張丹陽(yáng)，田登梅，劉麗輝，施兵，馮超，何圣科，張永清1,(1河北北方學(xué)院，河北張家口075000；解放軍第309醫(yī)院)

慢性髓性白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞SDF-1水平與病情及臨床參數(shù)的關(guān)系

張丹陽(yáng)1，2，田登梅2，劉麗輝2，施兵2，馮超2，何圣科2，張永清1,2
(1河北北方學(xué)院，河北張家口075000；2解放軍第309醫(yī)院)

目的 觀察骨髓基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(SDF-1)在慢性髓性白血病(CML)不同病程中的表達(dá)，并探討其與臨床參數(shù)的關(guān)系。方法 選擇CML患者30例及健康對(duì)照者12例，CML患者30例中，初治慢性期10例、慢性期獲得主要分子學(xué)反應(yīng)(MMR)10例(患者接受一代或二代TKI治療)、急變期10例(接受TKI治療疾病仍發(fā)生進(jìn)展)。抽取骨髓，提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)SDF-1 mRNA，比較CML與健康對(duì)照之間及不同病程CML患者之間SDF-1的表達(dá)差異，分析SDF-1 mRNA表達(dá)水平與CML患者臨床參數(shù)間的關(guān)系。選取上述患者中CML初治慢性期患者6例、急變期4例的骨髓活檢標(biāo)本作為慢性期組及急變期組，并應(yīng)用5例份無(wú)明顯病變的骨髓活檢標(biāo)本作為對(duì)照組，應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)骨髓組織SDF-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與健康對(duì)照比較，CML初治慢性期患者、急變期患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞SDF-1 mRNA表達(dá)水平降低(P均<0.05)，CML慢性期治療后獲得MMR者SDF-1 mRNA水平與健康對(duì)照比較，P>0.05；CML急變期患者SDF-1 mRNA表達(dá)水平較CML初治慢性期患者高(P<0.05)。急變期組骨髓組織中SDF-1表達(dá)陽(yáng)性率高于慢性期組(P<0.05),慢性期組與對(duì)照組比較P>0.05。SDF-1 mRNA低表達(dá)(<4.36×10-3)患者外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于SDF-1 mRNA高表達(dá)(≥4.36×10-3)者(P<0.05)，而SDF-1 mRNA的表達(dá)與患者年齡、性別、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)、CD34+細(xì)胞比例、BCR-ABL1/ABL1、染色體核型均無(wú)相關(guān)性(P均﹥0.05)。結(jié)論 CML患者骨髓微環(huán)境中SDF-1表達(dá)降低，其水平降低與病情加重及白細(xì)胞升高有關(guān)。

慢性髓性白血??；骨髓基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1；急變期

慢性髓性白血病(CML)是髓系造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，以髓細(xì)胞大量增殖為主要特征。其主要發(fā)病機(jī)制是Ph染色體t(9；22)(q34；q11)易位導(dǎo)致BCR-ABL融合基因的產(chǎn)生。臨床上，CML可分為慢性期、加速期、急變期，酪氨酸抑制劑(TKI)是目前治療CML的首選用藥，對(duì)慢性期患者治療效果良好，但仍有約15%患者在治療過(guò)程中出現(xiàn)耐藥，發(fā)生進(jìn)展，預(yù)后極差[1]。骨髓微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)與其受體構(gòu)成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與白血病干細(xì)胞的增殖、分化和耐藥密切相關(guān)[2]。大量研究顯示，SDF-1與TKI耐藥密切相關(guān)，但SDF-1在CML患者中的表達(dá)及其與白血病耐藥、進(jìn)展的關(guān)系報(bào)道較少。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組化法檢測(cè)了CML患者骨髓微環(huán)境中SDF-1表達(dá)，并探討SDF-1在CML不同病程中表達(dá)的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇解放軍第309醫(yī)院2014年3月～2016年9月診治的CML患者30例，均符合《中國(guó)慢性髓性白血病診斷與治療指南》[3]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。男19例、女11例，年齡16～67歲。初治慢性期10例、慢性期獲得主要分子學(xué)反應(yīng)(MMR)10例(患者接受一代或二代TKI治療)、急變期10例(接受TKI治療疾病仍發(fā)生進(jìn)展)。健康對(duì)照者12例，男6例、女6例，年齡32～59歲。選取上述患者中CML初治慢性期患者6例、急變期4例的骨髓活檢標(biāo)本作為慢性期組及急變期組，并應(yīng)用5例份無(wú)明顯病變的骨髓活檢標(biāo)本作為對(duì)照組。

