高楊楊，禾麗菲，李北興，林琎，慕衛(wèi)，劉峰

（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安 271018；2山東省蔬菜病蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018；3山東省高校農(nóng)藥毒理與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018；4山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥環(huán)境毒理研究中心，山東泰安 271018）

山東省辣椒炭疽病病原菌的鑒定及高效防治藥劑的篩選

高楊楊1,2，禾麗菲1,2，李北興3,4，林琎1,3，慕衛(wèi)1,4，劉峰1,3

（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安 271018；2山東省蔬菜病蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018；3山東省高校農(nóng)藥毒理與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018；4山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥環(huán)境毒理研究中心，山東泰安 271018）

【目的】明確山東省露地辣椒主產(chǎn)區(qū)炭疽病致病菌的種類，評(píng)價(jià)不同藥劑對(duì)致病菌的毒力和活體接種防效，篩選高效防治藥劑?！痉椒ā繌纳綎|省菏澤、濟(jì)寧等5個(gè)辣椒主產(chǎn)區(qū)采集感炭疽病的辣椒果實(shí)，經(jīng)分離、純化培養(yǎng)后，觀察菌落及分生孢子的形態(tài)、大小和病原菌的致病性，利用真菌通用引物ITS4和ITS5對(duì)4個(gè)典型代表菌株的rDNA-ITS進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收和測(cè)序，并利用MEGA 5.1軟件進(jìn)行基于病原菌的rDNA-ITS序列和GenBank中相關(guān)炭疽菌序列的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，確定病原菌的種類。采用菌絲生長(zhǎng)速率法和孢子萌發(fā)法測(cè)定11種殺菌劑對(duì)辣椒炭疽病菌的毒力，通過活體接種試驗(yàn)驗(yàn)證藥劑對(duì)辣椒炭疽病的防效?！窘Y(jié)果】分離得到的27個(gè)菌株形態(tài)特征相同，氣生菌絲較發(fā)達(dá)，初呈白色，而后逐漸變?yōu)闇\灰色，分生孢子無色單胞，橢圓形，一端稍尖，大小為（7.48—14.69）μm×（2.52—5.64）μm。將所分離得到的菌株接種于刺傷果實(shí)或無傷口果實(shí)，兩者均可發(fā)病，但刺傷果實(shí)上病斑發(fā)展快。病菌既侵染未成熟的辣椒果實(shí)，也侵染成熟的果實(shí)，病斑呈橢圓形凹陷，表面有橘黃色的分生孢子團(tuán)。所選取的4個(gè)代表性菌株的rDNA-ITS序列的長(zhǎng)度為562、541、557和553 bp，通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，4個(gè)代表菌株與炭疽菌屬尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）聚在同一分支上，親緣關(guān)系置信度為100%。室內(nèi)毒力測(cè)定試驗(yàn)表明，吡唑醚菌酯、咯菌腈和啶菌唑?qū)怄咛烤揖木z生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均具有較高的抑制活性。活體接種試驗(yàn)表明，吡唑醚菌酯、咯菌腈和啶菌唑?qū)苯诽烤也【哂休^好的預(yù)防和治療作用，在濃度為400 μg·mL-1時(shí)，對(duì)辣椒炭疽病的預(yù)防效果和治療效果均大于60%，高于對(duì)照藥劑嘧菌酯的防效?！窘Y(jié)論】引起山東省露地辣椒主產(chǎn)區(qū)辣椒炭疽病的致病菌為尖孢炭疽菌。吡唑醚菌酯、咯菌腈和啶菌唑?qū)υ摼哂休^高的毒力和活體防效，在辣椒炭疽病的田間防治中具有較大的應(yīng)用潛力。

