張寶，孫磊，鄭陽，姜潔璇，金鎮(zhèn)

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽110004）

·論著·

性激素結(jié)合球蛋白、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在妊娠期糖尿病胎盤組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析

張寶，孫磊，鄭陽，姜潔璇，金鎮(zhèn)

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽110004）

目的 研究妊娠期糖尿病（GDM）孕婦胎盤組織中性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，探討其在GDM發(fā)病過程中的作用。方法 收集足月妊娠且非肥胖（BMI＜25 kg/m2）GDM孕婦（GDM組）和同期糖代謝正常（正常組）孕婦胎盤組織各10例，應(yīng)用Western blotting、實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)2組胎盤組織中SHBG和胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白（IRS?1、ISR?2、PI3K p85α）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT?1、GLUT?3、GLUT?4）的表達(dá)，各指標(biāo)進(jìn)行直線回歸依存關(guān)系分析。結(jié)果 與正常組比較，GDM組胎盤組織中SHBGmRNA、蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；IRS?1蛋白、IRS?2mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）；PI3K p85α和GLUT?1蛋白及其mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；GLUT?3蛋白，GLUT?4mRNA、蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。直線回歸分析結(jié)果顯示SHBGmRNA與IRS?2mRNA、PI3K p85αmRNA、GLUT?4mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)（均P＜0.05）；IRS?2mRNA和GLUT?4mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.01）；IRS?1mRNA和PI3K p85αmRNA、GLUT?3mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；IRS?2mRNA和GLUT?1mRNA的表達(dá)正相關(guān)（P＜0.01）。結(jié)論 GDM孕婦胎盤中胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在異常，SHBG可能參與胰島素信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，GDM時(shí)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞合成和分泌SHBG減少，引起胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)降低，從而導(dǎo)致胰島素抵抗及GDM的發(fā)生。

妊娠期糖尿??；性激素結(jié)合蛋白；胰島素抵抗；胰島素受體底物；磷脂酰肌醇?3?激酶；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

性激素結(jié)合球蛋白（sex hormone?binding globu?lin，SHBG）是妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mel?litus，GDM）發(fā)病程度和預(yù)后的判定指標(biāo)，參與包括胰島素抵抗在內(nèi)的代謝綜合征的發(fā)生［1］，是胰島素抵抗的一個(gè)標(biāo)志［2］，在GDM發(fā)病中起重要作用。胰島素信號(hào)傳遞介導(dǎo)細(xì)胞攝取葡萄糖：胰島素與其受體α亞基結(jié)合后，誘發(fā)β亞基的酪氨酸殘基自身磷酸化，并激活胰島素受體的酪氨酸激酶，使胰島素受體底物1（insulin receptor substrate?1，IRS?1）和IRS?2的多個(gè)酪氨酸殘基磷酸化，進(jìn)一步非共價(jià)結(jié)合下游效應(yīng)分子磷脂酰肌醇?3?激酶（phosphatidylinositol 3?kinase，PI3K）調(diào)節(jié)單位p85α，激活的PI3K調(diào)節(jié)末端葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose transport protein，GLUT）［3?4］，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)改變都可導(dǎo)致胰島素生物效應(yīng)降低［5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)孕期應(yīng)用胰島素治療的GDM胎盤GLUT?4、PI3K蛋白和mRNA表達(dá)均減少，IRS?1蛋白表達(dá)明顯增加，IRS?2蛋白表達(dá)下降。本研究應(yīng)用Western blotting和實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)GDM和正常孕婦胎盤中SHBG、IRS?1、IRS?2和GLUT的表達(dá)情況及其相關(guān)性，旨在進(jìn)一步探討SH?BG是否影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而導(dǎo)致胰島素抵抗及GDM的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

兔單克隆抗SHBG抗體、鼠單克隆GLUT?1抗體、兔多克隆抗GLUT?3抗體、鼠單克隆抗GLUT?4抗體、兔單克隆抗IRS?1抗體、兔單克隆抗IRS?2抗體、兔單克隆抗PI3K p85α抗體均購自英國Abcam公司。RNA引物由上海生工生物合成，TRIzol（Invi?trogen）和ABI high capacity cDNA RT kit（Applied Biosystems）逆轉(zhuǎn)錄盒及實(shí)時(shí)PCR相關(guān)試劑均購自日本TaKaRa公司。

1.2 研究對(duì)象及納入標(biāo)準(zhǔn)

本研究在孕婦知情同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)同意后進(jìn)行。選取2015年4月至2015年8月期間中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院定期就診產(chǎn)檢，住院符合剖宮產(chǎn)手術(shù)指征，擇期剖宮產(chǎn)單胎足月（妊娠38～40周）孕婦。體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）＞25 kg/m2會(huì)增加Ⅱ型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)［7］，因此選擇BMI＜25 kg/m2非肥胖的GDM（GDM組）和同期糖代謝正常（正常組）孕婦的胎盤組織，每組各10例。