1.2 骨髓單個(gè)核細(xì)胞SDF-1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。無(wú)菌條件下采集CML患者骨髓標(biāo)本，加入淋巴細(xì)胞分離液，提取單個(gè)核細(xì)胞。以TRIzol(Invitrogen 公司)提取細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計(jì)于OD260 nm和OD280 nm檢測(cè)RNA濃度及純度。按日本TAKARA公司PrimeScriptTMRTMaster Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。引物序列：SDF-1上游：5′-ACAGATGCCCATGCCGATTCT-3′，下游：5′-CCTGAATCCACTTTAGCTTCGGGT-3′；GAPDH上游：5′-CTTTTGCGTCGCCAGCCGAG-3′，下游5′-CCAGGCGCCCAATACGACCA-3′。引物由上海生物工程公司合成。擴(kuò)增完畢后，以GAPDH為內(nèi)參照基因，與對(duì)照組相比。結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3 骨髓活檢組織中SDF-1蛋白表達(dá)的檢測(cè) 將骨髓活檢標(biāo)本切3 μm厚切片，采用免疫組化SP法檢測(cè)，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈黃色或棕黃色為SDF-1表達(dá)陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<1%為0分，1%～29%為1分，30%～59%為2分，≥60%為3分；細(xì)胞質(zhì)染色無(wú)色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)計(jì)分相加，0～1分為陰性，≥2分為陽(yáng)性。

1.4 臨床參數(shù)的收集及檢測(cè)方法 收集采髓當(dāng)日患者的年齡，性別，病程，治療方案，白細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓中CD34+細(xì)胞百分比，PCR檢測(cè)BCR-ABL融合基因表達(dá)、BCR-ABL1/ABL1表達(dá)以及患者染色體核型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。SDF-1 mRNA表達(dá)數(shù)值以中位數(shù)表示，比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn)。組間SDF-1蛋白陽(yáng)性率比較及SDF-1 mRNA表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞SDF-1 mRNA表達(dá)水平 CML初治慢性期患者、慢性期MMR患者、急變期患者及健康對(duì)照者SDF-1 mRNA表達(dá)水平分別為0.162(0.048～22.561)、8.413(4.245～16.402)、1.954(0.104～18.711)×10-3、31.129(3.773～817.902) ×10-3。與健康對(duì)照相比，CML急變期、CML初治慢性期患者SDF-1 mRNA表達(dá)降低(P均<0.05)；慢性期MMR患者與健康對(duì)照比較，P>0.05；CML急變期患者SDF-1 mRNA的表達(dá)高于CML初治慢性期患者(P<0.05)。

2.2 CML患者骨髓活檢組織中SDF-1蛋白的表達(dá) SDF-1陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在骨髓網(wǎng)狀組織。慢性期組、急變期組及對(duì)照組SDF-1蛋白表達(dá)陽(yáng)性分別為1、4、6例，表達(dá)陽(yáng)性率分別為16.7%、100%、100%，與慢性期組比較，其余兩組均升高(P均<0.05)。其余兩組間比較，P﹥0.05。

2.3 骨髓單個(gè)核細(xì)胞中SDF-1 mRNA水平與CML患者臨床參數(shù)之間的關(guān)系 依據(jù)患者SDF-1 mRNA中位數(shù)水平4.36×10-3，將CML患者分為高表達(dá)者(≥4.36×10-3)和低表達(dá)者(<4.36×10-3)。SDF-1 mRNA低表達(dá)者外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高(P<0.01)。SDF-1 mRNA表達(dá)水平與年齡、性別、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)、BCR-ABL1/ABL1、染色體異常均無(wú)相關(guān)性(P均>0.05),詳見(jiàn)表1。

表1 CML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中SDF-1 mRNA水平與臨床參數(shù)的關(guān)系

