謝林娜++蘇夢(mèng)蕓++朱明明++貢宏濤++朱麗梅++徐敏++張波
摘要:采用酶聯(lián)免疫法對(duì)來(lái)源于國(guó)內(nèi)不同蝴蝶蘭種植場(chǎng)9個(gè)蝴蝶蘭品種的45個(gè)樣本攜帶建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的情況進(jìn)行檢測(cè)調(diào)查。結(jié)果表明:(1)9個(gè)蝴蝶蘭品種的45株苗中共有9株感染建蘭花葉病毒,感染率為20%,強(qiáng)陽(yáng)性概率為2.2%;9個(gè)品種中均有樣本檢測(cè)出齒蘭環(huán)斑病毒,45株苗中有32株感染齒蘭病毒病,感染率為711%,強(qiáng)陽(yáng)性率為37.8%;另有8株苗發(fā)生復(fù)合感染,感染率為17.8%,蝴蝶蘭中齒蘭環(huán)斑病毒的發(fā)生情況要明顯重于建蘭花葉病毒。不同品種蝴蝶蘭植株感染病毒后,在葉片上的病毒病癥狀初期主要表現(xiàn)為葉片上有明顯的褪綠、黃化現(xiàn)象,但有的病株不僅表現(xiàn)出黃化、褪綠,還形成了明顯的黃色斑點(diǎn)、斑紋以及皰狀結(jié)構(gòu),尤其是感染齒蘭環(huán)斑病毒和復(fù)合感染2種病毒的病株均發(fā)現(xiàn)發(fā)病的葉片后期會(huì)出現(xiàn)黑色向內(nèi)凹陷的壞死斑,部分品種的花也出現(xiàn)了異常癥狀,如紅色花瓣黃化和花瓣出現(xiàn)壞死斑。
關(guān)鍵詞:蝴蝶蘭;建蘭花葉病毒;齒蘭環(huán)斑病毒;ELISA檢測(cè)
中圖分類號(hào):S436.8+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
文章編號(hào):1002-1302(2017)03-0080-03
收稿日期:2015-12-28
基金項(xiàng)目:江蘇省大學(xué)生創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新計(jì)劃(編號(hào):201513573029Y);江蘇省南京市江寧區(qū)科技發(fā)展計(jì)劃(編號(hào):2015Ed01)。
作者簡(jiǎn)介:謝林娜(1993—),女,江蘇徐州人,主要從事蝴蝶蘭病毒檢測(cè)研究。E-mail:492205674@qq.con。
通信作者:朱麗梅,博士,教授,主要從事園藝植物病蟲(chóng)害及防治的教學(xué)與科研工作。E-mail:910703164@qq.com。
蝴蝶蘭是蘭科蝴蝶蘭屬(Phalaenopsis)中重要的觀賞植物,蘭花病毒病一直是嚴(yán)重危害蝴蝶蘭品質(zhì)的一類重要病害,目前世界上已報(bào)道的蘭花病毒有25種,寄主范圍廣泛、易傳染、防治困難。其中發(fā)生最廣、危害最嚴(yán)重的是建蘭花葉病毒(Cymbidium mosaie potexvirus,CymMV)和齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossum ringspot to-bamovirus,ORSV),且經(jīng)常發(fā)生復(fù)合感染的情況。這2種病毒能使蘭花葉片形成褪色斑、壞死斑、花葉斑等癥狀,致使蝴蝶蘭植株生長(zhǎng)不良、葉片無(wú)光澤、花朵質(zhì)量下降,甚至植株死亡,降低了蝴蝶蘭的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,給蝴蝶蘭的生產(chǎn)企業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。目前國(guó)際上對(duì)蝴蝶蘭病毒病還未有防治的有效藥劑,因此對(duì)病毒病的早期發(fā)現(xiàn),早期隔離處理病株非常有必要,但蝴蝶蘭病株早期通常只有輕微的癥狀表現(xiàn),或根本不表現(xiàn)病癥,通過(guò)單純的癥狀觀察已經(jīng)無(wú)法確認(rèn),必須利用病毒檢測(cè)技術(shù)鑒定后才能確定是否染病并篩選無(wú)毒苗供進(jìn)一步無(wú)性繁殖試管苗,所以病毒檢測(cè)技術(shù)也是進(jìn)行植物脫除病毒工作的前提必備條件,通過(guò)病毒檢測(cè)技術(shù)鑒定出哪些植株攜帶有規(guī)定病毒,才能確定脫毒試驗(yàn)的研究對(duì)象[4-5]。
酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)蘭花病毒應(yīng)用范圍最廣的檢測(cè)技術(shù),與傳統(tǒng)方法相比具有檢測(cè)靈敏度強(qiáng)、特異性高以及檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn),其中雙抗體夾心ELISA和三抗體夾心ELISA應(yīng)用最為廣泛。有研究表明,該方法對(duì)蘭科不同屬類的2種主要病毒CymMV和ORSV的檢測(cè)具有較高的精確度和穩(wěn)定性,目前是蘭花病毒檢測(cè)的常規(guī)手段[6-9]。基于上述緣由,本研究采用雙抗體夾心ELISA和三抗體夾心ELISA對(duì)國(guó)產(chǎn)蝴蝶蘭種苗主要來(lái)源地(廣東省、江蘇省等基地)生產(chǎn)的9個(gè)蝴蝶蘭品種試管苗攜帶2種主要病毒的情況進(jìn)行檢測(cè)調(diào)查,以期了解國(guó)內(nèi)蝴蝶蘭生產(chǎn)用苗攜帶病毒的真實(shí)狀況,同時(shí)本研究還對(duì)不同花系感染2種病毒后的癥狀進(jìn)行了比較和分析,以期為蝴蝶蘭的種植及蘭花病毒病害防治提供參考和依據(jù)。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
蝴蝶蘭檢測(cè)樣本為從廣東省、江蘇省等蝴蝶蘭種植基地購(gòu)買的試管苗,一共3個(gè)色系9個(gè)品種,其中紅色花系包括巨寶、汕農(nóng)鳳凰、超群九號(hào)、香妃4個(gè)品種,樣品編號(hào)分別為247、359、257、363;粉色花系包括芝娃娃、五彩珍珠,樣品編號(hào)分別為207、732;黃色花系包括萬(wàn)花筒、黃金男孩、幻想曲,樣品編號(hào)分別為369、890、743。
樣品提取緩沖液、包被緩沖液、PBST緩沖液、ECI緩沖液、PNP緩沖液、包被用的抗體(CymMV和ORSV)、堿性磷酸酶標(biāo)記物(CymMV和ORSV),還有96孔微孔板,陽(yáng)性對(duì)照品等購(gòu)自上海必優(yōu)生生物公司,其余藥品均為分析純,購(gòu)自生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司。
1.2試驗(yàn)方法
本試驗(yàn)對(duì)溫室中不同品種的蝴蝶蘭植株進(jìn)行標(biāo)記,每個(gè)品種5株成熟植株作為檢測(cè)樣本,采取樣本葉片作為檢測(cè)材料,運(yùn)用ELISA血清法進(jìn)行病毒檢測(cè),統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性率。
[JP+1]本試驗(yàn)采用ELISA血清學(xué)檢測(cè)方法,分別對(duì)樣品建蘭花葉病毒(CymMV)和齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)2種蘭花病毒進(jìn)行獨(dú)立互不干擾的病毒檢測(cè)工作,[JP+1]由于2種病毒的檢測(cè)操作方法基本相同,所以以下試驗(yàn)步驟均適用于2種病毒的檢測(cè)。[JP]
1.2.1DAS-ELISA方法檢測(cè)ORSV的步驟
1.2.1.1包被酶標(biāo)板和孵育
每孔加抗體溶液100 μL,將酶標(biāo)板置于4 ℃條件下過(guò)夜(但不要長(zhǎng)于24 h)。孵育結(jié)束后,將反應(yīng)孔中的試劑倒出,再加入250 μL PBST緩沖液,之后快速倒出,2次以上。洗好后將微孔板倒扣在吸水紙上以弄干孔中殘留液體。
1.2.1.2樣品的提取及點(diǎn)樣孵育
[JP2]本試驗(yàn)以蝴蝶蘭植株的葉片作ELISA試驗(yàn)的檢測(cè)樣品,將葉片剪碎后,再用研缽將其研磨至綠色汁液全部浸出,在每份樣品提取后徹底清洗研缽,以免造成樣品間的相互污染。樣品研磨后,按1 ∶[KG-*3]10[樣品質(zhì)量(g) ∶[KG-*3]提取緩沖液體積(mL)]的比例在提取緩沖液中研磨樣品。[JP]
根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)圖表,取100 μL樣品提取稀釋液于各樣品孔中,取100 μL樣品提取緩沖液于陰性對(duì)照孔中,取 100 μL 陽(yáng)性質(zhì)控物溶液于陽(yáng)性對(duì)照孔中。之后將微孔板放在恒濕箱中,置于冰箱4 ℃條件下過(guò)夜。
1.2.1.3酶標(biāo)記物的制備
點(diǎn)樣孵育時(shí)間結(jié)束后即進(jìn)行洗板,將反應(yīng)孔中的試劑倒出,再加入250 μL PBST緩沖液,之后快速倒出,重復(fù)7次。之后在各反應(yīng)孔中加入100 μL酶標(biāo)記物稀釋液,在恒濕箱中室溫(25 ℃)下孵育2 h。