辣椒炭疽??；尖孢炭疽菌；殺菌劑；室內(nèi)毒力；防治效果

0 引言

【研究意義】近年來，山東省露地辣椒種植面積逐年擴(kuò)大，已成為重要的蔬菜和經(jīng)濟(jì)作物之一。辣椒炭疽病是影響辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)的一種主要病害。辣椒炭疽病發(fā)生高峰期在7月初至9月中旬，此時(shí)正值山東省高溫多雨的季節(jié)，導(dǎo)致炭疽病防治難度加大，嚴(yán)重時(shí)病果率高達(dá)50%—60%。辣椒炭疽病的防治措施很多，包括農(nóng)業(yè)防治、生物防治和化學(xué)防治。農(nóng)業(yè)防治措施主要以種植抗性品種為主，目前中國(guó)辣椒和下垂辣椒是已鑒定出的高抗炭疽病的材料，但是由于存在種間雜交障礙，難以直接應(yīng)用于育種中，加上辣椒抗性基因資源的有限性及不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)炭疽菌種類的不同，嚴(yán)重阻礙了抗性品種的培育及應(yīng)用[1-2]。生物防治措施手段尚不成熟，對(duì)辣椒炭疽病僅有一定緩解作用，難以廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中[3]。在實(shí)際生產(chǎn)中該病主要依靠化學(xué)防治[4]，因此，明確山東省辣椒炭疽病病原菌的種類，篩選新的高效防治藥劑，對(duì)滿足生產(chǎn)需求具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，化學(xué)防治辣椒炭疽病主要存在以下問題：（1）目前國(guó)內(nèi)登記用于防治辣椒炭疽病的藥劑種類主要包括甲氧基丙烯酸酯類、銅制劑、苯并咪唑類、二硫代氨基甲酸鹽類、唑類殺菌劑，還包括氟啶胺、苦參堿·蛇床素、惡霉靈·乙蒜素、二氰蒽醌等藥劑。但有研究發(fā)現(xiàn)多菌靈、甲基硫菌靈、代森錳鋅和咪鮮胺等常用殺菌劑對(duì)尖孢炭疽菌引起的辣椒炭疽病的田間防治效果不理想[4-5]。尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）寄主范圍極廣，除侵染辣椒外，還可侵染草莓、蘋果、枇杷、柑橘、芒果等重要的經(jīng)濟(jì)作物[6]。有報(bào)道顯示尖孢炭疽菌對(duì)苯菌靈等苯并咪唑類藥劑具有較強(qiáng)的耐受力[7-8]。三唑類殺菌劑的過量使用對(duì)果實(shí)膨大存在一定風(fēng)險(xiǎn)；（2）炭疽病的致病菌種類多，不同種對(duì)藥劑的敏感性存在差異[9-10]，再加上各地用藥背景的不同，導(dǎo)致田間防治效果不穩(wěn)定。在中國(guó)辣椒炭疽病致病菌主要有膠胞炭疽菌（C. gloeosporioides）、平頭炭疽菌（C. truncatum）、球狀炭疽菌（C. coccodes）和尖孢炭疽菌[11-13]，其中膠胞炭疽菌主要分布在中部地區(qū)，平頭炭疽病菌分布在中部和南部部分地區(qū)，尖孢炭疽菌主要分布在中部和南部地區(qū)[13]。筆者調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，山東地區(qū)辣椒炭疽病的防治以單一噴施甲基硫菌靈、多菌靈等苯并咪唑類藥劑為主。加上辣椒炭疽病發(fā)生周期長(zhǎng)，農(nóng)民盲目加大施藥次數(shù)（7—10次），導(dǎo)致用藥量增加而防效增加不明顯等問題。一般病原菌的鑒定采用形態(tài)學(xué)的方法，而后輔以分子生物學(xué)技術(shù)以保證鑒定結(jié)果的可靠性和科學(xué)性[14]。【本研究切入點(diǎn)】目前，對(duì)引起山東省部分地區(qū)辣椒炭疽病的病原菌種類缺乏系統(tǒng)研究，而不同種類炭疽病菌對(duì)藥劑敏感性存在差異[9-10]，生產(chǎn)上用于該病防治的藥劑多為老品種殺菌劑，不利于辣椒炭疽病的高效防治?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)的手段鑒定所分離純化菌株的種類，并通過室內(nèi)毒力和活體接種試驗(yàn)相結(jié)合的方法測(cè)定病原菌對(duì)新型殺菌劑的敏感性，為山東省辣椒炭疽病的科學(xué)防治提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 病原菌的分離和培養(yǎng) 病果采自山東省濟(jì)寧、菏澤和德州等主要露地辣椒種植區(qū)，采集信息如表1。先采用組織分離法進(jìn)行分離[4]，剪取病果的病健交界處組織，用75%的酒精消毒30 s，后用無菌水漂洗3次，置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待生長(zhǎng)2—3 d后將長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行純化并采用單孢分離的技術(shù)進(jìn)行分離，所得到的純培養(yǎng)物在 4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。室?nèi)毒力測(cè)定時(shí)選擇用于分子生物學(xué)鑒定的4個(gè)代表菌株，分別為采自濟(jì)寧市金鄉(xiāng)縣的菌株 JN7、采自菏澤市巨野縣的菌株HZ2、采自濰坊市壽光市的菌株WF4、采自泰安市岱岳區(qū)的菌株TA1；由于各菌株致病力無差異，離體活體防效測(cè)定時(shí)選擇采自泰安市岱岳區(qū)的菌株TA1。

表1 采集信息Table 1 Collecting information

1.1.2 辣椒品種、所用培養(yǎng)基及供試藥劑 由表 1可知目前京信紅2號(hào)和黃線7318是主要的種植品種，因此致病力試驗(yàn)中辣椒品種選用黃線7318；活體接種試驗(yàn)中辣椒品種選擇京信紅2號(hào)。