2組孕婦納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）孕前無糖尿病、高血壓病、及心、肝、腎疾病病史；（2）無多囊卵巢綜合征、垂體、腎上腺、甲狀腺等內(nèi)分泌疾?。唬?）孕前及孕期未使用皮質(zhì)激素類藥物，未使用胰島素類藥物，或近1周未使用影響糖脂代謝藥物；（4）無多胎、胎兒畸形、胎兒宮內(nèi)生長受限或死胎分娩史；（5）近期無炎癥、感染及創(chuàng)傷等其他應(yīng)激狀態(tài)；（6）產(chǎn)檢及分娩資料完整的孕產(chǎn)婦；（7）無煙酒不良嗜好。采用2010年國際糖尿病與妊娠研究組推薦的GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］：妊娠24～28周，口服75 g葡萄糖行糖耐量試驗(yàn)（OGTT），診斷臨界值為空腹、服糖后1 h和2 h的血糖分別為5.1 mmol/L、10.0 mmol/L和8.5 mmol/L，其中任何一項(xiàng)達(dá)到或超過界值即診斷為GDM。

1.3 標(biāo)本收集

胎盤娩出后，立即在臍帶附著處胎盤母體面底板區(qū)中央帶隨機(jī)取3塊絨毛組織（約1 cm×1 cm×1 cm），冷生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干后儲(chǔ)存在凍存管中，快速置于液氮中速凍4 h后-80℃貯存，用于胎盤組織mRNA的提取和胎盤組織SHBG和胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白的測(cè)定。

1.4 方法

1.4.1 Western blotting檢測(cè)：提取總蛋白，加入裂解液充分裂解，低溫高速離心（4℃，12 000 r/min，15 min），提取上清為總蛋白。蛋白上樣量為40 μg。電泳（10%SDS?PAGE凝膠）、轉(zhuǎn)?。?5 V，90 min）、5%正常小牛血清封閉，一抗SHBG（1∶200，兔抗人單克隆IgG）、GLUT?1（1∶200，鼠抗人單克隆IgG）、GLUT?3（1∶200，兔抗人多克隆IgG）、GLUT?4（1∶200，兔抗人單克隆IgG）、IRS?1（1∶200，兔抗人單克隆IgG）、ISR?2（1∶200，兔抗人單克隆IgG）、PI3K p85α（1∶200，兔抗人單克隆IgG）、cyclin D1（1∶1 000，美國Cell Signaling公司），4℃孵育過夜，分別與對(duì)應(yīng)的二抗（1∶2 500，美國Santa Cruz公司）室溫孵育2 h，ECL顯色，結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀（Chemi Im?ager 5500，美國Alpha Innotech公司）采集后進(jìn)行灰度值測(cè)定。

1.4.2 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)：實(shí)時(shí)PCR采用ABI（Applied Biosystems）SYBR Green Mastermix試劑盒。使用ABI 7500快速實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)，循環(huán)周期設(shè)定如下：95℃30 s，95℃5 s 40個(gè)循環(huán)，60℃30 s目的基因的相對(duì)表達(dá)量通過2-ΔΔCt方法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。引物序列：內(nèi)參照β?actin上游引物5’?ATAG CACAGCCTGGATAGCAACGTAC?3’，下游引物5’?CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG?3’；SHBG上游引物為5’?CACTAGCCTCAGAAGCTGTGATGT?3’，下游引物為5’?GATTGAATTCTGCCTGAGTCCCT?3’；IRS?1上游引物為5’?GTCTGTCGTCCAGTAGCACC AG?3’，下游引物為5’?GGAACCAGACACCGAAGC ACT?3’；IRS?2上游引物為5’?CGCAGAACATCCAC GAGACC?3’，下游引物為5’?ACCCCGACGATTGGC TCT?3’；PI3Kp85α上游引物為5’?CGAGATGGCACT TTTCTTGTCC?3’，下游引物為5’?ATGCTTTACTTCG CCGTCCAC?3’；GLUT?1上游引物為5’?CCATTGGC TCCGGTATCGTC?3’，下游引物為5’?GCTCGCTCCA CCACAAACAG?3’；GLUT?3上游引物為5’?CCTTTG GCACTCTCAACCAGC?3’，下游引物為5’?AACCCA GTAGCAGCGGCCAT?3’；GLUT?4上游引物為5’?CC CTGATCATTGCGGTCGT?3’，下游引物為5’?CTGGC CTACCCCTGCTGTCT?3’。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

