曲耘，吳榮，張曉曄

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1.第二腫瘤科；2.第四腫瘤科，沈陽 110004）

NF?κB/p65 siRNA對小鼠Lewis肺癌移植瘤細(xì)胞凋亡和Bax表達(dá)的影響

曲耘1，吳榮1，張曉曄2

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1.第二腫瘤科；2.第四腫瘤科，沈陽 110004）

目的 研究p65siRNA抑制NF?κB/p65信號通路對小鼠Lewis肺癌移植瘤細(xì)胞凋亡和Bax表達(dá)的影響。方法 采用Lewis肺癌細(xì)胞C57BL/6雄性小鼠移植瘤組織懸液，建立C57BL/6雄性小鼠移植瘤模型。將NF?κB/p65 siRNA接種于荷瘤小鼠，觀察下調(diào)NF?κB/p65表達(dá)后荷瘤小鼠瘤細(xì)胞凋亡情況。進(jìn)一步應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting檢測腫瘤組織中BaxmRNA及蛋白表達(dá)變化。結(jié)果 經(jīng)p65 siRNA治療后，小鼠腫瘤細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，腫瘤組織BaxmRNA及蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。結(jié)論 NF?κB/p65通路可能在Lewis肺癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

NF?κB/p65；Lewis肺癌；凋亡；siRNA；移植瘤；Bax

隨著大氣污染的日趨嚴(yán)重，肺癌已成為腫瘤中的頭號殺手，嚴(yán)重威脅人類健康。傳統(tǒng)的放化療已經(jīng)不能滿足中晚期肺癌患者的需求，人們迫切地希望找到更加行之有效的肺癌治療方法。肺癌的分子靶向治療因具有特異性強(qiáng)、不良反應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)，獲得了高度廣泛的關(guān)注。

核因子κB（nuclear factor kappaB，NF?κB）是由Rel/NF?κB家族的多肽成員所形成的一組二聚體形式的轉(zhuǎn)錄因子的統(tǒng)稱，首次被確認(rèn)于1986年［1］。NF?κB以同源或異源二聚體的形式存在于大多數(shù)細(xì)胞的胞質(zhì)中，常見的形式是由p50和p65組成的異源二聚體，其中，p65是其活性部分，與造血過程、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡等多種細(xì)胞功能有關(guān)。NF?κB在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中意義重大，其傳導(dǎo)通路通過調(diào)控Bax等多種下游凋亡基因控制腫瘤細(xì)胞的凋亡［1?2］。研究［3?5］顯示，NF?κB信號通路在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。已有研究［6?7］報(bào)道，p65與肺癌病理類型相關(guān)。以NF?κB為靶點(diǎn)的新藥開發(fā)有望成為肺癌靶向治療新的探索方向［8?9］。

siRNA技術(shù)是通過內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA特異性誘發(fā)同源mRNA沉默，進(jìn)而抑制其相應(yīng)基因的表達(dá)，從而阻斷該基因的生理或病理作用。該技術(shù)為癌癥的靶向藥研制和臨床治療奠定了基礎(chǔ)。

本研究擬通過體外建立裸鼠移植瘤模型并給予其p65 siRNA腹腔注射，檢測小鼠瘤細(xì)胞凋亡情況及Bax的表達(dá)，旨在探討B(tài)ax與p65的關(guān)系，闡述Bax在肺癌凋亡中的作用，為靶向藥的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇凍存的Lewis細(xì)胞（北京金紫晶公司）。將復(fù)蘇后的細(xì)胞在含有10%胎牛血清（美國Hyclone公司）、100 U/mL青霉素和100 pg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco公司）中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、相對飽和濕度、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 Lewis肺癌小鼠移植瘤模型的建立及分組