培養(yǎng)基為馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L；水瓊脂培養(yǎng)基（water agar，WA）：瓊脂10 g，葡萄糖20 g，水1 L。

供試藥劑共11種：98%咯菌腈（fludioxonil），浙江省杭州宇龍化工有限公司；90.9%啶菌唑（pyrisoxazole），沈陽科創(chuàng)化學(xué)品有限公司；96.5%苯醚甲環(huán)唑（difenoconazole）江蘇優(yōu)士化學(xué)有限公司；98.3%吡唑醚菌酯（pyraclostrobin），山東康喬生物科技有限公司；98.5%多菌靈（carbendazim），蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司；95%甲基硫菌靈（thiophanate-methyl），安徽廣信農(nóng)化股份有限公司；96%戊唑醇（tebuconazole），上虞穎泰精細(xì)化工有限公司；95%異菌脲（iprodione），江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司；96.8%氟菌唑（trifumizole），上海生農(nóng)生化制品有限公司；98.7%百菌清（chlorothalonil），江陰蘇利化學(xué)股份有限公司；95%嘧菌酯（azoxystrobin），江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司。其中，多菌靈原藥用0.1 mol·L-1的HCl溶解，其余10種藥劑原藥用丙酮溶解，均配制成質(zhì)量濃度為1×105μg·mL-1的母液，于4℃冰箱中保存，用于室內(nèi)毒力測(cè)定。99%水楊肟酸（salicylhydroxamic acid，SHAM）由日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)，溶于甲醇制成1×104μg·mL-1的母液，用于QoIs類殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定。

250 g·L-1吡唑醚菌酯EC（巴斯夫植物保護(hù)（江蘇）有限公司），50%咯菌腈 WP（先正達(dá)蘇州作物保護(hù)有限公司），25%啶菌唑EC（沈陽科創(chuàng)化學(xué)品有限公司），250 g·L-1嘧菌酯SC（浙江世佳科技有限公司），用于活體防效的測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間病害調(diào)查及癥狀觀察 于2015年，對(duì)山東省濟(jì)寧、菏澤和德州等露地辣椒種植區(qū)辣椒炭疽病的發(fā)生和危害進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)田間自然發(fā)病的辣椒果實(shí)進(jìn)行拍照記錄。

1.2.2 病原菌形態(tài)觀察 將分離得到的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)8 d后觀察記錄菌落的形狀、顏色及基質(zhì)顏色[14]。在光學(xué)電子顯微鏡（Olympus IX-71，Japan）下觀察分生孢子的形態(tài)、大小并拍照。

1.2.3 病原菌致病力鑒定 在辣椒種植溫室中摘取未接觸過藥劑的成熟和未成熟的辣椒果實(shí)（品種黃線7318），先用75%酒精對(duì)辣椒果實(shí)表面進(jìn)行消毒，再利用無菌水沖洗3遍后晾干備用。將辣椒置于含濾紙的保鮮盒（16 cm×10 cm×6 cm）中培養(yǎng)，濾紙用滅菌去離子水浸濕以便保濕，選擇孢子懸浮液接種的方式。

孢子懸浮液制備：將純化的27個(gè)菌株分別接種在PDA平板上，25℃黑暗培養(yǎng)8 d后，加入10 mL的無菌水刮洗菌絲，所得到的懸浮液經(jīng)3層紗布過濾，濾液于10 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，將分生孢子重新懸浮在10 mL的無菌水中。在顯微鏡下使用血球計(jì)數(shù)板來計(jì)算孢子懸浮液的濃度，最終將孢子懸浮液濃度調(diào)至1×105個(gè)/mL。

傷口接種：利用消毒的接種針刺傷辣椒果實(shí)，傷口深度1 mm左右，用移液器吸取孢子懸浮液10 μL（濃度為1×105個(gè)/mL）置于傷口處，每個(gè)果實(shí)接種兩處，每個(gè)處理接種10個(gè)果實(shí)，將接種后的果實(shí)在培養(yǎng)箱中（25℃；L﹕D = 12 h﹕12 h；相對(duì)濕度85% 以上）培養(yǎng)7 d后，觀察病害發(fā)生情況及病斑形態(tài)。

