莫之婧，鄭順心，周素芳

(廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧530021)

·論著·

CpG位點選擇對焦磷酸測序法檢測肝癌SMP30啟動子甲基化的影響

莫之婧，鄭順心，周素芳

(廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧530021)

目的 選擇適宜的CpG位點用于焦磷酸測序法檢測肝癌衰老標(biāo)記蛋白30(SMP30)啟動子甲基化。方法 提取人肝癌細(xì)胞系SMCC-7721和BEL-7404的基因組DNA，設(shè)計針對SMP30基因序列1和序列2的擴(kuò)增和測序引物，焦磷酸測序法檢測SMP30基因序列1和序列2中的CpG位點甲基化程度，并用Sanger測序法驗證序列2中出現(xiàn)的SNP位點。結(jié)果 SMCC-7721和BEL-7404細(xì)胞系中，SMP30基因序列1中6個CpG位點低甲基化，與SMP30基因低表達(dá)不符，且測序結(jié)果質(zhì)量評估均為失敗。SMP30基因序列2中6個CpG位點高甲基化，與SMP30基因低表達(dá)相符，前2個CpG位點均為通過，而后4個CpG位點均為失敗。去除第5和第6個CpG位點，只檢測SMP30基因序列2中poly(T)結(jié)構(gòu)前4個CpG位點，SMCC-7721細(xì)胞系中甲基化程度分別為100%、90%、100%和80%；BEL-7404細(xì)胞系中甲基化程度分別為100%、92%、100%和77%。除第3個CpG位點為失敗，其余CpG位點均為通過。Sanger測序顯示SMCC-7721和BEL-7404細(xì)胞系在第3個CpG位點前存在SNP位點，且均為A。結(jié)論 焦磷酸測序時選擇靠近基因轉(zhuǎn)錄起始點上游且在poly (T)結(jié)構(gòu)之前的CpG位點，測得的SMP30啟動子甲基化值較準(zhǔn)確。

肝癌；衰老標(biāo)記蛋白30;甲基化；焦磷酸測序

DNA甲基化是常見的表觀遺傳學(xué)修飾方式，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[1]。DNA甲基化的定量測定在病理情況下有重要意義[2]，檢測腫瘤相關(guān)基因的甲基化水平對腫瘤發(fā)生機(jī)制的闡明、腫瘤早期診斷和治療有重要意義[3]。衰老標(biāo)記蛋白30(SMP30)是肝癌相關(guān)抗原之一[4]。本課題組通過使用特異siRNA抑制人肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)SMP30表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖和侵襲能力增強(qiáng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)肝癌癌旁組織中SMP30 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均升高，而在癌灶組織中表達(dá)水平均降低[6]。研究[7～9]表明，高頻率的抑癌基因啟動子區(qū)域甲基化在肝細(xì)胞癌(HCC)是一普遍的、早期事件。SMP30在肝癌組織中表達(dá)水平下降現(xiàn)象可能是DNA甲基化發(fā)揮作用的結(jié)果。焦磷酸測序法采用的是邊合成邊測序的方法，摻入核苷酸后釋放的焦磷酸可生成等量的ATP，ATP經(jīng)酶轉(zhuǎn)化成相應(yīng)比例的光信號，根據(jù)加入的核苷酸類型和測得的光信號強(qiáng)度可實時記錄模板DNA的核苷酸序列[10]。用焦磷酸測序法分析DNA甲基化模式，只需經(jīng)簡單反應(yīng)，就能獲得若干個CpG位點的精確甲基化值，且重復(fù)性好[11]。然而，在應(yīng)用焦磷酸測序法進(jìn)行甲基化測定時，常因CpG位點的選擇不當(dāng)或序列存在poly (T) 結(jié)構(gòu)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點，無法得到高質(zhì)量的測序結(jié)果。2014年9月,本研究以SMP30基因CpG島為研究對象，采用焦磷酸測序法檢測其甲基化狀況，研究上述情況下對DNA甲基化測定的影響，并優(yōu)化檢測方法，以獲得準(zhǔn)確可靠的SMP30啟動子甲基化檢查結(jié)果，為進(jìn)一步研究甲基化水平與腫瘤發(fā)生的關(guān)系奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 SMCC-7721和BEL-7404細(xì)胞系購自復(fù)旦IBS細(xì)胞資源中心。用含10%胎牛血清(Gbico公司)的高糖DMEM培養(yǎng)液(Gbico公司)，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。臺式高速離心機(jī)(Thermo公司)；BIO RAD POWER PAC 3000(BIO RAD公司)；BIO RAD DNA SUB CELL(BIO RAD公司)；ABI 9700 PCR 擴(kuò)增儀(Applied Biosystems公司)；NanoDrop ND-2000微量紫外分光光度計(Thermo公司)；凝膠成像系統(tǒng) GIS-1600(上海天能公司)；PyroMark Q96 ID焦磷酸測序儀(Qiagen公司)。

