河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

馬國(guó)平 賈彥存△郝 娟△△王佳磊△△△楊 帆△△張 宇△△梁文杰△△(石家莊 050030)

化瘀解毒中藥對(duì)梗阻性腎病大鼠腎臟類(lèi)肝素酶表達(dá)的調(diào)控作用*

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

馬國(guó)平 賈彥存△郝 娟△△王佳磊△△△楊 帆△△張 宇△△梁文杰△△(石家莊 050030)

目的：觀察化瘀解毒中藥對(duì)梗阻性腎病大鼠腎臟類(lèi)肝素酶(Hpa)表達(dá)的影響，以探索其拮抗炎癥損傷的機(jī)制。方法：采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)復(fù)制梗阻性腎病模型；采用real-timePCR技術(shù)檢測(cè)腎組織HpamRNA的表達(dá)；采用SABC法檢測(cè)腎組織Hpa蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織HpamRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，中藥組腎組織Hpa表達(dá)下降(P<0.01)。結(jié)論：化瘀解毒中藥可下調(diào)梗阻性腎病大鼠腎臟Hpa表達(dá)從而減輕炎癥損傷。

化瘀解毒中藥；類(lèi)肝素酶；梗阻性腎??；炎癥損傷

在慢性腎臟病進(jìn)程中，常伴隨炎癥反應(yīng)及其導(dǎo)致的炎癥損傷，而巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)是腎組織炎癥反應(yīng)的重要病理特征。炎細(xì)胞浸潤(rùn)需穿越基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)是其主要成分之一，而類(lèi)肝素酶(Hpa)可裂解HSPG的硫酸乙酰肝素(HS)側(cè)鏈。故而Hpa促進(jìn)細(xì)胞侵襲，在炎細(xì)胞浸潤(rùn)中起著極其重要的作用。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)方式，復(fù)制梗阻性腎病病變，給以化瘀解毒中藥干預(yù)治療，觀察Hpa在UUO大鼠腎組織的表達(dá)，并觀察化瘀解毒中藥的調(diào)控作用，以探索炎癥損傷的分子機(jī)制，從而為慢性腎臟病的中藥治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 RNA提取試劑盒為美國(guó)Omega Bio-Tek公司產(chǎn)品，批號(hào)：00R6934010000L18O094；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒為Vazyme Biotech Co.，Ltd產(chǎn)品，批號(hào)402151；Hpa抗體為美國(guó)Proteintech產(chǎn)品，批號(hào)00036315。實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀，美國(guó) Applied Biosystems 公司，型號(hào)：7500 Fast；超微量紫外分光光度計(jì)，型號(hào)：ND-2000，美國(guó)thermo scientific公司；顯微鏡，日本奧林巴斯，型號(hào)：VANOX DM-10AD。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 清潔級(jí)雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào): 1605369。30只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(SHAM)組、模型(UUO)組及中藥(TCM)組，每組10只。大鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型制備參照 Qian HS 方法。[1]

1.3 藥物及干預(yù)方法 化瘀解毒中藥(黃芪、醋鱉甲、僵蠶、烏梢蛇、地龍、赤芍、丹參、黃芩、金銀花、蒲公英、大黃)采用廣東一方制藥有限公司免煎顆粒中藥，常規(guī)煎煮。術(shù)后開(kāi)始給藥，TCM組給予化瘀解毒中藥煎劑生藥含量13.7 g/kg·d-1，SHAM組及UUO組給予等容量生理鹽水。連續(xù)干預(yù)10 d。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 腎組織Hpa mRNA 表達(dá)檢測(cè):采用 Real-time PCR 法。常規(guī)提取腎組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴(kuò)增。Template 1 μL，4×Gdna wiper Mix 10 μL，ddH2O 6.6 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，F(xiàn)orward primer(10 μM) 1 μL, Reverse primer(10 μM)1 μL，Total volume 20 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2 min，兩步法循環(huán)反應(yīng)(95℃10 sec，60℃ 1 min)40個(gè)循環(huán)，融解曲線95℃ 15 sec，60℃ 60 sec，95℃ 15 sec。引物由 Invitrogen 公司合成，Hpa：Forward primer: 5'-ctctctcctgttcaagaaact-3'，Reverse primer: 5'-ttcccgataccttgggtgatag-3'；GAPDH：Forward primer: 5'-ttgtcagcaatgcatcctgc-3'，Reverse primer: 5'-cggcatgtcagatccacaac-3'。以GADPH為內(nèi)參照基因，得到目的基因的Ct值，以RQ值表示基因相對(duì)表達(dá)量，RQ=2-△△Ct。

