李悅，楊向紅

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科，沈陽 110004）

生長抑制因子4對內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管形成相關(guān)因子表達的影響

李悅，楊向紅

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科，沈陽 110004）

目的 觀察生長抑制因子4（ING4）對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP?2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP?9）活性的影響，探討ING4對血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管生成的調(diào)控作用。方法 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVECs）體外培養(yǎng)，構(gòu)建ING4質(zhì)粒及干擾RNA轉(zhuǎn)染至HUVECs，MTT法檢測細(xì)胞增殖，Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移，實時PCR及Western blotting實驗檢測血管形成相關(guān)因子VEGF、MMP?2、MMP?9mRNA及蛋白表達水平。結(jié)果 MTT及Transwell實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染ING4質(zhì)粒能夠抑制HUVECs的增殖及遷移，而轉(zhuǎn)染ING4 siRNA則能夠促進HUVECs增殖及遷移，實時PCR及Western blotting實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染ING4質(zhì)粒能夠抑制血管形成相關(guān)因子VEGF、MMP?2、MMP?9mRNA及蛋白的表達水平。結(jié)論 ING4能夠通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移能力，下調(diào)血管形成相關(guān)因子VEGF、MMP?2、MMP?9的表達，進而抑制新血管形成。

生長抑制因子4；血管內(nèi)皮細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子；基質(zhì)金屬蛋白酶

血管生成在腫瘤發(fā)生和演進中起著至關(guān)重要的作用，腫瘤組織中的血管密度與腫瘤的惡性程度有關(guān)，并能夠預(yù)示腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)趨勢。血管內(nèi)皮細(xì)胞是覆蓋在血管內(nèi)腔面的連續(xù)單層扁平細(xì)胞，既能夠發(fā)揮屏障作用，又具有內(nèi)分泌功能，參與體內(nèi)細(xì)胞功能的調(diào)控以及多種重要平衡的調(diào)節(jié)，參與機體器官的缺血缺氧、炎性免疫反應(yīng)等過程。血管新生過程主要包括基底膜的溶解、內(nèi)皮細(xì)胞活化，隨后內(nèi)皮細(xì)胞從血管壁游離并遷移至新的位置增殖，相互連接形成管腔結(jié)構(gòu)最終相互吻合形成新毛細(xì)血管網(wǎng)。血管新生的過程需要多種誘發(fā)因子，其中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix me?talloproteinase?2，MMP?2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase?9，MMP?9）等起著尤為關(guān)鍵作用。

生長抑制因子（inhibitor of growth，ING）家族作為一種候選抑癌基因，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，ING4能夠通過激活P53、抑制NF?κB等機制抑制腫瘤生長，并能夠增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。目前國內(nèi)外學(xué)者［1-8］多集中于ING4的表達下降與腫瘤發(fā)生的關(guān)系以及ING4過表達載體對腫瘤細(xì)胞生長及耐藥的相關(guān)研究。為明確ING4對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)控作用，本研究擬構(gòu)建ING4過表達質(zhì)粒和干擾RNA，轉(zhuǎn)染至人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（human um?bilical vein endothelial cells，HUVECs）。觀察ING4對HUVECs的生長、遷移及其對血管形成相關(guān)因子VEGF、MMP?2、MMP?9的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞傳代培養(yǎng)及分組

HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞貼壁生長。每3 d傳代1次，實驗均選用對數(shù)生長期細(xì)胞。實驗設(shè)置空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（EV組）、ING4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（ING4組）、siRNA對照組（Con siRNA組）、ING4 siRNA轉(zhuǎn)染組（ING4 siRNA組）。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.2.1 ING4 siRNA轉(zhuǎn)染至HUVECs：轉(zhuǎn)染前將HU?VECs細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合達80%即可進行轉(zhuǎn)染。將6孔板內(nèi)培養(yǎng)基更換為無血清1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1 h左右。按照DharmaFECT轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，準(zhǔn)備2個EP管。管1，將1.5 μL、5 μmol/L miRNA加入28.5 μL無血清培養(yǎng)液。管2，將0.6 μL轉(zhuǎn)染試劑加入29.4 μL無血清培養(yǎng)液。將管1和管2分別混合均勻，室溫孵育5 min。將管1和管2內(nèi)容物混合，終體積為60 μL，混勻，室溫孵育20 min。將240 μL無抗生素培養(yǎng)液加入混合物，終體積為300 μL。將6孔板中的細(xì)胞用無血清1640培養(yǎng)液沖洗2遍。將上述轉(zhuǎn)染液逐滴加入6孔板中，輕輕搖動培養(yǎng)板，使轉(zhuǎn)染液混合均勻，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后更換為含10%FBS的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 ING4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HUVECs細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前將HUVECs細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合達80%即可進行轉(zhuǎn)染。將6孔板內(nèi)培養(yǎng)基更換為無血清1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1 h左右。按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，用TE緩沖液稀釋1.2 μg DNA，pH 7～8，DNA濃度≥0.1 μg/μL，加入無血清1640培養(yǎng)液至體積100 μL。加入4.5 μL轉(zhuǎn)染試劑，震蕩混勻，室溫孵育15～20 min，制成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將6孔板中的細(xì)胞用無血清1640培養(yǎng)液沖洗2遍。將上述轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入6孔板中，輕輕搖動培養(yǎng)板，使轉(zhuǎn)染液混合均勻，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后更換為含10%FBS的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.3 MTT實驗檢測細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染48 h后，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL，約含細(xì)胞2×103個，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液（美國Sigma公司），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入150 μL DMSO（美國Sigma公司），振蕩10 min，490 nm波長下測定各孔光吸收值，以不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)基作對照，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 Transwell實驗

將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞棄培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基吹打制成單細(xì)胞懸液。進行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×105/mL備用。將含有包被好Matrigel膠小室的24孔板取出，在下室內(nèi)加入1640培養(yǎng)液（含20%FBS）800 μL；在上室加入上述的細(xì)胞懸液，每孔200 μL，細(xì)胞數(shù)約為2×104/孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)板中的小室，PBS沖洗2次，用棉簽將位于微孔膜上層的細(xì)胞輕輕擦去，在室溫下，置于多聚甲醛溶液中固定20 min；在室溫下，置于蘇木素染液中染色5 min，蒸餾水沖洗。在倒置相差顯微鏡下（200倍）拍照，對細(xì)胞進行計數(shù)。每個樣本計數(shù)5個視野的細(xì)胞個數(shù)，并取平均數(shù)。

1.5 實時PCR檢測

應(yīng)用RNAiso plus試劑盒（日本TaKaRa公司）提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用SYBR?Premix Ex TaqTMPer?fect Real Time（日本TaKaRa公司）試劑盒，使用Ap?plied Biosystems 7900HT Fast Real?Time PCR系統(tǒng)。GAPDH為內(nèi)參對照。引物由廣州瑞博生物技術(shù)有限公司設(shè)計。為了校正加樣誤差，以內(nèi)參引物GAP?DH的CT值校正樣本拷貝數(shù)，利用2-△△Ct計算樣本基因和GAPDHmRNA的相對表達量，其中CT是PCR產(chǎn)物的熒光達到檢測閾值時的擴增循環(huán)數(shù)。每組樣本設(shè)3個復(fù)孔。

1.6 Western blotting檢測

提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用BCA將各樣品蛋白定量。本實驗采用濃度為4%的濃縮膠，濃度為8%和10%的分離膠。經(jīng)SDS?PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗（稀釋比例1∶400），孵育二抗（稀釋比例1∶2 000），ECL底物發(fā)光。內(nèi)參抗體選用GAPDH?HRP，稀釋比例為1∶10 000。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實時PCR檢測轉(zhuǎn)染效率

結(jié)果顯示，ING4在EV組表達為（0.844±0.086），ING4組48 h后表達（14.589±0.117）顯著升高（t= 473.89，P=0.001），ING4 siRNA組表達（0.207± 0.083）與CON sRNA組（1.013±0.109）比較下降（t= 41.00，P=0.001）。