1.2 SMCC-7721和BEL-7404細(xì)胞系中SMP30基因表達(dá)檢測 細(xì)胞系總RNA提取使用RNA提取試劑盒(Omega公司)，按照RT-PCR試劑盒(Takara)說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。SMP30基因熒光定量PCR上游引物:5′-GTGGATGCCTTTGACTATGACC-3′，下游引物:5′-CTTCCCCTCAGCATCAATACAC-3′；GAPDH為內(nèi)參，上游引物:5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物:5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)體系為20 μL，其中cDNA 2 μL，引物0.8 μL，SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL和ROX 0.4 μL，加超純水補(bǔ)齊至20 μL。

1.3 SMP30啟動子甲基化檢測方法 在UCSC Genome Browser(http://www.genome.ucsc.edu/)上查找SMP30基因的CpG島序列，其CpG島位于chrX:46937632-46938149，長度為518個堿基，含45個CpG位點。下游引物5′端由生物素修飾。序列1：上游引物:5′-TTGTTAGGGGAGGTTTTGTAGGATT-3′，下游引物:5′-ACTTAACAAATAAATAACATAAACCTAAA-3′，測序引物:5′-GGGAGGTTTTGTAGGATTTT-3′；序列2：上游引物:5′-GGGGAGGGGTTTTAGGTTTATGT-3′，下游引物:5′-ATCTCCTTCTAACAATCAACTATCA-3′，測序引物:5′-GGGTTTTAGGTTTATGTTATTTAT-3′。細(xì)胞系DNA提取按DNA提取試劑盒(Axygen)說明書進(jìn)行，然后按照甲基化修飾試劑盒(Qiagen)說明書對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸鹽處理，使DNA中的無甲基化修飾的C轉(zhuǎn)化為U，然后通過PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化為T。焦磷酸測序：PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中模板2 μL，5×buffer GC 10 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.2 μL，dNTP(10 mmol/L) 1 μL,上下游引物各1 μL，加超純水補(bǔ)齊至50 μL。焦磷酸測序模板擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s， 54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)；72 ℃ 7 min。

1.4 序列1甲基化程度檢測 選擇SMP30基因轉(zhuǎn)錄起始點上游序列1的6個CpG位點,焦磷酸測序法檢測甲基化程度。

1.5 序列2甲基化程度檢測 選擇SMP30基因轉(zhuǎn)錄起始點上游序列2的6個CpG位點檢測甲基化程度。當(dāng)只檢測序列2中前4個CpG位點甲基化值時，用焦磷酸測序儀自帶軟件 PyroMark Assay Design編輯程序時，選擇不分析后2個CpG位點甲基化值。

1.6 SNP位點Sanger測序方法 樣品總DNA送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行Sanger測序。

2 結(jié)果

2.1 SMCC-7721和BEL-7404細(xì)胞系中SMP30基因表達(dá)水平 SMP30基因在SMCC-7721和BEL-7404細(xì)胞系中均呈低表達(dá)(表1)。

2.2 序列1甲基化程度檢測結(jié)果 SMCC-7721細(xì)胞系6個CpG位點甲基化程度分別為39.61%、16.94%、18.23%、17.83%、19.62%和12.29%；BEL-7404細(xì)胞系6個CpG位點甲基化程度分別為42.02%、17.84%、19.67%、20.22%、23.73%和16.74%(圖1)。甲基化程度不高，與SMP30基因在兩種細(xì)胞系中低表達(dá)不符，序列1的6個CpG位點未能顯示甲基化與基因表達(dá)量的負(fù)相關(guān)性，且測序結(jié)果質(zhì)量評估均為失敗。

