探針針尖的形狀。

掃描電鏡成像得到的玻璃微探針成像顯示探針針尖形狀對(duì)稱（圖4），利用掃描電鏡分析軟件測(cè)量出玻璃微探針尖端內(nèi)半徑（ri）為27nm，外半徑（ro）為60nm （圖4A、B）。該玻璃微探針的內(nèi)壁半角θ為2.7°。通過下面的玻璃微探針電阻計(jì)算公式，可以估算出該玻璃微探針在充灌電極內(nèi)液后的理論電阻值。

公式中：Rp為玻璃微探針電阻，ξ為玻璃微探針內(nèi)液（0.15mol/L KCl）的電導(dǎo)率，ri為玻璃微探針針尖的內(nèi)半徑，θ為玻璃微探針針尖的內(nèi)壁半角。采用該公式估算得到該玻璃微探針的電阻約為130MΩ。

采用上述的拉制條件，拉制多根具有相近針尖形狀的玻璃微探針進(jìn)行膜片鉗電阻測(cè)量的實(shí)驗(yàn)。將充灌有0.15mol/L KCl的玻璃微探針連接到商用膜片鉗Multiclamp 700B 放大器上，通過Clampex 12.0軟件測(cè)量得到微探針的實(shí)際電阻值為137.6±24.7MΩ（n=16），并且電阻值穩(wěn)定。

根據(jù)掃描電鏡測(cè)得的玻璃微探針針尖形狀數(shù)據(jù)計(jì)算出的玻璃微探針的電阻值與膜片鉗測(cè)得的玻璃微探針的實(shí)際電阻進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)這兩種方法得到的玻璃微探針電阻值基本一致。玻璃微探針的電阻直接影響流入探針針尖離子電流的強(qiáng)度，從而影響到SICM的負(fù)反饋掃描控制，用傳統(tǒng)的膜片鉗電阻測(cè)量方法分析玻璃微探針性狀的方法更加簡(jiǎn)便快捷，可直觀、可靠地判定玻璃微探針的形態(tài)和拉制質(zhì)量。

3 標(biāo)準(zhǔn)樣品的掃描成像

為了檢測(cè)上述拉制條件下拉制的玻璃微探針是否滿足實(shí)驗(yàn)需要，我們選擇尖端內(nèi)壁直徑約50nm，電阻值約150MΩ的玻璃微電極作為SICM掃描探針，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品（Platinum coated calibration grid，10μm pitch，200nm deep，3D reference）進(jìn)行掃描成像。圖5是一幅40×40μm標(biāo)準(zhǔn)樣品的SICM成像。該圖清晰地呈現(xiàn)出樣品任意相鄰兩孔之間的距離為10μm， 并且深為200nm的標(biāo)準(zhǔn)階臺(tái)結(jié)構(gòu)清晰可見。這說明該玻璃微探針完全可以實(shí)現(xiàn)高分辨率掃描成像，并且無漂移、拖尾等現(xiàn)象。

4 結(jié)束語

玻璃微探針在SICM中的作用舉足輕重，因?yàn)樘结樀膬?yōu)劣會(huì)直接影響到SICM的分辨率和負(fù)反饋控制的穩(wěn)定性，是實(shí)現(xiàn)SICM穩(wěn)定高質(zhì)量成像的基礎(chǔ)。為了實(shí)現(xiàn)掃SICM技術(shù)的高分辨生物樣品成像，玻璃微探針的制備是該技術(shù)走向掃描應(yīng)用的第一步，也是最基礎(chǔ)、最重要的一步，必須制備出性能優(yōu)良的納米尺度玻璃微探針。本文對(duì)SICM技術(shù)中使用的硼硅酸鹽和石英玻璃微探針針尖形狀進(jìn)行了觀測(cè)，并根據(jù)觀測(cè)數(shù)據(jù)推算出了玻璃微探針的電阻值，該電阻值與膜片鉗測(cè)得的玻璃微探針電阻基本一致。利用該探針我們得到了標(biāo)準(zhǔn)樣品的高分辨率成像，這表明用Sutter Instrument P-2000型程控水平激光微電極拉制儀拉制的硼硅酸鹽和石英玻璃微探針的性能穩(wěn)定能夠滿足SICM技術(shù)高分辨率掃描的要求。

參考文獻(xiàn)

[1]Novak P，Li C，Shevchuk AI，et al.Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.Nat. Meth，2009，6：279-281.

[2]楊茜，劉曉，馬麗穎，等.非接觸式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)在探測(cè)活體細(xì)胞表面微結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用[J].電子顯微學(xué)報(bào)，2009，28（5）：48

9-494.

[3]楊茜，劉曉，張曉帆，等.基于掃描離子電導(dǎo)顯微鏡負(fù)反饋掃描控制技術(shù)的高分辨率膜片鉗技術(shù)[J].生理學(xué)報(bào)，2010，62（3）：275-283.

[4]Yang X，Liu X，Lu H，et al.Real-time investigation of acute toxicity of ZnO nanoparticles on human lung epithelia with Hopping Probe Ion Conductance Microscopy.Chemical Research in Toxicology，2012，25：297-304.