2組孕婦年齡均在25～34歲，孕次1～3次，產(chǎn)次0～1次（既往可合并剖宮產(chǎn)手術(shù)史），月經(jīng)周期規(guī)律。GDM組與正常組BMI、促甲狀腺激素、血清游離甲狀腺素和獲取胎盤孕周均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。GDM組患者空腹血糖、OGTT 1 h血糖、OGTT 2 h血糖、新生兒體質(zhì)量均高于正常組（均P＜0.05），見表1。

表1 2組患者臨床資料分析Tab.1 General clinical data of patients in the two groups

2.2 GDM組和正常組胎盤組織SHBG、IRS?1、IRS?2以及GLUT蛋白和mRNA表達(dá)比較

GDM組與正常孕婦胎盤組織中均存在SHBG表達(dá)，與正常組比較SHBG蛋白和mRNA表達(dá)均降低（均P＜0.05）。與正常組比較，GDM組孕婦胎盤組織中IRS?1蛋白、IRS?2mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），而IRS?1mRNA、IRS?2蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；PI3K p85α蛋白與mRNA表達(dá)均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與正常組比較，GDM組胎盤組織中GLUT?1蛋白、mRNA表達(dá)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；GLUT?3、GLUT?4蛋白呈現(xiàn)明顯低表達(dá)（P＜0.01），而GLUT?3mRNA表達(dá)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；GLUT?4mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖1、表2、表3。

2.3SHBGmRNA與其他指標(biāo)直線回歸依存關(guān)系分析

圖1 GDM組和正常組胎盤組織SHBG、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)通路信號(hào)分子蛋白表達(dá)比較Fig.1 The representative Western blotting results of protein expressions of SHBG，IRS?1，IRS?2，PI3K p85α，GLUT?1，GLUT?3，and GLUT?4 in normal and GDM placental tissue

表2 GDM組和正常組胎盤組織SHBG、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)通路信號(hào)分子蛋白表達(dá)比較Tab.2 Comparison of the protein expressions of SHBG，IRS?1，IRS?2，PI3K p85α，GLUT?1，GLUT?3，and GLUT?4 in normal and GDM placental tissue

表3 GDM組和正常組胎盤組織SHBG、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)通路信號(hào)分子mRNA表達(dá)比較Tab.3 Comparison of mRNA expressions ofSHBG，GLUT?1，GLUT?3，GLUT?4，IRS?1，IRS?2，andPI3K p85αin GDM and normal pla?cental tissue

直線回歸結(jié)果顯示，SHBGmRNA與IRS?2mRNA、PI3K p85αmRNA、GLUT?4mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)；IRS?2mRNA與GLUT?4mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)；IRS?1mRNA與PI3K p85αmRNA、GLUT?3 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；IRS?2mRNA與GLUT?1mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)（均P＜0.05），見圖2。

3 討論

SHBG具有激素樣作用，介導(dǎo)激素信號(hào)傳導(dǎo)，特異性地結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)性激素；還可以通過與某些組織受體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能［9］。GDM與正常孕婦胎盤中均存在SHBG表達(dá)，與正常組比較SHBG蛋白、mRNA表達(dá)都降低（P＜0.05）。IRS在胰島素受體通路中作為連接胰島素受體（insulin receptor，IR）與PI3K p85α蛋白之間一個(gè)重要的傳遞介質(zhì)，輔助胰島素在細(xì)胞的生長與代謝中發(fā)揮多效性作用。結(jié)果顯示GDM孕婦胎盤中IRS?1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。TOMAZIC等［10］實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)GDM孕婦骨骼肌和脂肪組織中IRS?1蛋白表達(dá)降低。

GLUT作為載體蛋白將單糖轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞，是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的最終步驟，其表達(dá)含量異常影響機(jī)體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)。既往研究［2］結(jié)果表明，GLUT?1是足月胎盤中主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體，負(fù)責(zé)母體循環(huán)與胎盤之間葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，GLUT?3確保葡萄糖從胎盤血池轉(zhuǎn)運(yùn)到臍靜脈。胰島素敏感型GLUT?4參與胎盤絨毛的葡萄糖代謝，動(dòng)力學(xué)研究［11］證實(shí)胰島素可增加GLUT?4對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的最大速率，在胎盤組織中表達(dá)非常少，卻發(fā)揮重要作用。本研究中，GDM組GLUT?4無論在蛋白還是mRNA都存在低表達(dá)，GLUT?3蛋白呈現(xiàn)明顯的低表達(dá)（P＜0.01）。XING等［4］在患有糖尿病的孕婦胎盤組織中同樣發(fā)現(xiàn)GLUT?4蛋白和mRNA低表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。