無傷口接種：與針刺接種的唯一區(qū)別是不刺傷辣椒，其余操作相同。

待接種后的辣椒發(fā)病后，根據(jù)柯赫式法則，將病原菌重新進(jìn)行分離純化，觀察新分離物與接種菌是否相同。

1.2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 病原菌DNA的提取：在所采集的 27株菌中隨機(jī)選取 4個(gè)代表菌株（JN7、HZ2、WF4、TA1）進(jìn)行病原菌的分子生物學(xué)鑒定。將4個(gè)典型代表菌株接種到PDA平板上進(jìn)行活化，25℃黑暗培養(yǎng)7 d后，利用滅菌的玻璃片將菌絲刮下，稱取菌絲0.5 g，采用CTAB的方法提取DNA[15]。

rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增：采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的通用引物ITS4和ITS5，對(duì)4個(gè)代表菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為50 μL，反應(yīng)液包括引物ITS4和ITS5各1 μL（20 μmoL·L-1），dNTP 4 μL（2.5 mmoL·L-1），模板DNA 2 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL（1 U·μL-1），10× PCR buffer 5 μL，ddH2O 36.5 μL，用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s， 56℃退火30 s，72℃延伸50 s，共32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后，用凝膠成像儀進(jìn)行觀察并拍照，利用DNA凝膠回收試劑盒（BioTeke）進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物交由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。

序列分析和數(shù)據(jù)處理：將測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)里進(jìn)行序列比對(duì)，通過NCBI提供的Blast工具，搜索同源性較高的序列。將目標(biāo)序列和GenBank中搜索得到的相關(guān)炭疽菌序列放在同一個(gè) FASTA格式編輯成的文本文檔中，利用程序Clustal W進(jìn)行序列比對(duì)，將兩端的引物序列去掉，利用MEGA 5.1軟件中的最大簡(jiǎn)約法（maximum parsimony，MP）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析親緣關(guān)系。

1.2.5 室內(nèi)藥劑篩選 菌絲生長(zhǎng)速率法[16]：將預(yù)先準(zhǔn)備好的各供試藥劑母液用0.1% T-80水溶液稀釋后，加入到冷卻至50℃左右的PDA培養(yǎng)基中，混合均勻后將培養(yǎng)基倒入9 cm的培養(yǎng)皿中，獲得一系列有效試驗(yàn)濃度的培養(yǎng)平板，其中咯菌腈、啶菌唑、苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯的系列濃度均為0、0.01、0.02、0.04、 0.08、0.16 μg·mL-1，多菌靈和甲基硫菌靈的系列濃度為0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 μg·mL-1，戊唑醇、異菌脲和嘧菌酯的系列濃度為 0、0.5、1、2、4、8 μg·mL-1，氟菌唑和百菌清的系列濃度為0、5、10、20、 40、60 μg·mL-1。為抑制旁路呼吸作用[17]，吡唑醚菌酯和嘧菌酯的 PDA平板中加入適當(dāng)體積的水楊肟酸（SHAM）至終濃度為100 μg·mL-1。每個(gè)處理重復(fù)4次。以加入等量的T-80溶液的PDA平板為空白對(duì)照。以加入含溶劑的T-80溶液的PDA平板為溶劑對(duì)照，溶劑用量選擇采用最小稀釋倍數(shù)法確定，其中吡唑醚菌酯和嘧菌酯的溶劑均為丙酮和甲醇，多菌靈的溶劑為0.1 mol·L-1HCl，其余藥劑的溶劑為丙酮。用打孔器在培養(yǎng)8 d的菌落（JN7、HZ2、WF4、TA1）邊緣打取菌餅（8 mm），將含有菌絲的一面朝下，接種在上述培養(yǎng)皿的中央。25℃黑暗培養(yǎng)6 d后，利用十字交叉法垂直方向量取菌落直徑（cm），計(jì)算菌絲生長(zhǎng)的抑制率。

孢子萌發(fā)法[18]：將供試藥劑的母液用0.1%的T-80水溶液稀釋，再加入到冷卻的WA培養(yǎng)基中混勻后，倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，制成相應(yīng)有效試驗(yàn)濃度的平板。其中吡唑醚菌酯和咯菌腈的系列濃度為 0、 0.004、0.008、0.016、0.032、0.064 μg·mL-1，啶菌唑的系列濃度為0、0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 μg·mL-1，嘧菌酯的系列濃度為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μg·mL-1，苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、甲基硫菌靈、戊唑醇和異菌脲的系列濃度為0、5、10、20、40、80 μg·mL-1，氟菌唑和百菌清的系列濃度為0、30、60、120、180、240 μg·mL-1。供試藥劑吡唑醚菌酯和嘧菌酯的WA平板上需要加入適當(dāng)體積的水楊肟酸至 100 μg·mL-1以抑制旁路呼吸作用，并設(shè)置空白對(duì)照和溶劑對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)4次。對(duì)照設(shè)置方法同菌絲生長(zhǎng)速率法。利用無菌水沖洗培養(yǎng)8 d的菌落（JN7、HZ2、WF4、TA1），后經(jīng)滅菌的雙層紗布過濾，濾液經(jīng)離心機(jī)10 000 r/min離心5 min后棄掉上清液，用滅菌水將分生孢子重懸