雄性健康清潔級C57BL/6小鼠18只（中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），6～8周齡，體質(zhì)量200 g。取3只小鼠，在每只小鼠右前肢腋下皮下注射Lewis肺癌細(xì)胞懸液0.5 mL（細(xì)胞數(shù)約為1×107）。2周后，小鼠右前肢腋下均形成皮下瘤。將小鼠脫頸椎處死，無菌取出瘤組織，用生理鹽水進(jìn)行研磨，離心，制成細(xì)胞懸液。在另外15只小鼠右前肢腋下皮下注射Lewis肺癌細(xì)胞懸液0.2 mL（細(xì)胞數(shù)約為5×106），1周后開始治療。將小鼠隨機(jī)分成3組，每組5只。（1）PBS對照組：每隔1 d給予小鼠腹腔注射PBS；（2）對照siRNA組：每隔1 d給予小鼠腹腔注射無關(guān)對照siRNA（終濃度為100 nmol/L）；（3）p65 siRNA組：每隔1 d給予小鼠腹腔注射p65 siRNA（終濃度為100 nmol/L）。2周后，將小鼠脫頸椎處死，取出瘤組織進(jìn)行檢測。

1.3 細(xì)胞凋亡的TUNEL原位檢測

固定瘤組織，修塊，脫水，透蠟，包埋。用切片機(jī)切制5 μm的石蠟標(biāo)本薄片，并制成切片。按照TUNEL檢測試劑盒（中國天根生化科技有限公司）說明書，檢測切片瘤組織中的細(xì)胞凋亡情況。隨機(jī)在每張切片上選取5個(gè)高倍視野（×200），計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞核內(nèi)見棕黃色顆粒的細(xì)胞為TUNELFH性細(xì)胞。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR法分析BaxmRNA表達(dá)水平

按照總RNA提取試劑盒（中國天根生化科技有限公司）說明書提取總RNA。用TIANScript RT Kit（TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒，中國天根生化科技有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得用于PCR反應(yīng)的對應(yīng)的cDNA。

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol/L，上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1）各0.5 μL，SYBR GREEN mas?termix 10 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；最后1個(gè)循環(huán)結(jié)束后，4℃放置5 min以終止反應(yīng)。本研究采用韓國BI?ONEER公司生產(chǎn)的ExicyclerTM 96熒光定量儀進(jìn)行熒光定量分析。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Tab.1 Oligonucleotide primer sets for real?time PCR

1.5 Western blotting印跡法檢測蛋白表達(dá)

將100 μL RIPA裂解液加入20 mg腫瘤組織中，于冰上制成勻漿，4℃下12 000 r/min離心10 min，分離上清，檢測蛋白濃度。采用10%SDS?PAGE電泳分離蛋白，上樣量為40 μg，上樣體積為20 μL。電泳后制備“三明治”，經(jīng)過轉(zhuǎn)印將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。以5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入1∶400稀釋的抗p65一抗（美國Santa Cruz公司）和1∶1 000稀釋的抗Bax一抗（美國Santa Cruz公司），經(jīng)過洗膜，再加入1∶5 000稀釋的p65和Bax的二抗（美國Santa Cruz公司），37℃下反應(yīng)60 min，暗室內(nèi)曝光。采用Gene Tools軟件分析目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用表示。采用單因素方差分析進(jìn)行多個(gè)樣本間均數(shù)比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p65 siRNA對小鼠移植瘤細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL檢測結(jié)果表明，p65 siRNA組細(xì)胞凋亡數(shù)（271±11）明顯高于PBS對照組（45±5）和對照siRNA組（38±4），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。提示p65 siRNA能夠促進(jìn)小鼠移植瘤細(xì)胞凋亡。

2.2 p65 siRNA對小鼠移植瘤中Bax表達(dá)的影響

RT?PCR結(jié)果顯示，p65 siRNA組BaxmRNA的表達(dá)明顯高于PBS對照組和對照siRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2C。

Western blotting結(jié)果顯示，與PBS對照組和對照siRNA組相比，p65 siRNA組中Bax蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)，見圖2A、2B。

圖1 NF?κB/p65 siRNA對小鼠移植瘤細(xì)胞凋亡的影響 DAB×400Fig.1 Effects of NF?κB/p65 siRNA on apoptosis of tumor cells in xenografted nude mice DAB×400

