蔡旭龍 林瑪麗 曹珊 林娜

【摘要】目的研究白介素1受體Ⅰ型（Interleukin 1 receptor，type Ⅰ，IL1R1）基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)rs1558641和rs949963與哮喘易感的相關(guān)性。

方法采用病例對(duì)照的研究方法，收集廣西百色地區(qū)屬于壯族分支的黑衣壯人群，哮喘兒童80例，健康兒童100例，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)連接酶檢測(cè)反應(yīng)（polymerase chain reactionligase detection reaction，PCRLDR）對(duì)IL1R1的rs1558641和rs949963位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行基因分型。

結(jié)果IL1R1基因rs1558641位點(diǎn)檢測(cè)出CC、CT、TT基因型，rs949963位點(diǎn)檢測(cè)出AA、AG、GG基因型，兩個(gè)位點(diǎn)基因型、等位基因在哮喘和健康組中分布均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；通過(guò)SHEsis軟件計(jì)算連鎖不平衡（LD）的系數(shù)，結(jié)果D=1，r2=1。

結(jié)論IL1R1基因SNP位點(diǎn)rs1558641和rs949963有完全連鎖現(xiàn)象，rs1558641和rs949963位點(diǎn)多態(tài)性可能是黑衣壯兒童哮喘的易感因素。

【關(guān)鍵詞】IL1R1；多態(tài)性；哮喘；黑衣壯

中圖分類號(hào)：R725.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2017.01.002

A study on association of IL1R1 gene polymorphism with asthma in blackclothing Zhuang children

[HJ1*2][HJ]

CAI Xulong1，LIN Mali1，CAO Shan1，LIN Na2▲

（1.Graduate School，2.Department Pediatrics of Affiliated Hospital，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

[HJ2][HJ]

【Abstract】ObjectiveTo study relationship between single nucleotide polymorphism（SNP） site rs1558641 and rs949963 of interleukin 1 receptor，type （IL1R1） and susceptible asthma.

MethodsCasecontrol study was adopted in this research.80 children with asthma and 100 healthy controls in blackclothing Zhuang people in Baise area of Guangxi were collected.And then，polymorphism genotyping was performed through polymerase chain reactionligase detection reaction （PCRLDR），so as to carry out polymorphism genotyping of rs1558641 and rs949963 loci in IL1R1.

ResultsCC，CT and TT genotypes were detected in IL1R1 gene rs1558641 locus，and AA，AG and GG genotypes were detected in rs949963 locus.Distributions of genotypes and alleles of the two locus（rs1558641 and rs949963） in asthma group and healthy group all had statistically significant difference（P<0.05）.The coefficient of linkage disequilibrium （LD） was calculated by SHEsis software，and the results was：D=1，r2=1.

ConclusionThere is a complete linkage between SNP rs1558641 and rs949963 locus in IL1R1，so polymorphisms rs1558641 and rs949963 locus may be susceptible factors of asthma children in blackclothing Zhuang population.

【Key words】IL1R1；polymorphism；asthma；blackclothing Zhuang population

哮喘疾病是世界性難題，患者在不斷增加，目前全球范圍約有3億患者。哮喘使患者及其家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加重，生活質(zhì)量也受較大影響。哮喘是由嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、黏液細(xì)胞等多種細(xì)胞參與的以慢性氣道炎癥為特征的一種異質(zhì)性的疾病，表現(xiàn)為喘鳴、氣短、胸悶、咳嗽和呼氣氣流受限。哮喘發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚不十分清楚，與環(huán)境因素和遺傳因素關(guān)系密切。白介素1受體Ⅰ型（IL1R1）在大多數(shù)細(xì)胞上表達(dá)，作為白介素1（IL1）的受體，在IL1信號(hào)通路中起重要作用。有研究表明IL1R1可以放大IL1作用，與炎癥反應(yīng)、哮喘和過(guò)敏性疾病關(guān)系密切[1]。本次研究IL1R1基因rs1558641和rs949963位點(diǎn)的多態(tài)性與黑衣壯兒童哮喘的相關(guān)性。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

2015年6月至2016年5月期間在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診和病房收集80例哮喘兒童，男48例，女32例，年齡2.3～8.3歲，平均（4.3±1.3）歲，哮喘診斷符合2008年兒童支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。100例健康兒童作為對(duì)照，為同期體檢的健康兒童，男65例，女35例，年齡3.8～5.7歲，平均（4.5±0.7）歲，無(wú)過(guò)敏史，家族中無(wú)哮喘及其他免疫性疾病患者。兩組研究對(duì)象三代均為黑衣壯，相互之間無(wú)血緣關(guān)系。在年齡及性別組成上兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。根據(jù)知情同意原則，與患兒家長(zhǎng)簽訂知情同意書，并經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑和儀器