1.4.2 免疫組化(SABC)法檢測(cè)Hpa蛋白表達(dá):[2]石蠟切片脫蠟、水化，0.01 M PBS清洗3次，5 min/次；室溫下0.3%H2O2孵育20 min；同上清洗；0.01 M枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)微波爐內(nèi)熱修復(fù)，98℃20 min；冷卻后同上清洗 ，滴加山羊血清封閉液，37℃濕盒孵育30 min；吸去多余封閉液，加入兔抗鼠Hpa一抗(1∶100)，4℃過(guò)夜；同上清洗 ；滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃濕盒孵育1 h；同上清洗；滴加 SABC 復(fù)合物，37℃濕盒孵育30 min；同上清洗；DAB顯色；蒸餾水沖洗；蘇木素復(fù)染；梯度酒精脫水；二甲苯透明；中性樹(shù)膠封片。顯微鏡觀察Hpa表達(dá)情況及位置，以光鏡下出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。醫(yī)學(xué)圖文圖像分析系統(tǒng)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎臟Hpa mRNA表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎臟Hpa mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)；而與模型組比較，中藥組大鼠腎臟的HpamRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)。詳見(jiàn)表1、圖1。

組別nmRNA(RQ) 假手術(shù)組100.855±0.249 模型組1011.682±1.105*中藥組103.417±0.980△

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01

注：與假手術(shù)組比，﹡P<0.01；與模型組比，△P<0.01

圖1 各組大鼠腎組織Hpa mRNA表達(dá)比較

2.2 各組大鼠腎組織Hpa蛋白表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腎臟Hpa蛋白微量表達(dá)；與假手術(shù)組比較，模型組腎臟Hpa表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)，主要表達(dá)在遠(yuǎn)端小管及部分腎間質(zhì)；與模型組比較，中藥組腎臟Hpa表達(dá)明顯減弱P<0.05。詳見(jiàn)表2及圖2。

組別nHpa平均光度值假手術(shù)組100.174±0.026 模型組100.310±0.050*中藥組100.243±0.057△

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

注：A為假手術(shù)組；B為模型組；C為中藥組

3 討論

各種慢性腎臟病發(fā)展為終末期腎病的重要原因是腎臟炎癥反應(yīng)及其組織損傷，炎細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)是微生物性及非微生物性炎癥的共有特征。在梗阻性腎病，腎小管損傷、基質(zhì)堆積及炎細(xì)胞浸潤(rùn)是常見(jiàn)的病理表現(xiàn)。[3]前期研究顯示，[4]模型組大鼠患側(cè)腎臟腎組織單核細(xì)胞趨化因子1等炎性因子表達(dá)明顯上調(diào)，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，但確切機(jī)制尚不完全清楚。炎細(xì)胞浸潤(rùn)必須穿越基底膜和ECM，HSPG是其主要成分之一，HSPG是一種高硫酸化的多聚糖，遍布ECM及細(xì)胞表面。而Hpa是唯一獲知的哺乳動(dòng)物糖苷內(nèi)切酶，可裂解HSPG的HS側(cè)鏈， HS鏈聯(lián)結(jié)并組裝ECM蛋白，對(duì)于ECM的完整性及阻滯功能十分重要。Hpa通過(guò)降解HS鏈重構(gòu)ECM，促進(jìn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，影響著炎癥反應(yīng)，甚至促進(jìn)蛋白尿形成及腎纖維化進(jìn)程。[5-6]Hpa基因敲除鼠的腎實(shí)質(zhì)未見(jiàn)顯著的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，而野生鼠浸潤(rùn)明顯。[7]腎臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重的慢性腎炎患者，腎組織Hpa表達(dá)往往增強(qiáng)，炎細(xì)胞浸潤(rùn)處更甚。[8]本實(shí)驗(yàn)顯示，模型組大鼠腎臟Hpa mRNA及蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，有利于巨噬細(xì)胞等炎細(xì)胞穿越血管壁及ECM，從而加重炎癥反應(yīng)。