3 討論

SDF-1屬CXC類趨化因子，又名為CXCL12，其受體為CXCR4和CXCR7。骨髓微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌SDF-1結(jié)合相應(yīng)受體后參與造血細(xì)胞的生成，白細(xì)胞遷移和歸巢。近年研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1/CXCR4軸與白血病的發(fā)生和耐藥相關(guān)。SDF-1可激活STAT5通路的活化，提高白血病細(xì)胞的分化、生存能力，導(dǎo)致急性B淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生[4]。SDF-1/CXCR4信號(hào)軸在急性髓白血病細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的黏附中發(fā)揮重要作用，使其免受化療藥物的細(xì)胞毒性作用[5]。SDF-1與CML相關(guān)研究多在細(xì)胞系和動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4軸在TKI的耐藥中起到重要作用[6]。

本研究結(jié)果顯示，CML初治慢性期患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞SDF-1 mRNA水平和骨髓活檢SDF-1表達(dá)陽(yáng)性率較健康對(duì)照明顯下降。SDF-1 mRNA低水平表達(dá)患者外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高。白血病細(xì)胞破壞了正常骨髓微環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)紊亂，SDF-1表達(dá)下降[7]。趨化因子SDF-1維持正常造血干細(xì)胞的定位、分化，骨髓龕中SDF-1表達(dá)水平降低直接參與造血干細(xì)胞遷移至骨髓龕外，導(dǎo)致外周血未成熟白細(xì)胞大量增殖。經(jīng)過(guò)TKI治療后獲得MMR患者，SDF-1 mRNA表達(dá)恢復(fù)正常，這可能是CML緩解后瘤負(fù)荷降低，SDF-1水平得到恢復(fù)。

CML急變期患者SDF-1 mRNA水平和骨髓活檢SDF-1表達(dá)陽(yáng)性率均較CML初治慢性期患者升高。這與我們預(yù)期的隨著疾病發(fā)生進(jìn)展、瘤負(fù)荷增加，SDF-1表達(dá)進(jìn)行性降低結(jié)果不符。可能存在的原因是本次10例急變期患者均為口服伊馬替尼治療過(guò)程中CML進(jìn)展至急變期。本研究顯示患者應(yīng)用TKI治療緩解后骨髓單個(gè)核細(xì)胞SDF-1表達(dá)升高。Jin等[8]研究顯示，伊馬替尼可提高CML細(xì)胞表面的CXCR4表達(dá)。SDF-1/CXCR4軸介導(dǎo)部分CML細(xì)胞遷移至骨髓基質(zhì)，從而此類CML細(xì)胞駐扎于骨髓微環(huán)境中，避免伊馬替尼的殺傷作用，形成微小殘留病灶[9～11]。此類CML細(xì)胞進(jìn)一步分化擴(kuò)增，導(dǎo)致疾病進(jìn)入急變期。因此，我們推測(cè)SDF-1升高在CML耐藥進(jìn)展中起到重要作用。本研究中，急變期組SDF-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與對(duì)照組相同，考慮到本次實(shí)驗(yàn)骨髓活檢標(biāo)本例數(shù)少，且免疫組化為定性研究，急變期患者SDF-1 mRNA定量表達(dá)明顯低于健康對(duì)照者，并不能說(shuō)明急變期患者SDF-1升高到正常水平。CML急變期患者SDF-1水平低于健康對(duì)照者仍需擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)樣本證實(shí)。

綜上所述，CML患者骨髓微環(huán)境中SDF-1分泌減少，治療獲得MMR后SDF-1 mRNA水平恢復(fù)。CML初治慢性期患者SDF-1水平降低與CML發(fā)病和外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高密切相關(guān)。SDF-1在TKI耐藥、CML進(jìn)展中具有一定作用，但其具體分子機(jī)制及表達(dá)上調(diào)的調(diào)控因素可能與其他細(xì)胞因子、信號(hào)通路的相關(guān)作用有關(guān)[10]，有待進(jìn)一步研究。

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張永清(E-mail: zhangyongqing0725@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.021

R733.7

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1002-266X(2017)13-0067-03

2016-11-14)