調(diào)節(jié)至濃度為1×105個(gè)/mL。利用移液器吸取100 μL

的孢子懸浮液打在凝固的WA平板中，使用涂布器將孢子懸浮液在WA培養(yǎng)基上涂布均勻。25℃黑暗培養(yǎng)8 h后觀察分生孢子的萌發(fā)情況，當(dāng)芽管長(zhǎng)度超過孢子長(zhǎng)度的一半時(shí)視為萌發(fā)，每個(gè)平板至少觀察200個(gè)以上的分生孢子，最后計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。

相對(duì)毒力指數(shù)[19]：在試驗(yàn)的登記藥劑（嘧菌酯、苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、甲基硫菌靈、戊唑醇、異菌脲、百菌清）中選擇對(duì)辣椒炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均具有較高抑制作用的藥劑為標(biāo)準(zhǔn)藥劑，參照以下公式計(jì)算相對(duì)毒力指數(shù)。相對(duì)毒力指數(shù)（RTI）= 標(biāo)準(zhǔn)藥劑的EC50/試驗(yàn)藥劑的EC50。

1.2.6 4種試驗(yàn)藥劑對(duì)辣椒炭疽病的預(yù)防和治療效果[20]由于4個(gè)代表菌株的致病力無明顯差異，所以活體防效試驗(yàn)選擇TA1為供試菌株。根據(jù)前期室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果，選取4個(gè)對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)都具有較高抑制活性的藥劑進(jìn)行活體試驗(yàn)，其中嘧菌酯為對(duì)照藥劑。

在試驗(yàn)基地中采集未接觸過藥劑的大小和健康狀況一致的辣椒果實(shí)（京信紅2號(hào)），利用無菌水沖洗3次后晾干，置于含有浸濕濾紙的保鮮盒（16 cm×10 cm×6 cm）中。

為了評(píng)估藥劑的治療效果，試驗(yàn)所采集的辣椒果實(shí)先按照上述方法接種孢子懸浮液，24 h后按照上述方法噴施相同濃度的藥液，對(duì)照果實(shí)噴施清水。每個(gè)處理20個(gè)果實(shí)，將試驗(yàn)辣椒在培養(yǎng)箱（25℃；L﹕D = 12 h﹕12 h；相對(duì)濕度85%以上）中培養(yǎng)7 d后，在病斑的垂直方向上量取直徑（mm）后取平均值計(jì)算防效，試驗(yàn)共重復(fù)兩次。

2 結(jié)果

2.1 辣椒炭疽病的危害及田間癥狀

2015年辣椒炭疽病在山東省露地辣椒種植區(qū)大面積發(fā)生，而且發(fā)展蔓延極快，嚴(yán)重地塊病果率達(dá)到50%—60%。露地辣椒整個(gè)生長(zhǎng)期一般從 4月初到 9月中旬，期間經(jīng)歷高溫和多雨的夏季，溫濕度條件有利于辣椒炭疽病的發(fā)生。該類病害只危害辣椒果實(shí)。發(fā)病初期在果實(shí)上產(chǎn)生淡褐色凹陷的小點(diǎn)，后逐漸蔓延至橢圓形的凹陷斑，而且病斑上產(chǎn)生大量橘黃色的分生孢子（圖1），成為再侵染源危害其他健康果實(shí)。

2.2 病原菌的分離純化及形態(tài)特征

從采集的樣品中共分離得到27個(gè)菌株，分別置于PDA平板上25℃黑暗培養(yǎng)8 d后觀察分生孢子形態(tài)、大小、菌落形態(tài)和顏色等。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)27個(gè)菌株的形態(tài)特征相同均表現(xiàn)為分生孢子單胞，無色，長(zhǎng)橢圓形，一端稍尖，大小為（7.48—14.69）μm ×（2.52—5.64） μm（圖2-A），菌落邊緣光滑圓形，氣生菌絲較為發(fā)達(dá)初為白色，后期逐漸變?yōu)榛野咨|(zhì)具有明顯的灰黑色同心輪紋（圖2-B、2-C）。由于27個(gè)菌株形態(tài)特征一致，致病癥狀相同，致病力無顯著差異，因此隨機(jī)選取4個(gè)代表菌株（JN7、HZ2、WF4、TA1）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 田間辣椒炭疽病病情發(fā)展Fig. 1 The development of pepper anthracnose in the field

圖2 辣椒炭疽病菌的形態(tài)特征及致病力Fig. 2 Morphology and pathogenicity of the pathogen causing the anthracnose on pepper