東勝龍黑金剛EDC810 PCR儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）；3730XL基因測(cè)序儀（ABI公司）；Allegra 25R高速離心機(jī)（貝克曼公司）；Micro 17R微量臺(tái)式離心機(jī)（賽默公司）；微量可調(diào)移液器（Eppendorf公司）；Taq酶（Fermentas公司）；dNTP（Fermentas公司）；Taq DNA ligase（NEB公司）；人血液DNA提取試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.3標(biāo)本采集

空腹抽1 ml靜脈血，存放在EDTA抗凝管中，用于DNA的提取，收集的標(biāo)本保存在-80℃冰箱待檢。

1.4IL1基因多態(tài)性分析

用人全血DNA提取試劑盒提取DNA（上海捷瑞生物工程有限公司），提取的DNA由上海捷瑞生物工程有限公司用聚合酶鏈反應(yīng)連接酶檢測(cè)反應(yīng)（PCRLDR）對(duì)基因位點(diǎn)進(jìn)行基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）分型。擴(kuò)增rs1558641位點(diǎn)和rs949963位點(diǎn)的引物及探針序列見表1。PCR擴(kuò)增：總反應(yīng)體積為15 μL，10×Buffer 1.5 μL，MgCl2 1.5 μL，DNTP 0.3 μL，引物0.15 μL/條，Taq酶0.3 μL，模板DNA 1 μL，雙蒸水補(bǔ)至15 μL。充分混勻，放入PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系于94℃預(yù)變性3 min后，按程序94℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃ 90 s 擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸3 min。連接反應(yīng)：總反應(yīng)體積為10 μL PCR產(chǎn)物3 μL，10×Taq DNA ligase buffer 1 μL，Taq DNA ligase（40 U/μL）0125 μL，探針（10 pmol/μL）0.01 μL/條，H2O補(bǔ)至 10 μL。連接條件：94℃ 30 s→56℃ 3 min 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。取1 μL反應(yīng)產(chǎn)物，加8 μL上樣loading buffer，95℃變性3 min，立即冰水浴，上測(cè)序儀測(cè)序。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，兩組的基因型和等位基因用計(jì)數(shù)法計(jì)算頻率，HardyWeinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)群體代表性，兩組的基因型頻率和等位基因頻率采用χ2檢驗(yàn)作比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2結(jié)果

2.1SNP各種基因表型結(jié)果

通過(guò)LDR反應(yīng)產(chǎn)物的測(cè)序長(zhǎng)度對(duì)各基因型進(jìn)行判斷，純合子只有1種片段長(zhǎng)度，雜合子包含2種純合子的片段長(zhǎng)度。rs1558641位點(diǎn)根據(jù)所設(shè)計(jì)的探針，C基因型的片段長(zhǎng)度為57 bp，T基因型的片段長(zhǎng)度為60 bp。rs949963位點(diǎn)根據(jù)所設(shè)計(jì)的探針，A基因型的片段長(zhǎng)度為78 bp，G基因型的片段長(zhǎng)度為81 bp。經(jīng)3730XL基因測(cè)序儀（ABI公司）基因檢測(cè)，GeneMarker V1.5分析，SNP分型結(jié)果顯示rs1558641和rs949963位點(diǎn)均分別有CC、CT、TT和AA、AG、GG 3種基因型（圖1、2）。

2.2IL1R1多態(tài)性位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率

哮喘組及健康對(duì)照組均符合HardyWeinberg遺傳平衡定律（P>0.05），有群體代表性。rs1558641和rs949963位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率在健康對(duì)照組和哮喘組之間分布均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2、表3。

2.3rs1558641和rs949963位點(diǎn)連鎖不平衡情況

連鎖不平衡（LD）又稱等位基因關(guān)聯(lián)，是指同一條染色體上，兩個(gè)等位基因間的非隨機(jī)相關(guān)，即兩個(gè)等位基因（A，B）位于同一條染色體的同時(shí)存在的概率（PAB）大于人群中因隨機(jī)分布而同時(shí)出現(xiàn)的概率時(shí)，就稱這兩個(gè)位點(diǎn)處于LD狀態(tài)。通過(guò)SHEsis軟件計(jì)算連鎖不平衡的系數(shù)D和r2來(lái)衡量LD強(qiáng)度，結(jié)果D=1，r2=1，說(shuō)明rs1558641和rs949963位點(diǎn)完全連鎖。

