張紅波++高艷平++周恩旭 趙亞影 付莉 高慧茹++任元靜 朱小菲 秦少通

摘要：用胃蛋白酶對鯉魚魚肉進行水解，并在單因素試驗的基礎上選取酶濃度、pH值、反應溫度、反應時間作為影響蛋白提取率的因素。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，采用4因素3水平響應面分析法對鯉魚多肽的提取工藝進行優(yōu)化研究，確定胃蛋白酶提取鯉魚多肽時的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明，胃蛋白酶酶解的最佳條件為酶質(zhì)量濃度17.77 mg/mL、溫度36.65 ℃、時間3.7 h、pH值1.07，在該條件下多肽提取質(zhì)量濃度為1.97 mg/mL。

關鍵詞：鯉魚；胰蛋白酶；多肽；響應面法

中圖分類號： TS254.1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）03-0151-04

[HJ1.4mm]

收稿日期：2015-12-17

基金項目：河南省教育廳科學技術(shù)研究重點項目（編號：13A180044）。

作者簡介：張紅波（1982—），男，河南遂平人，碩士，講師，主要從事生物工程研究。E-mail：zhanghongbo009@163.com。[HJ]

鯉魚屬魚綱鯉科，是淡水魚類中品種最多、分布最廣、養(yǎng)殖歷史最悠久、產(chǎn)量最高的品種之一。從消費品種上看，我國水產(chǎn)品中魚類消費占50%以上；在消費的魚類產(chǎn)品中，消費總量超過200萬t的魚類有草魚、鳙魚、鰱魚、鯽魚、鯉魚，這5類魚占淡水魚消費總量的70%以上。鯉魚味道鮮美，深受廣大消費者的喜愛，其魚肉中蛋白質(zhì)含量高，質(zhì)量極佳，易被人體消化吸收。蛋白質(zhì)在人體內(nèi)由蛋白酶水解成小肽進行吸收。研究發(fā)現(xiàn)，多肽比氨基酸更易被人體吸收利用，且多肽具有多種生物學作用。某些多肽能夠清除生物體內(nèi)過量的游離基、自由基等，抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，保護細胞及其細胞器的正常生理結(jié)構(gòu)和功能[1]。有些多肽還具有抗疲勞、耐缺氧、抗腫瘤的生物學作用[2-6]。此外，有些多肽具有免疫調(diào)節(jié)[7]、抗菌[8]、舒張血管的作用[9]。然而，我國對魚類的加工技術(shù)還不是特別成熟，水產(chǎn)養(yǎng)殖與相關食品加工行業(yè)的生產(chǎn)效益并不高，且加工形式比較單調(diào)。本研究根據(jù)鯉魚多肽的性質(zhì)，利用酶解法提取鯉魚多肽，并在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，采用響應面分析法對酶解法制備鯉魚多肽的工藝進行優(yōu)化研究，以期得到合理的提取工藝，提高鯉魚多肽的提取率，為探究鯉魚的附加價值和工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎和科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

鮮活鯉魚，購自當?shù)厥袌?。胃蛋白酶、Tris-堿，均購自上海百賽生物技術(shù)有限公司；雙縮脲A、B，購自上海振品化工有限公司。其他試劑均為分析純。

主要儀器：B1312511型超純水儀，HWS28型電子恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司），101-1SA型定時恒溫鼓風干燥箱（金壇市盛藍儀器制造有限公司），F(xiàn)E20型實驗室pH計，ME204E型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），EnSpireTM型酶標儀（鉑金埃爾默儀器[上海]有限公司），WND型二兩裝高速中藥粉碎機（浙江省蘭溪市偉能達電器有限公司）。

1.2多肽的提取與測定

取新鮮鯉魚，去除鱗片和內(nèi)臟等器官，洗凈。選取魚腹肉，稱質(zhì)量后蒸熟，按1 ∶[KG-*3]3的質(zhì)量比添加調(diào)好pH值的Tris-HCl緩沖液，用絞碎機絞碎；取0.5 mL魚漿，按1 ∶[KG-*3]2的體積比添加一定濃度的蛋白酶液，在恒溫水浴鍋中進行水浴，之后用 100 ℃ 沸水滅酶活處理10 min，以4 000 r/min離心 15 min；取上清，按1 ∶[KG-*3]1的體積比添加10%三氯乙酸（TCA），充分混勻后靜置 10 min，以4 000 r/min離心15 min；取上清，與5% TCA按 1 ∶[KG-*3]9 的體積比充分混合，靜置10 min；取 120 mL 上述溶液，按 3 ∶[KG-*3]2 的體積比與雙縮脲試劑混合（以5% TCA作為空白對照），靜置10 min，以2 000 r/min離心 10 min；取上清，置于96孔板中，于540 nm測定吸光度[11]。