2.3 病原菌的致病性

該類病原菌既可以侵染成熟的辣椒果實(shí)，也可以侵染未成熟的辣椒果實(shí)（圖2-D、2-E）。通過針刺接種法接種的辣椒果實(shí)，在接種后第3天開始發(fā)病，病斑擴(kuò)展速度快，到第7天病斑直徑可達(dá)到10—21 mm（圖 2-D）。若為無傷口接種的辣椒果實(shí)，在接種后第5天開始發(fā)病，隨后病斑開始擴(kuò)展，但與傷口接種相比無傷口接種的病斑擴(kuò)展速度較慢（圖 2-E）。病斑凹陷、長(zhǎng)橢圓形、中央產(chǎn)生大量橘黃色的分生孢子團(tuán)（圖2- D、2-E），分生孢子團(tuán)干后可見同心環(huán)狀的黑色的分生孢子盤，其人工接種發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病情況一致。根據(jù)柯赫式法則將病斑重新進(jìn)行組織分離，得到的分離物與接種菌一致，證明該菌為辣椒炭疽病的致病菌。

在分離的 27株菌對(duì)成熟和未成熟的辣椒果實(shí)的致病性對(duì)比試驗(yàn)中，所有菌株對(duì)成熟果實(shí)和未成熟的果實(shí)均具有致病性。從發(fā)病率和病斑直徑來看，所有菌株的致病力無顯著差異，同時(shí)在成熟果實(shí)上的病斑直徑大于未成熟果實(shí)（表2）。

2.4 病原菌的rDNA-ITS 序列分析

以所選取的代表菌株JN7、HZ2、WF4、TA1的基因組DNA為模板，對(duì)其進(jìn)行rDNA-ITS基因的PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度為562、541、557和553 bp大小的ITS序列（圖3）。將測(cè)序結(jié)果提交至GenBank，獲得登錄號(hào)分別為KX830854-KX830857，Blast結(jié)果表明供試菌株與KJ627843、KC816048等幾個(gè)尖孢炭疽菌的ITS序列99%相同。

將所分離菌株的rDNA-ITS序列與炭疽菌屬的相關(guān)種進(jìn)行比較，以Pestalotia algeriensis為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹顯示菌株 KX830854-KX830857與尖孢炭疽菌聚在同一分支，并且與尖孢炭疽菌KJ627843、KC816048、KT215297等的ITS序列的親緣關(guān)系置信度為 100%，膠胞炭疽菌聚在另一分支，而外群菌株P(guān). algeriensis則以較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系處在系統(tǒng)發(fā)育樹的外圍（圖4）。

表2 分離菌株在離體辣椒果實(shí)上的致病性Table 2 The pathogenicity of pathogen on the detached pepper fruits

圖3 RDNA-ITS片段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig. 3 PCR amplification pattern

2.5 防治藥劑的室內(nèi)篩選

2.5.1 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制活性 11種藥劑中除百菌清外，其余藥劑對(duì)4株尖孢炭疽菌的菌絲生長(zhǎng)均具有良好的抑制作用，其中吡唑醚菌酯、咯菌腈、啶菌唑、苯醚甲環(huán)唑、多菌靈和甲基硫菌靈的毒力較高，平均 EC50分別為 0.1226、0.0306、0.0493、0.1248、 0.1345和0.1941 μg·mL-1，而嘧菌酯、戊唑醇、異菌脲和氟菌唑?qū)z生長(zhǎng)的抑制活性相對(duì)較低，EC50均大于2.1 μg·mL-1（表3）。

2.5.2 對(duì)孢子萌發(fā)的抑制活性 吡唑醚菌酯、咯菌腈、啶菌唑和嘧菌酯對(duì)尖孢炭疽菌的孢子萌發(fā)有較高的抑制毒力，平均 EC50為 0.0138、0.0468、0.1172和0.3593 μg·mL-1，而其余殺菌劑對(duì)尖孢炭疽菌孢子萌發(fā)的抑制活性低，EC50均大于 21 μg·mL-1（表3）。

通過表3可以發(fā)現(xiàn)在登記藥劑多菌靈、甲基硫菌靈、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯中，嘧菌酯對(duì)辣椒炭疽病菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有較高的抑制毒力，因此選擇嘧菌酯為標(biāo)準(zhǔn)參考藥劑。其中吡唑醚菌酯、咯菌腈和啶菌唑?qū)怄咛烤揖木z生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制毒力均高于嘧菌酯的3倍。

2.6 4種試驗(yàn)藥劑對(duì)辣椒炭疽病的預(yù)防和治療作用

該4種藥劑對(duì)辣椒炭疽病均有一定的防治效果，且各藥劑的預(yù)防作用均大于其治療作用，防治效果隨著藥劑濃度的提高而增加。預(yù)防活性試驗(yàn)中，咯菌腈400 μg·mL-1的防治效果最高為72.74%，其次為吡唑醚菌酯和啶菌