Hpa通過(guò)降解HS產(chǎn)生透明質(zhì)酸、核心蛋白聚糖、可溶性二聚糖等，這些裂解產(chǎn)物是Toll樣受體(TLRs)的配體，可與巨噬細(xì)胞胞膜的TLR2及TLR4結(jié)合，活化的TLRs進(jìn)一步激活NF-κB，NF-κB轉(zhuǎn)位胞核，啟動(dòng)TNFα、MCP-1及IL-1等炎性因子的基因表達(dá)。Hpa可使細(xì)胞膜的HSPG發(fā)生構(gòu)象改變而激活TLRs。故Hpa不僅促進(jìn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，而且可以激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)炎性因子表達(dá)。而活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNFα增多，TNFα介導(dǎo)Egr1轉(zhuǎn)錄因子(Hpa的強(qiáng)力誘導(dǎo)劑)的活化，進(jìn)一步上調(diào)Hpa表達(dá)。[9]這樣Hpa與巨噬細(xì)胞相互作用，加速并加重了腎臟炎癥損傷。

某些中藥復(fù)方可抑制腎臟Hpa表達(dá)，Sun W等[10]報(bào)道，益氣養(yǎng)陰方(地黃、山藥、生黃芪、黨參、丹參、當(dāng)歸、茯苓、益母草、白術(shù)、龜甲)可能通過(guò)抑制腎臟Hpa表達(dá)而減輕腎小球足突損傷，改善蛋白尿。炎細(xì)胞浸潤(rùn)及炎性因子產(chǎn)生為“濁毒”的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究顯示，化瘀解毒中藥可從基因、蛋白水平上明顯抑制Hpa表達(dá)，減弱腎臟濁毒的形成。Hpa表達(dá)減少可降低巨噬細(xì)胞等炎細(xì)胞的浸潤(rùn)，并抑制巨噬細(xì)胞活化，減少炎性因子的生成，從而減輕腎臟炎癥損傷，改善腎功能?；鼋舛局兴幹械牡佚?、僵蠶、蟬蛻、鱉甲等可化瘀通絡(luò)，大黃、黃芩、金銀花、蒲公英等可解毒瀉濁，加之赤芍、丹參的活血作用及黃芪的益氣作用，使其在臨床上具有較好的減輕炎癥損傷、改善腎功能的功效。

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(2016-12-30 收稿)

Effect of Stasis-resolving and Toxin-removing Chinese Medicine on Heparanases Expression in Obstructive Nephropathy Rats First Hospital of Hebei Medical University

(Shijiazhuang 050030)

MAGuo-pingJIAYan-cunHAOJuanWANGJia-leiYANGFanZHANGYuLIANGWen-jie

Objective: to observe the effect of stasis-resolving and toxin-removing Chinese medicine on heparanases (Hpa) expression in obstructive nephropathy rats so to explore its mechanism of anti-inflammatory injury. Methods: Take unilateral ureteral obstruction to duplicate obstructive nephropathy models; take real-time technique to detect Hpa mRNA expression; take SABC to detect Hpa protein expression. Results: compared to sham operation group, Hpa mRNA expression of model group increased (P<0.01);comparedtomodelgroup,Hpaexpressionofmedicinegroupdecreased(P<0.01).Conclusion:Stasis-resolvingandtoxin-removingChinesemedicinecandecreasetheHpaexpressioninobstructivenephropathyratsandsoastolightentheinflammatoryinjury.

stasis-resolving and toxin-removing Chinese medicine; heparanases (Hpa); obstructive nephropathy; inflammatory injury

*河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目：No.152777208

梁文杰，男，副教授，碩士生導(dǎo)師。

R

A

1007-5615(2017)02-0005-03

△河北省安平縣醫(yī)院

△△河北中醫(yī)學(xué)院 河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

△△△河北醫(yī)科大學(xué)(石家莊050017)