2.2 MTT實驗檢測細(xì)胞增殖

MTT實驗結(jié)果顯示：HUVECs轉(zhuǎn)染ING4質(zhì)粒后，與對照組比較增殖活性降低，而轉(zhuǎn)染ING4 siRNA則能夠促進HUVECs的增殖。見表1。

表1 ING4對各組細(xì)胞HUVECs增殖的影響（）Tab.1 Effect of ING4 on the proliferation of HUVECs（）

表1 ING4對各組細(xì)胞HUVECs增殖的影響（）Tab.1 Effect of ING4 on the proliferation of HUVECs（）

1）P＜0.05 vs EV group；2）P＜0.01 vs CON siRNA group.

Group HUVECs proliferation 1 d 2 d 3 d 4 d EV 0.211±0.074 0.624±0.085 0.845±0.107 1.211±0.081 ING4 0.229±0.109 0.403±0.1031） 0.781±0.1211） 0.831±0.1141）CON siRNA 0.303±0.114 0.738±0.117 0.934±0.094 1.198±0.096 ING4 siRNA 0.218±0.097 0.804±0.1092） 1.197±0.0792） 1.572±0.1252）

2.3 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移

結(jié)果顯示：EV組、ING4組、Con siRNA組和ING4 siRNA組細(xì)胞遷移分別為48.571±0.324、32.049±0.179、39.213±0.204、60.017±0.331。與EV組比較ING4組細(xì)胞遷移差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 23.780，P=0.002）；與Con siRNA組比較，ING4 siRNA組細(xì)胞遷移差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（t=32.215，P= 0.001）。HUVECs轉(zhuǎn)染ING4質(zhì)粒能夠降低細(xì)胞的遷移能力，而轉(zhuǎn)染ING4siRNA后，HUVECs的遷移能力增強，見圖1。

圖1 ING4對各組細(xì)胞HUVECs遷移的影響 ×200Fig.1 Effect of ING4 on the migration of HUVECs in groups×200

2.4 實時PCR檢測血管形成相關(guān)因子mRNA表達

VEGF、MMP?2、MMP?9mRNA表達結(jié)果顯示，ING4組與EV組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為12.488、7.563、12.124，P分別為0.006、0.017、0.007）；ING4 siRNA與CON siRNA比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為4.850、7.361、26.050，P分別為0.040、0.018、0.001）。在mRNA水平，過表達ING4能夠抑制血管形成相關(guān)因子VEGF、MMP?2、MMP?9的表達水平，而轉(zhuǎn)染ING4 siRNA則能夠增強其表達。見表2。

2.5 Western blotting檢測血管形成相關(guān)因子蛋白表達

VEGF、MMP?2、MMP?9蛋白表達檢測結(jié)果顯示，ING4組與EV組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為23.305、22.360、13.777，P分別為0.002、0.002、0.005）；ING4 siRNA與CON siRNA比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為27.471、21.599、24.750，P分別為0.001、0.002、0.024），結(jié)果與PCR實驗一致。見表3、圖2。在蛋白水平，過表達ING4能夠抑制血管形成相關(guān)因子VEGF、MMP?2、MMP?9的表達水平，而轉(zhuǎn)染ING4 siRNA則能夠增強其表達。

表2 ING4對血管形成相關(guān)因子VEGF、MMP?2、MMP?9mRNA表達的影響Tab.2 Effect of ING4 on mRNA levels ofVEGF，MMP?2andMMP?9

圖2 Western blotting檢測ING4對血管形成相關(guān)因子表達的影響Fig.2 Effect of ING4 on the protein expression of angiogenesis related factors

3 討論

血管形成是人體內(nèi)的一種非常重要的過程，不僅參與組織再生、創(chuàng)傷愈合等生理過程，還參與許多疾病的病理過程。生長期的腫瘤如同發(fā)育中的器官，腫瘤組織中血管形成的作用與器官發(fā)生中同樣重要［9-10］。