唑400 μg·mL-1防治效果分別為70.01%和61.61%，上述3種藥劑400 μg·mL-1處理對(duì)辣椒炭疽病的防治效果均顯著高于嘧菌酯 400 μg·mL-1處理（P＜0.01）。治療活性試驗(yàn)中，吡唑醚菌酯400 μg·mL-1防治效果最高為 68.34%，其次為咯菌腈和啶菌

唑 400 μg·mL-1處理，防治效果分別為63.69%和61.00%，這3種藥劑400 μg·mL-1的處理對(duì)辣椒炭疽病的防治效果也顯著高于嘧菌酯400 μg·mL-1處理（P＜0.01）（表4、圖5）。

表3 11種藥劑抑制尖孢炭疽菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的毒力Table 3 Inhibitory effect of 11 fungicides on mycelial growth and spore germination of C. acutatum

表4 4種藥劑對(duì)辣椒炭疽病的預(yù)防作用和治療作用Table 4 The preventive and curative activity of four fungicides against pepper anthracnose

圖5 4種藥劑對(duì)辣椒炭疽病的預(yù)防和治療防效Fig. 5 Preventive and curative activity of the four fungicides against pepper anthracnose

3 討論

炭疽菌屬是一個(gè)復(fù)雜的屬，包括多個(gè)致病種，并且部分種致病力極強(qiáng)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大損失[21-22]。目前，在美國(guó)的佛羅里達(dá)州和俄亥俄州等地[23-24]，尖孢炭疽菌是辣椒炭疽病的主要致病菌。2012年，夏花等[4]在湖南辣椒種植區(qū)也首次報(bào)道了尖孢炭疽菌。由于尖孢炭疽菌寄主范圍廣，可為害辣椒、草莓、蘋果、茄子、芒果和銀杏等作物[25-26]，并且該類病菌引起的炭疽病蔓延快、防治難度大[4]，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)影響極大。所以，確定致病菌的種類對(duì)于該病的科學(xué)防治具有重要意義。起初炭疽病菌的鑒定是基于形態(tài)學(xué)層面，隨著分子生物學(xué)等技術(shù)不斷發(fā)展，給炭疽菌的鑒定提供了科學(xué)的依據(jù)[27-29]。

本研究所分離菌株特征是在PDA培養(yǎng)基上，氣生菌絲初為白色后期轉(zhuǎn)變?yōu)榛野咨?，基質(zhì)后期出現(xiàn)黑色的同心輪紋，分生孢子單生，長(zhǎng)橢圓形，一端尖，與夏花等報(bào)道的尖孢炭疽菌特征一致[4,14]。夏花等[4]發(fā)現(xiàn)尖孢炭疽菌與膠胞炭疽菌引起的炭疽病癥狀雖然一致，但是尖孢炭疽菌既可以侵染成熟的辣椒果實(shí)也可以侵染未成熟的辣椒果實(shí)，而膠胞炭疽菌只侵染成熟的辣椒果實(shí)。本研究所分離的炭疽病菌既侵染未成熟辣椒果實(shí)也侵染成熟的辣椒果實(shí)。同時(shí)該病菌引起的辣椒炭疽病，病斑長(zhǎng)橢圓形凹陷，中央產(chǎn)生大量橘黃色的分生孢子團(tuán)，與夏花等[4]所描述的尖孢炭疽病菌的致病癥狀相同。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，試驗(yàn)菌株與膠胞炭疽菌并未分在同一分化枝上，證明兩者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同時(shí)試驗(yàn)菌株與尖孢炭疽菌聚在同一分支并且兩者親緣關(guān)系的置信度高達(dá) 100%。因此可以斷定本研究所采集的菌株為尖孢炭疽菌，后續(xù)還會(huì)繼續(xù)進(jìn)行多點(diǎn)、多年的跟蹤采集和鑒定。

在植物病害管理過程中，要做到殺菌劑的科學(xué)使用需要兼顧防治效益和抗性治理。本研究中3種藥劑在低濃度時(shí)，防治效果并不理想，加之與多菌靈、甲基硫菌靈等常規(guī)藥劑相比目前零售價(jià)格較高，所以為提高防治效益，在實(shí)際生產(chǎn)中可考慮與常規(guī)藥劑混用以及在發(fā)病前或初期保護(hù)性施藥。陳娟芳等[36]研究發(fā)現(xiàn)吡唑醚菌酯和甲基硫菌靈復(fù)配對(duì)紅色炭疽病菌和黑點(diǎn)炭疽病菌具有很好的抑制效果。PERES等證明尖孢炭疽菌對(duì)苯并咪唑類藥劑已產(chǎn)生抗性[7-8]。在本研究中苯并咪唑類殺菌劑對(duì)尖孢炭疽病菌的孢子萌發(fā)抑制作用低，但對(duì)菌絲生長(zhǎng)仍具有較高的活性，未見抗性現(xiàn)象，可能與該地區(qū)目前苯并咪唑類藥劑使用狀況有關(guān)。通過對(duì)采集地用藥習(xí)慣的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)多數(shù)農(nóng)戶在前期以有機(jī)硫類、苯并咪唑類藥劑為主，后期以三唑類及與其他殺菌劑混用為主。盡管如此，田間仍需要持續(xù)監(jiān)測(cè)該地區(qū)尖孢炭疽病菌的抗性發(fā)展?fàn)顩r。為實(shí)現(xiàn)辣椒炭疽病的科學(xué)高效防治，田間具體的施藥模式也需進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