1.3標準曲線的繪制

配置4 mg/mL的四肽甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸（Gly-Gly-Tyr-Arg）溶液，用5% TCA進行稀釋，分別稀釋至3.500、3.000、2.500、2.000、1.500、1.000、0.500、0.250、0.125 mg/mL。取不同稀釋程度的四肽溶液（包括4 mg/mL）120 mL，按3 ∶[KG-*3]2的體積比添加雙縮脲試劑，靜置10 min使之[LM]充分反應；以2 000 r/min離心 10 min，取上清置于96孔板中，于540 nm測定吸光度，根據(jù)所得D540 nm繪制標準曲線。

1.4單因素試驗

單因素水平如下：胃蛋白酶質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4、5、10、15、20、25 mg/mL，pH值分別為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、30，溫度分別為30、35、40、45、50、55、60 ℃，時間分別為2、3、4、5、6、7 h。

1.5酶解制備多肽響應面優(yōu)化設計

在單因素試驗的基礎上，按照Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以酶解溫度、時間、酶質(zhì)量濃度、pH值為自變量，以D540 nm為響應值，自變量的高、中、低水平分別用1、0、-1編碼值表示（表1）。

2結(jié)果與分析

2.1胃蛋白酶處理的單因素試驗結(jié)果

pH值1.5、反應時間4 h、反應溫度40 ℃時，測定不同酶質(zhì)量濃度對多肽提取的影響。圖1-A結(jié)果顯示，當酶質(zhì)量濃度小于15 mg/mL時，D540 nm隨著酶質(zhì)量濃度的增大而增大；當酶質(zhì)量濃度為15 mg/mL時，D540 nm達最大值。選擇 15 mg/mL 作為反應的最佳酶質(zhì)量濃度。

pH值1.5、反應溫度40 ℃、酶質(zhì)量濃度15 mg/mL時，以酶解時間為自變量，測定酶解時間對多肽提取的影響。結(jié)果顯示，當酶解時間低于4 h時，D540 nm隨著溫度的升高而提高；當酶解時間為4 h時，D540 nm有最大值（圖1-B）。選擇4 h作為反應的最佳酶解時間。

pH值1.5、反應時間4 h、酶質(zhì)量濃度15 mg/mL時，以酶解溫度為變量，測定酶解溫度對多肽提取的影響。結(jié)果顯示，當溫度低于40 ℃時，D540 nm隨著溫度的升高而提高；當溫度為40 ℃時，D540 nm有最大值（圖1-C）。選擇40 ℃作為反應的最佳酶解溫度。

酶質(zhì)量濃度15 mg/mL、反應時間4 h、反應溫度40 ℃時，以pH值為變量，測定pH值對多肽提取的影響。結(jié)果顯示，當pH值小于1.0時，D540 nm隨著pH值的增大而提高；當pH值為1.0時，D540 nm有最大值（圖1-D）。選擇1.0作為反應的最佳pH值。

2.2響應面分析胃蛋白酶水解效果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇酶解溫度、酶解時間、酶質(zhì)量濃度、pH值作為4個因素，以D540 nm為響應值，設計4因素3水平的響應面試驗。根據(jù)Box-Behnken試驗設計進行了27組試驗，其中1～24組為分析試驗和零點試驗，25～27組為中心點重復試驗，試驗組合見表2。

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件對D540 nm與各水解因[JP2]素進行多元回歸擬合，得到回歸方程：D540 nm=0.085+7.250×[JP3]10-4×A-8.917×10-4×B+3.525×10-3×C+4.958×10-3×[JP]D+2.425×10-3×A×B-2.250×10-3×A×C-3350×10-3×A×D-1.700×10-3×B×C-2.750×10-3×B×D-[JP2]2.325×10-3×C×D-2.454×10-3×A2-4.979×10-3×B2-[JP]4.079×10-3×C2-0.022×D2。

方差分析結(jié)果（表3）顯示，試驗中一次項C（酶質(zhì)量濃度）、D（pH值）及時間、酶質(zhì)量濃度、pH值的二次項影響較為顯著，在試驗范圍內(nèi)模型的“P值>F值”<0.000 1，表明該二次多項式回歸方程模型達到了極顯著水平，具有較高的可靠性；R2=0.946 8，表明試驗值與預測值高度相關，即相應[JP2]值的變化有94.68%來自所選變量；同時變異系數(shù)（CV）=[JP]561%，且失擬項不顯著（P=0.069 7>0.05），表明實際值與模型預測值有較好的擬合度?？梢?，試驗所建立的數(shù)學回歸模型擬合度高，可較好地反映各因素與響應值間的真實關系，因[CM（25]此采用該數(shù)學模型預測胃蛋白酶提取鯉魚多肽的提取條件。