在缺血、缺氧條件下，VEGF表達上調(diào)能夠保持內(nèi)皮細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并能夠調(diào)節(jié)血管的通透性，進而促進血管的生成。MMP能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)、促進內(nèi)皮細(xì)胞的游走和遷移。缺氧是腫瘤微環(huán)境的一個重要特征，因此，抑制腫瘤微環(huán)境內(nèi)VEGF、MMP的表達能夠抑制腫瘤內(nèi)新血管的形成，進而抑制腫瘤的生長及侵襲。ING4基因是腫瘤抑制因子家族的新成員，近來研究［11］發(fā)現(xiàn)，ING基因在正常組織中表達豐富，但在多種惡性腫瘤組織（卵巢癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、惡性黑色素瘤、膠質(zhì)瘤、肺癌等）的表達明顯下調(diào)［1-8］。ING4基因定位于12p13?32區(qū)，由8個外顯子和7個內(nèi)含子構(gòu)成，范圍覆蓋約13 000個堿基對［12］。

表3 ING4對血管形成相關(guān)因子VEGF、MMP?2、MMP?9蛋白表達的影響Tab.3 Effect of ING4 on protein expression of VEGF，MMP?2 and MMP?9

大量研究顯示，ING4在大多數(shù)腫瘤組織中呈低表達，并且與腫瘤的惡性程度相關(guān)。GARKAVT?SEV等［11］研究發(fā)現(xiàn)，ING4mRNA的含量在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（WHOⅣ級）中較瘤旁正常的腦組織下降6倍多。CAO等［1］研究發(fā)現(xiàn)ING4蛋白在乳腺癌組織中的表達顯著低于良性乳腺增生組織，證明乳腺癌的發(fā)生也與ING4蛋白表達缺失有關(guān)。WANG等［5］的研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中ING4mRNA和蛋白表達水平均較癌旁正常組織顯著降低，且與非小細(xì)胞肺癌的病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈負(fù)相關(guān)。LI等［13］檢測ING4基因在惡性黑色素瘤中的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與痣相比，ING4的表達水平在惡性黑色素瘤中顯著降低，并且與瘤組織的厚度、潰瘍形成呈負(fù)相關(guān)，是黑色素瘤預(yù)后差的標(biāo)志物之一。LI等［6］的研究顯示ING4基因與頭頸部原發(fā)性鱗狀細(xì)胞癌的低分化狀態(tài)、TNM分期呈負(fù)相關(guān)。近期研究［8，14］顯示，ING4基因在結(jié)腸癌、胃腸道間質(zhì)瘤中也呈低表達，并且與腫瘤組織大小、病理分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等呈顯著相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ING4在HUVECs中表達，通過MTT及Transwell實驗證實，ING4對HUVECs具有直接調(diào)控作用，轉(zhuǎn)染ING4質(zhì)粒能夠抑制HUVECs的增殖及遷移，而轉(zhuǎn)染ING4 siRNA則能夠促進HUVECs增殖及遷移，并且，實時PCR及Western blotting實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染ING4質(zhì)粒能夠下調(diào)血管形成相關(guān)因子VEGF、MMP?2、MMP?9mRNA及蛋白的表達水平。

據(jù)文獻［15?20］報道，ING4基因?qū)δ[瘤的抑制作用表現(xiàn)為抑制腫瘤細(xì)胞的生長、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性以及抑制腫瘤血管的生成。在抑制腫瘤血管生成方面，SHI等［21］研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG中，ING4能夠通過與P65亞基結(jié)合，抑制NF?κB轉(zhuǎn)錄活性，使IL?8表達水平下降，從而使腫瘤組織內(nèi)的微血管密度降低，腫瘤血管生成減少。但也有研究［22］表明ING4可通過抑制HIF的活性，抑制IL?8的表達，進而抑制腫瘤血管的生成。目前對何種機制起主導(dǎo)作用，尚不清楚，仍需進一步實驗研究。

本研究發(fā)現(xiàn)ING4能夠直接作用于HUVECs，過表達ING4能夠抑制HUVECs的增殖及遷移，并能夠下調(diào)血管形成相關(guān)因子VEGF、MMP?2、MMP?9的表達水平，因此推測，ING4能過通過雙重作用抑制新血管的形成。