表1 SMP30基因在SMCC-7721和BEL-7404細(xì)胞系中表達(dá)(±s)

圖1 CpG位點示意圖和熱解圖

2.3 序列2甲基化程度檢測結(jié)果 SMCC-7721細(xì)胞系 6個CpG位點甲基化程度分別為100%、100%、100%、84.64%、100%和100%，測序結(jié)果質(zhì)量評估顯示前2個CpG位點為通過，后4個CpG位點為失??；BEL-7404細(xì)胞系6個CpG位點甲基化程度分別為100%、100%、100%、74.31%、100%和100%(圖2A)。測序結(jié)果的質(zhì)量評估顯示前2個CpG位點為通過，后4個CpG位點為失敗。兩種細(xì)胞系的SMP30基因CpG位點均為高甲基化，與SMP30基因的低表達(dá)相符。第4個和第5個CpG位點之間有一段序列CGTTTCCCCTCCCCTCG經(jīng)亞硫酸鹽修飾轉(zhuǎn)化后，無甲基化修飾的C會轉(zhuǎn)變?yōu)門，序列轉(zhuǎn)變?yōu)镃GTTTTTTTTTTTTTCG，形成poly (T) 結(jié)構(gòu)(圖2B)，影響了測序質(zhì)量評估。

圖2 熱解圖和poly (T)結(jié)構(gòu)圖

SMCC-7721細(xì)胞系前4個CpG位點的甲基化程度分別為100%、90%、100%和80%(均值為92.5%)；BEL-7404細(xì)胞系前4個CpG位點甲基化程度分別為100%、92%、100%和77%(均值為92.25%)。見圖3。除第3個CpG位點為失敗，其余3個CpG位點均為通過。第3個CpG位點為失敗，提示該位點前某個位置可能存在SNP位點或突變，影響測序質(zhì)量評估。

2.4 Sanger測序驗證結(jié)果 查詢NCBI顯示SMP30基因轉(zhuǎn)錄起始點上游序列2的第3個CpG位點前有SNP位點：rs3814905，此SNP位點位于chrX:47078300-47078300，等位基因頻率為A:15.232%(575/3775)；G:84.768%(3200/3775)，G>A/G。采用焦磷酸測序法檢測此序列時，我們默認(rèn)此SNP位點為G。為驗證是否此SNP位點對焦磷酸測序法的質(zhì)量評估有影響，我們采用經(jīng)典的Sanger測序法對SMCC-7721和BEL-7404細(xì)胞系中此序列進(jìn)行測序。結(jié)果顯示SMCC-7721和BEL-7404細(xì)胞系此SNP位點均為A。

3 討論

基因CpG島的甲基化會顯著降低甚至完全沉默此基因的表達(dá)，基因CpG島的甲基化涉及多個CpG位點，不同CpG位點甲基化狀態(tài)對基因表達(dá)的調(diào)控作用不同[12]。SMP30基因的CpG島有45個CpG位點，焦磷酸測序法1次僅能檢測50～100 bp長度的序列，因此選擇合適的CpG位點尤其重要。

圖3 序列2前4個CpG位點焦磷酸測序熱解圖

序列2中6個CpG位點相比序列1更接近SMP30基因的轉(zhuǎn)錄起始點，從檢測結(jié)果看其高甲基化狀態(tài)更能體現(xiàn)對SMP30基因低表達(dá)的調(diào)控。