注：箭頭所指A圖單峰表示CC基因型；B圖雙峰為CT基因型；C圖呈現(xiàn)單峰為TT基因型。

圖1IL1R1基因SNP rs1558641位點(diǎn)基因表型結(jié)果

注：箭頭所指A圖單峰表示AA基因型；B圖雙峰為AG基因型；C圖呈現(xiàn)單峰為GG基因型。

圖2IL1R1基因SNP rs949963位點(diǎn)基因表型結(jié)果

表2IL1R1基因rs1558641位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較[n（%）]

組別n

基因型頻率CCCTTTχ2P

等位基因頻率CTχ2P

健康對(duì)照組10063（63.0）34（34.0）3（3.0）6.1280.047160（80.0）40（20.0）5.3920.020

哮喘組8040（50.0）31（38.7）9（11.3）111（69.4）49（30.6）

表3IL1R1基因rs949963位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較[n（%）]

組別n

基因型頻率GGAGAAχ2P

等位基因頻率GAχ2P

健康對(duì)照組10063（63.0）34（34.0）3（3.0）6.1280.047160（80.0）40（20.0）5.3920.020

哮喘組8040（50.0）31（38.7）9（11.3）111（69.4）49（30.6）

3討論

哮喘在各個(gè)年齡段均可以發(fā)病，但多數(shù)發(fā)生在兒童期。哮喘對(duì)兒童的學(xué)習(xí)、生活影響巨大。哮喘是由環(huán)境和遺傳共同作用的復(fù)雜疾病，特點(diǎn)是氣道平滑肌收縮，黏液分泌過(guò)度、水腫和氣道高反應(yīng)性[4]。環(huán)境因素觸發(fā)或調(diào)節(jié)哮喘發(fā)生，而哮喘遺傳因素易感性尚沒(méi)有完全了解。單核苷酸多態(tài)性分析已被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜遺傳性疾病的研究。全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)目前哮喘相關(guān)的候選基因超過(guò)300個(gè)，其中IL1R1基因與哮喘有關(guān)[6～7]。也有研究發(fā)現(xiàn)IL1R1與癌癥、睡眠的調(diào)節(jié)有關(guān)[8～9]。

IL1R1位于染色體2q12區(qū)域，該區(qū)域內(nèi)的許多基因均與哮喘相關(guān)[10]，與IL1R2、IL1RL2和IL1RL1形成細(xì)胞因子受體基因簇。IL1R1是白細(xì)胞介素1受體家族的一員，是一種糖蛋白，分子量約為80 kDa，主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞、表皮樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞[11]。Schmitz等[12]用哮喘的小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)IL1R1在輕型和重型哮喘發(fā)病機(jī)制中有重要作用。

在本次研究中rs1558641和rs949963位點(diǎn)基因型頻率成對(duì)出現(xiàn)，經(jīng)計(jì)算分析這兩個(gè)位點(diǎn)完全連鎖，千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中中國(guó)漢族也完全連鎖。rs1558641位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在健康組和哮喘組之間分布均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），rs949963位點(diǎn)的數(shù)據(jù)結(jié)果與rs1558641位點(diǎn)相同。rs1558641位點(diǎn)中TT基因型可能是哮喘的易感基因型，T等位基因可能是患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)因子。在rs949963位點(diǎn)的研究中AA基因型可能是哮喘的易感基因型，A等位基因可能是患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)因子。Chen J等研究中國(guó)漢族人群rs1558641位點(diǎn)多態(tài)性與FEV1%和總血清IgE相關(guān)，該位點(diǎn)多態(tài)性與哮喘臨床特征相關(guān)[13]。

本次研究rs1558641和rs949963位點(diǎn)多態(tài)性在黑衣壯人群中完全連鎖，與千人計(jì)劃組數(shù)據(jù)庫(kù)中北京地區(qū)漢族人群的研究結(jié)果一致。IL1R1基因的rs1558641和rs949963位點(diǎn)多態(tài)性可能是壯族兒童哮喘的風(fēng)險(xiǎn)因素。本次研究的樣本量少，結(jié)果可能有偏頗。今后需進(jìn)一步廣泛深入研究，與其他民族或人種綜合比較分析，進(jìn)一步了解哮喘發(fā)病機(jī)制。

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（收稿日期：2016-11-24修回日期：2016-12-26）

（編輯：潘明志）