圖2 NF?κB/p65 siRNA對小鼠移植瘤細(xì)胞Bax表達(dá)的影響Fig.2 Effects of NF?κB/p65 siRNA on Bax expressions in nude mice Lewis tumor cells xenografts

3 討論

肺癌發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年上升，為全球癌癥致死的最常見原因之一。許多患者在就診時(shí)已屬晚期，進(jìn)一步探究肺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，對肺癌的系統(tǒng)治療具有深刻的意義。研究［8?12］表明，Bax在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞DNA損傷后，p53基因表達(dá)增強(qiáng)，由于p53對Bax有正調(diào)控作用，Bax也隨之表達(dá)增強(qiáng)。Bax在線粒體膜上與膜共同形成滲透性膜轉(zhuǎn)移孔復(fù)合物，間接激活Caspase?3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13?15］。NF?κB常見的存在形式是由p50和P65組成的異源二聚體［16］。NF?κB傳導(dǎo)通路通過調(diào)控包括Bax在內(nèi)的多種下游凋亡基因來控制腫瘤細(xì)胞的凋亡。

本研究探討了NF?κB/p65通路在Lewis肺癌中對凋亡的影響及其對Bax表達(dá)水平的影響。本研究首先建立了Lewis肺癌C57BL/6小鼠移植瘤模型，然后給予移植瘤小鼠p65 siRNA腹腔注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lewis肺癌C57BL/6小鼠移植瘤細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡。隨后，本研究采用RT?PCR和Western blotting檢測了BaxmRNA及蛋白表達(dá)水平的變化情況，結(jié)果顯示，p65 siRNA組小鼠移植瘤細(xì)胞中Bax的表達(dá)水平顯著高于PBS組和對照siRNA組。表明p65 siRNA能提高Bax的表達(dá)水平，促進(jìn)移植瘤細(xì)胞凋亡，推斷p65 siRNA對NF?κB/p65通路具有很強(qiáng)的抑制作用。

綜上所述，本研究結(jié)果初步顯示，p65 siRNA在體內(nèi)能顯著促進(jìn)Lewis肺癌細(xì)胞的凋亡，明顯上調(diào)Bax的表達(dá)，提示NF?κB信號途徑在C57BL/6小鼠Lewis肺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用，NF?κB/p65可能成為未來肺癌治療的分子靶點(diǎn)。

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（編輯 王又冬）

Effects of NF?κB/p65 siRNA on Apoptosis and Bax Expression in Lung Tumour Cell Xenografts of Nude Mouse

QU Yun1，WU Rong1，ZHANG Xiaoye2
（1.The Second Department of Oncology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.The Forth Department of Oncology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the effects of nuclear factor?kappaB（NF?κB）/p65 signaling transduction on the apoptosis and expressions of apoptosis?related genesBaxin nude mouse lung tumour cell xenografts.Methods The nude mice Lewis lung carcinoma cell xenograft model was established，and then the mice were intraperitoneally injected with NF?κB/p65 small interfering RNA（siRNA）.The apoptosis of xenografted tumor cells in nude mice was detected by TUNEL assay.Expressions ofBaxmRNA and protein were detected by RT?PCR and Western blotting. Results The result of TUNEL assay demonstrated that p65 siRNA evidently evoked cell apoptosis.Compared to the PBS treatment group or the normal control mice，both mRNA and protein expression levels of Bax in tumor xenografts were significantly up?regulated.There were significant differences among three groups（P＜0.05）.Conclusion NF?κB/p65 subunit may play an essential role in cell apoptosis of Lewis lung tumor.

NF?κB/p65；Lewis lung cancer；apoptosis；small interfering RNA；xenografts；Bax

R363.2

A

0258-4646（2017）02-0145-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.02.011

曲耘（1968-），女，主治醫(yī)師，博士.

張曉曄，E-mail：Xiaoyezhangcn@163.com

2016-06-06

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