焦磷酸測序時，亞硫酸鹽修飾后的DNA序列中無甲基化修飾的C會轉(zhuǎn)變?yōu)閁，經(jīng)PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化為T，因此在富含CT的區(qū)域可能會形成poly (T)結(jié)構(gòu)，峰高不能達(dá)到預(yù)期值，從而質(zhì)量評估失敗。序列2中的第4和第5個CpG位點間存在poly (T)結(jié)構(gòu)，共有13個連續(xù)的T，峰高不可能達(dá)到13個T的高度，從而影響了poly (T)結(jié)構(gòu)前后的CpG位點甲基化質(zhì)量評估，測序質(zhì)量不佳。為了獲得高質(zhì)量的檢測結(jié)果，我們選擇焦磷酸測序時只測poly (T)結(jié)構(gòu)前面4個CpG位點，再次測序時質(zhì)量明顯上升，poly (T)結(jié)構(gòu)前的第4個CpG位點質(zhì)量評估由之前的失敗轉(zhuǎn)變?yōu)橥ㄟ^。可見，在焦磷酸測序時，如遇poly (T)結(jié)構(gòu)，可只測poly (T)結(jié)構(gòu)前的序列，提高測序質(zhì)量。在消除poly (T)結(jié)構(gòu)的影響后，序列2前4個CpG位點甲基化檢測結(jié)果中，第3個CpG位點質(zhì)量評估仍為失敗，表明第3個CpG位點以前某個位置可能存在突變或SNP位點，使峰高與預(yù)期峰不符，影響了測序質(zhì)量。為驗證我們的判斷，采用經(jīng)典的Sanger測序法，將測得的序列與NCBI中查得的對應(yīng)基因片段序列比對，發(fā)現(xiàn)確實在第3個CpG位點前有SNP位點：rs3814905，等位基因頻率G>A/G，我們預(yù)期的位點為G，Sanger測序結(jié)果表明實際位點為A，從而峰高與預(yù)期峰高不符，測序質(zhì)量的判斷是軟件分析位點前后的峰高判定的，所以當(dāng)待測序列與理論峰高不一致時會影響測序質(zhì)量的判定。而測序位點的甲基化比率是由C的峰高決定的，因此第3個CpG位點的甲基化值是可信的。

綜上所述，在用焦磷酸測序法檢測SMP30基因甲基化狀態(tài)時，我們選擇了靠近基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游的CpG位點，除去了poly (T)結(jié)構(gòu)的影響，并驗證了第3個CpG位點的甲基化質(zhì)量評估失敗是由SNP位點引起的，不影響第3個CpG位點甲基化值的準(zhǔn)確性，表明在肝癌細(xì)胞系中檢測到的SMP30啟動子高甲基化現(xiàn)象準(zhǔn)確可信。

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Effect of CpG site selection on SMP30 promoter methylation detection in hepatocellular carcinoma by pyrosequencing

MOZhijing,ZHENGShunxin,ZHOUSufang

(GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To determine appropriate CpG sites for senescence marker protein 30 (SMP30) promoter methylation detection in hepatocellular carcinoma using pyrosequencing. Methods Genomic DNA was isolated from human hepatocellular carcinoma cell lines SMCC-7721 and BEL-7404. The amplification and sequencing primers were designed for SMP30 gene sequence 1 and sequence 2, and the methylation status of CpG sites in SMP30 gene sequence 1 and sequence 2 was determined by pyrosequencing technology. Sanger sequencing was used to validate the SNP. Results In SMCC-7721 and BEL-7404 cell lines, the 6 CpG sites in SMP30 gene sequence 1 were low methylatied, which was not consistent with the low expression of SMP30 gene, and the quality of the sequencing results all failed. The 6 CpG sites in the SMP30 gene sequence 2 were highly methylated, which was consistent with the low expression of SMP30 gene, the first 2 CpG sites passed, and the last 4 CpG sites failed. The 5th and 6th CpG sites were ignored and only the first 4 CpG sites before the poly (T) structure in SMP30 gene sequence 2 were detected, the percentage of methylation in BCC-7721 cell line was 100%, 90%, 100% and 80%. The percentage of methylation in BEL-7404 cell line was 100%, 92%, 100% and 77%. Except for the 3th CpG site, the rest of the CpG sites passed. Sanger sequencing showed that SMCC-7721 and BEL-7404 cell lines had SNP sites before the 3th CpG site, and all of them were A. Conclusion Pyrosequencing methylation analysis of CpG sites near the upstream of transcription start site and before the poly (T) structure in SMP30 promoter is more accurate.

liver carcinoma; senescence marker protein 30; methylation; pyrosequencing

國家自然科學(xué)基金委員會資助項目(81460432)。

莫之婧(1981-)，女，碩士，主要研究方向為疾病的分子生物學(xué)。E-mail:36456198@qq.com

周素芳(1964-)，女，博士研究生，教授，主要研究方向為腫瘤抗原分子生物學(xué)。E-mail:zsf200000@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.001

R735.7

A

1002-266X(2017)09-0001-04

2016-11-19)