各因素對D540 nm的影響不是簡單的線性關系，其影響效果由F值可得，4個因素對響應值的影響大小依次為D（pH值）>C（酶質(zhì)量濃度）>B（時間）>A（溫度）。

利用二次多項式回歸方程和Design-Expert 8.0.6.1[JP2]軟件作圖分析（圖2）。所得回歸方程為D540 nm=0.085+7.250×[JP]10-4×A-8.917×10-4×B+3.525×10-3×C+4.958×10-3×D+2.425×10-3×A×B-2.250×10-3×A×C-3350×10-3×A×D-1.700×10-3×B×C-2.750×10-3×B×D-2.325×10-3×C×D-2.454×10-3×A2-4.979×10-3×B2-4.079×10-3×C2-0.022×D2。

對上述回歸方程求解，可得A=36.65、B=3.70、C=1777、D=1.07，D540 nm有最大值0.086 1。對照標準曲線即可得到當前體系下多肽的質(zhì)量濃度為1.97 mg/mL，即胃蛋白酶酶解鯉魚多肽的最佳條件組合為溫度36.65 ℃、時間 3.7 h、酶質(zhì)量濃度17.77 mg/mL、pH值1.07，此時D540 nm為 0.086 1。為驗證模型預測的準確性，于溫度36.7 ℃、時間37 h、加酶量17.74 mg/mL、pH值1.06條件下進行試驗，實際測得D540 nm為0.086 3。實測值與理論值的誤差在±1%左右，可見此模型能較好地預測酶水解的最佳條件，預測條件可作為最佳水解條件。

[BT1-*5]3結(jié)論與討論

3.1酶質(zhì)量濃度對酶解結(jié)果的影響

當酶用量過少時，底物濃度遠遠大于酶濃度，反應系統(tǒng)中酶促反應速度與酶濃度成正比，隨著酶用量的增大，酶解液中蛋白質(zhì)、多肽與酶作用的機會大大增加，分解為游離氨基酸[10]。酶分子過量時，很多酶分子根本不能發(fā)揮作用，水解度相對降低，造成不必要的浪費。本試驗中，當酶質(zhì)量濃度為15 mg/mL時反應效果最佳。響應面分析表明，酶質(zhì)量濃度對胃蛋白酶的提取效果影響較大。

3.2pH值對反應結(jié)果的影響

酶分子是一種特殊的蛋白質(zhì)分子，具有若干個活性部位，酶的活性部位由結(jié)合位點和催化位點組成。結(jié)合部位和催化部位對反應體系的pH值變化比較敏感，其解離狀態(tài)隨pH值的變化而變化，這些變化影響了酶分子的特殊構(gòu)象。pH值的變化直接影響了酶與底物的結(jié)合和催化，是酶催化反應的主要因素之一[11]。胃蛋白酶的最適pH值范圍約為1.0～2.0，試驗測得最佳pH值為1.06，符合胃蛋白酶的反應要求。響應面綜合分析各因素表明，pH值對胃蛋白酶的影響較大。

3.3反應溫度對反應結(jié)果的影響

溫度對酶活力的影響較大[12-13]。溫度較低時，酶活力受到抑制；隨著溫度的升高，加速水解反應處于主導地位，達到最適溫度后，酶失活處于主導地位，酶活隨溫度的升高而下降[14]。因此，本研究選取反應溫度為36.65 ℃。響應面分析表明，溫度對胃蛋白酶的影響較小。

3.4反應時間對反應結(jié)果的影響

隨著酶解時間的延長，多肽被繼續(xù)水解成氨基酸[15]，當反應時間為4 h時，D540 nm達到最大值，可作為最佳的提取條件。達到最適時間后出現(xiàn)了下降趨勢，可能是由于水解過于充分，導致水解產(chǎn)生了單個氨基酸，在雙縮脲反應中無法產(chǎn)生顏色反應。

3.5結(jié)論

通過單因素試驗和響應面試驗，得到了胃蛋白酶處理的最佳條件為溫度36.65 ℃、時間3.7 h、酶質(zhì)量濃度 17.77 mg/mL、pH值1.07，此體系下的多肽提取質(zhì)量濃度為1.97 mg/mL。本研究表明，基于響應面法分析所得的優(yōu)化胃蛋白酶酶解提取鯉魚多肽的工藝參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

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