綜上所述，ING4不僅能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲，對血管內(nèi)皮細(xì)胞也具有直接的調(diào)控作用。本研究從全新角度探討了ING4的抗腫瘤作用機制，為腫瘤發(fā)生發(fā)展及靶向治療提供了新的理論依據(jù)。

［1］CAO F，WEI QJ，LU YJ，et al.The inhibitory effects of exogenousING4gene expression on the growth of breast cancer cells［J］.Tu?mor，2008，289（4）：301-304.DOI：10.3781/j.issn.1000?7431.2008. 04.007.

［2］TAPIA C，ZLOBEC I，SCHNEIDER S，et al.Deletion of the inhibi?tor of growth 4（ING4）tumor suppressor gene is prevalent in human epidermal growth factor 2（HER2）?positive breast cancer［J］.Hum Pathol，2011，42（7）：983-990.DOI：10.1016/j.humpath.2010.10. 012.

［3］LIU Y，YU L，WANG Y，et al.Expression of tumor suppressorgene ING4 in ovarian carcinoma is correlated with microvesseldensity［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2012，138（4）：647-655.DOI：10. 1007/s00432?011?1099?5.

［4］ZENG ZL，LI FJ，GAO F，et al.Upregulation of miR?650 is correlat?edwith down?regulation of ING4 and progression of hepatocellular carcinoma［J］.J Surg Oncol，2013，107（2）：105-110.DOI：10.1002/ jso.23210.

［5］WANG QS，LI M，ZHANG LY，et al.Down?regulation of ING4 is as?sociated with initiation and progression of lung cancer［J］.Histopa?thology，2010，57（2）：271-281.DOI：10.1111/j.1365?2559.2010. 03623.x.

［6］LI XH，KIKUCHI K，ZHENG Y.Downregulation and translocation of nuclear ING4 is correlated with tumorigenesis and progression of head and neck squamous cell carcinoma［J］.Oral Oncol，2011，47（3）：217-223.DOI：10.1016/j.oraloncology.2011.01.004.

［7］YOU Q，WANG XS，F(xiàn)U SB，et al.Downregulated expression of in?hibitor of growth 4（ING4）in advanced colorectal cancers：a non?randomizedexperimental study［J］.Pathol Oncol Res，2011，17（3）：473-477.DOI：10.1007/s12253?010?9301?7.

［8］NANDING A，TANG L，CAI L，et al.Low ING4 protein expression detectedby paraffin?section immunohistochemistry is associatedwith poor prognosis in untreatedpatients with gastrointestinal stromal?tumors［J］.Gastric Cancer，2014，17（1）：87-96.DOI：10.1007/s10 120?013?0248?8.

［9］FERRARA N，CHEN H，DAVIS?SMYTH T，et al.Vascular endo?thelial growthfactor is essential for Corpusluteum angiogenesis［J］. Nat Med，1998，4（3）：336-340.DOI：10.1038/nm0398?336.

［10］SCAPPATICCI FA.Mechanisms and future directions for angiogen?esis?basedcancertherapies［J］.J Clin Oncol，2002，20（18）：3906-3927.

［11］GARKAVTSEV I，KOZIN SV，CHENOVA OV，et a1.The candi?date tumor suppressor protein ING4 regulates brain tumor growth andangiogenesis［J］.Nature，2004，428（6980）：328-332.DOI：10.1038/nature02329.

［12］KIM S，CHIN K，GRAY JW，et al.A screen for genes that suppress loss of contact inhibition：identification of ING4 as a candidate tu?mor suppressor gene in human cancer［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（46）：16251-16256.DOI：10.1073/pnas.0407 158101.

［13］LI J，MARTINKA M，LI G.Role of ING4 in human melanoma cell migration，invasion and patient survival［J］.Carcinogenesis，2008，29（7）：1373-1379.DOI：10.1093/carcin/bgn086.