山東省露地辣椒主產(chǎn)區(qū)炭疽病主要由尖孢炭疽菌引起。吡唑醚菌酯、咯菌腈和啶菌唑?qū)怄咛烤揖哂休^好的抑制效果，在辣椒炭疽病的防治中具有一定的應(yīng)用潛力。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Identification of the Pathogen Causing Pepper Anthracnose in Shandong Province and Screening of Highly Effective Fungicides

GAO YangYang1,2, HE LiFei1,2, LI BeiXing3,4, LIN Jin1,3, MU Wei1,4, LIU Feng1,3
(1College of Plant Protection, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong;2Shandong Provincial Key Laboratory for Biology of Vegetable Diseases and Insect Pests, Taian 271018, Shandong;3Key Laboratory of Pesticide Toxicology & Application Technique, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong;4Research Center of Pesticide Environmental Toxicology, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong)

【Objective】The objective of this study is to identify the pathogen species of pepper anthracnose in major pepper growing areas in Shandong Province, and to screen the highly effective fungicides by inhibitory activity test in vitro and relative control efficacy trials on detached pepper fruits inoculated with conidial suspension. 【Method】 The isolates of pepper anthracnose were collected from the major pepper producing areas in Jining, Heze, Weifang, Taian and Dezhou. After isolation and purification,the isolates were identified by using the methods of morphological characteristics analysis, its pathogenicity test on detached pepper fruits and molecular diagnostics. Morphology parameters mainly include the colony and conidial morphology, conidial size. The internal transcribed spacer (ITS) rDNA region of the four typical isolates was amplified by using the fungal universal primers ITS4 and ITS5, and then the amplified product was recycled and sequenced. MEGA 5.1 was used to generate phylogenetic tree to confirm the pathogen species. The inhibitory activity in vitro of 11 fungicides to Colletotrichum acutatum isolate was determined by the inhibition of the 11 fungicides against mycelial growth and spore germination of the pathogen. Control efficacies of the selected fungicides against pepper anthracnose were determined on the detached pepper fruits.【Result】All of the twenty-seven isolates exhibited similar morphology, which produced white to pale grey colonies. The oval conidia were single-celled with a sub-cute end, (7.48-14.69) μm × (2.52-5.64) μm in size. Both of the mature and immature pepper fruits with or without wound could be infected by this pathogen, and disease spot expanded rapidly on wounded pepper fruits. Typical symptom of pepper anthracnose was sunken and necrotic lesion that covered with massive orange conidia. The rDNA-ITS sequence length of the four representative isolates was 562, 541, 557 and 553 bp (GenBank Accession No KX830854-KX830857), respectively. Phylogenetic tree analysis indicated that the four representative isolates and C. acutatum were divided into one group, and the bootstrap value was 100%. The inhibitory activity test in vitro indicated that pyraclostrobin, fludioxonil, and pyrisoxazole exhibited strong inhibitory activity against mycelial growth and spore germination of C. acutatum. Moreover, pyraclostrobin, fludioxonil and pyrisoxazole at the dose of 400 μg·mL-1also showed high preventive and curative activity against C. acutatum on detached pepper fruits, with the efficacy greater than 60%, which showed significantly higher efficacy than the preventive and curative activity of azoxystrobin.【Conclusion】 The major pathogenic fungus of pepper anthracnose in Shandong Province was identified as C. acutatum. Pyraclostrobin, fludioxonil and pyrisoxazole showed excellent inhibitory activity against C. acutatum both in vitro and in vivo, make these fungicides become potential candidates for the control of pepper anthracnose in the field.

pepper anthracnose; Colletotrichum acutatum; fungicides; inhibitory activity in vitro; control efficacy

2016-11-14；接受日期：2017-02-10

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0200500）

聯(lián)系方式：高楊楊，E-mail：2541467231@qq.com。通信作者劉峰，Tel/Fax：0538-8242611；E-mail：fliu@sdau.edu.cn