GDM孕婦胎盤內(nèi)SHBG與GLUT?4表達(dá)呈現(xiàn)一致性降低，線性分析顯示SHBGmRNA與GLUT?4 mRNA的表達(dá)正相關(guān)（P＜0.01）；本研究組的前期實(shí)驗(yàn)［6］發(fā)現(xiàn)SHBG與GLUT?4的表達(dá)在蛋白水平也呈正相關(guān)，XING等［4］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胎盤中GLUT?4蛋白及其mRNA的表達(dá)降低與機(jī)體的胰島素抵抗程度相關(guān)，而絕非是循環(huán)中胰島素濃度的變化。SHBGmRNA與IRS?2mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）；IRS?2mRNA與GLUT?4mRNA同樣呈正相關(guān)（P= 0.002）；除此之外，IRS?2mRNA和GLUT?1mRNA的表達(dá)正相關(guān)（P=0.004）。胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中IRS?2似乎發(fā)揮更大作用。盡管2組PI3K p85α蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但GDM組PI3K p85αmRNA表達(dá)似乎存在異常，SHBGmRNA與PI3Kp85αmRNA的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。IRS?1mRNA與PI3K p85αmRNA、GLUT?3mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

綜上所述，GDM患者存在高胰島素血癥，胰島素對(duì)調(diào)節(jié)SHBG的代謝具有重要的作用，高胰島素血癥可導(dǎo)致循環(huán)血SHBG減少，繼而使性激素水平發(fā)生紊亂［7］，造成糖、脂肪代謝障礙，又進(jìn)一步加重了胰島素抵抗［12］。胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白表達(dá)的異常似乎伴隨SHBG的變化，SHBG濃度降低可能影響著相關(guān)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白分子，導(dǎo)致胎盤靶細(xì)胞攝取和利用葡萄糖障礙，與糖耐量異常密切相關(guān)，最終導(dǎo)致GDM的發(fā)生。

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（編輯 武玉欣）

Expression and Correlation of Sex Hormone?binding Globulin，Insulin Signal Transduction and Glucose Transporter Proteins in the Gestational Diabetes Mellitus Placental Tissue

ZHANG Bao，SUN Lei，ZHENG Yang，JIANG Jiexuan，JIN Zhen
（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To study the expression of sex hormone?binding globulin（SHBG），insulin signaling pathway and glucose transporter in placenta of pregnant women with gestational diabetes mellitus（GDM），and to explore its role in the pathogenesis of GDM.Methods A total of 10 full?term and non?obese（BMI＜25 kg/m2）pregnancy women diagnosed with GDM and 10 normal pregnant cases were recruited for the study. Placental tissues were collected respectively.The expression of protein and mRNA of SHBG and insulin signal transduction（IRS?1，ISR?2，PI3K p85α）and glucose transporter proteins（GLUT?1，GLUT?3，GLUT?4）in placental tissue were detected by real?time PCR and Western blotting. Pearson and linear regression analysis were used to evaluate the correlation among the related indicators.Results In the placental tissue of non?obese women，there existed a decrease（P＜0.05）in the expression of protein and mRNA of SHBG with a concurrent a decrease（P＜0.05）in the expression of protein and mRNA of GLUT?4 in GDM women compared with normal controls.Furthermore，a decrease（P＜0.05）of GLUT?3 and IRS?1 protein expression with lower（P＜0.05）IRS?2mRNA expression was also observed in placental tissue from GDM patients.No changes were found in PI3K p85αand GLUT?1 at both protein and mRNA levels（P＞0.05）.Results of linear correlation analysis showed that there were positive correlations betweenSHBGmRNA andIRS?2mRNA（P＜0.05），SHBGmRNA andPI3K p85αmRNA（P＜0.05），andSHBGmRNA and GLUT?4 mRNA（P＜0.05）.There was also a remarkable positive correlation betweenIRS?2mRNA andGLUT?4mRNA（P＜0.01）.There existed negative correlations betweenIRS?1mRNA and PI3K p85αmRNA（P＜0.05），andIRS?1mRNA andGLUT?3mRNA（P＜0.05）.There existed a remarkable positive correlation betweenIRS?2mRNA andGLUT?1mRNA（P＜0.01）.Conclusion The defective receptors of insulinsignaling pathway are present in GDM placental tissue.Decreased expression of SHBG may be involved in the regulation insulin signaling，leading to a concomitant decrease expression of relevant insulin signaling components in placental tissue，implying insulin resistance and developing GDM finally.

gestational diabetes mellitus；sex hormone?binding globulin；insulin resistance；insulin receptor substrate；phosphati?dylinositol 3?kinase；glucose transport protein

R714.256

A

0258-4646（2017）02-0097-06

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.02.001

國家自然科學(xué)基金（81170591）；沈陽市科技計(jì)劃（F11?262?9?46）

張寶（1990-），男，碩士研究生.

金鎮(zhèn)，E-mail：jinzhen66@yahoo.com.cn

2016-03-07

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：