［14］LOU C，JIANG S.ING4 is negatively correlated with microves?seldensity in colon cancer［J］.Tumour Biol，2012，33（6）：2357-2364.DOI：10.1007/s13277?012?0498?9.

［15］SHISEKI M，NAGASHIMA M，PEDEUX RM，et al.p29ING4 and p28ING5 bind to p53 and p300，and enhance p53 activity［J］. Cancer Res，2003，63（10）：2373-2378.

［16］王金志，繆競誠，盛偉華，等.ING4基因真核表達載體的構(gòu)建及其功能［J］.解剖學(xué)雜志，2005，28（4）：383-386.

［17］王家融，韓亞麗，繆競誠，等.ING4及IL?24雙基因共表達腺病毒載體對MG?63人骨肉瘤細(xì)胞體外抑癌增效作用研究［J］.北華大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，14（3）：294-298.DOI：10.11713/j.issn.1009?4822.2013.03.010.

［18］XIE Y，SHENG W，MIAO J，et al.Enhanced antitumor activity by combining anadenovirus harboring ING4 with cisplatin for hepato?carcinoma cells［J］.Cancer Gene Ther，2011，18（3）：176-188. DOI：10.1038/cgt.2010.67.

［19］ZHANG XJ，YE H，ZENG CW，et al.Dysregulation of miR?15a and miR?214 in human pancreatic cancer［J］.J Hematol Oncol，2010，24（3）：46-54.DOI：10.1186/1756?8722?3?46.

［20］XIE YF，SHENG W，XIANG J，et al.Adenovirus?mediated ING4 expressionsuppresses pancreatic carcinoma cell growth via induc?tion of cell?cyclealteration，apoptosis，and inhibition of tumor an? giogenesis［J］.Cancer Biother Radiopharm，2009，24（2）：261-269.DOI：10.1089/cbr.2008.0582.

［21］SHI X，HONG T，WALTER KL，et al.ING2PDH domain links his?tone H3 lysine 4 methylation to active gene repression［J］.Nature，2006，442（7098）：96-99.DOI：10.1038/nature04835.

［22］COLLA S，TAGLIAFERRI S，MORANDI F，et al.The new tumor suppressor gene inhibitor of growth family member 4（ING4）regu?lates the production of proangiogenic molecules by myeloma cells and suppresses hypoxia inducible factor?1α（HIF?1α）activity be?ing involved in myeloma?inducedangiogenesis［J］.Blood，2007，110（13）：4464-4475.DOI：10.1182/blood?2007?02?074617.

（編輯 武玉欣）

Effects of Inhibitor of Growth 4 on the Proliferation，Migration and Expression of Angiogenesis Related Factors in Endothelial Cells

LI Yue，YANG Xianghong
（Department of Pathology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the effects of inhibitor of growth 4（ING4）on the proliferation，migration and the expression of angiogenesis related factors such as VEGF，MMP?2，MMP?9 in endothelial cells.Methods Human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）were cultured in vitro；ING4 plasmid and siRNA were constructed and transfected to HUVECs；the proliferation of HUVECs was evaluated by MTT assay；the ability of migration was evaluated by Transwell assay；real?time PCR and Western blotting were used to determine the expression of mRNA and pro?tein of angiogenesis related factors such as VEGF，MMP?2，and MMP?9.Results MTT and Transwell assay showed that ING4 has the ability to inhibit the proliferation and migration of HUVECs，and the results of real?time PCR and Western blotting proved that ING4 can inhibit the expres?sion of angiogenesis related factors such as VEGF，MMP?2，and MMP?9.Conclusion ING4 can inhibit the proliferation and migration of HU?VECs，down?regulate the expression of angiogenesis related factors such as VEGF，MMP?2，MMP?9，and inhibit angiogenesis.

inhibitor of growth 4；vascular endothelial cell；vascular endothelial growth factor；matrix metalloproteinase

R363.2

A

0258-4646（2017）02-0160-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.02.015

李悅（1984-），女，主治醫(yī)師，博士研究生.

楊向紅，E-mail：xhyang4933@vip.sina.com

2016-06-08

網(wǎng)絡(luò)出版時間：