1.2.1.4顯色與讀數(shù)
酶標(biāo)記物孵育結(jié)束后進(jìn)行洗板,步驟同“1.2.1.3”節(jié),重復(fù)8次。之后在各反應(yīng)孔中加入100 μL PNP底物溶液,在恒濕箱中避光孵育60 min。出現(xiàn)顏色反應(yīng)后,以2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng),在酶標(biāo)儀上以波長(zhǎng) 405 nm 讀數(shù)。
1.2.2TAS-ELISA方法檢測(cè)CyMV的步驟
除加入的包被抗體和酶標(biāo)抗體不一樣,操作步驟與“1.2.1”節(jié)所述相同?!?.2.1”節(jié)中的包被抗體是兔抗ORSV,酶標(biāo)抗體是堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗ORSV,本法中的包被抗體是鼠抗CymMV和酶標(biāo)抗體是堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗-鼠抗CymMV。
1.2.3數(shù)據(jù)分析
根據(jù)P/N值對(duì)所測(cè)樣品的帶毒情況進(jìn)行評(píng)估,其中P/N<2視為陰性,P/N≥2視為陽(yáng)性(染?。琍/N>5視為強(qiáng)陽(yáng)性。利用SPSS軟件對(duì)脫毒試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著差異性分析,P/N=樣品孔D405 nm/陰性孔D405 nm。
2結(jié)果與分析
2.1不同品種蝴蝶蘭2種病毒的ELISA檢測(cè)結(jié)果
由表1可知,9個(gè)蝴蝶蘭品種的45株苗中共有9株感染建蘭花葉病毒病,感染率為20%,強(qiáng)陽(yáng)性概率為2.2%,其中247、369、890號(hào)這3個(gè)品種的樣本中均沒(méi)檢測(cè)出建蘭花葉病毒,743號(hào)品種樣本的感染率最高,為60%,其次為363號(hào)品種,感染率為40%。所檢測(cè)的9個(gè)品種均有樣本檢測(cè)出齒蘭環(huán)斑病毒,被檢測(cè)的45個(gè)樣本中,32株感染齒蘭病毒病,總計(jì)感染率為71.1%,強(qiáng)陽(yáng)性率為37.8%。另有8株苗發(fā)生復(fù)合感染,感染率為17.8%,其中743、359、207號(hào)的感染率最高,達(dá)到100%,3個(gè)品種的強(qiáng)陽(yáng)性率也分別達(dá)到40%、80%、20%,其次為890,5個(gè)樣本中有4個(gè)陽(yáng)性,369品種病毒的感染率最低,為20.0%,這45個(gè)樣本2種病毒檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明蝴蝶蘭齒蘭環(huán)斑病毒的感染情況要明顯重于建蘭花葉病毒。
2.2不同品種蝴蝶蘭病毒病的癥狀觀察
所檢測(cè)的9個(gè)蝴蝶蘭品種,無(wú)論是感染建蘭花葉病毒還是感染齒蘭環(huán)斑病毒或者復(fù)合感染,病株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)初期在葉片上表現(xiàn)出明顯的褪綠、黃化(圖1-2、圖2-1、圖2-2、圖3-2、圖4-1、圖5-1、圖6-1、圖7-1),有的病株在初期不僅表現(xiàn)出黃化,還形成了明顯的黃色斑點(diǎn)、斑紋等花葉癥狀(圖1-1、圖3-1、圖6-2、圖6-3、圖7-1、圖7-2、圖8-1、圖8-2、圖9-1、圖9-2、圖9-3),感染齒蘭環(huán)斑病毒和復(fù)合感染的病株發(fā)病葉片上出現(xiàn)明顯的壞死斑,也有的病株樣本葉片出現(xiàn)大量、小的壞死凹陷斑,如890號(hào)復(fù)合感染的病葉(圖6-3),207號(hào)單獨(dú)感染齒蘭環(huán)斑病毒的病葉(圖3-3、圖3-5),其余病株樣本則出現(xiàn)較大的、黑色凹陷病斑(圖3-6、圖4-3、圖5-2、圖7-2、圖9-4),部分品種的花也出現(xiàn)了癥狀,如開(kāi)紅花的247、257號(hào)花瓣明顯黃化(圖1-3、圖7-3),207、743號(hào)花瓣出現(xiàn)壞死斑(圖3-4、圖3-5、圖9-5)。
3結(jié)論與討論
本試驗(yàn)利用ELISA法對(duì)國(guó)內(nèi)一些較大型蝴蝶蘭生產(chǎn)基地常規(guī)品種的試管苗進(jìn)行2種主要蘭花病毒的檢測(cè)和調(diào)查。數(shù)據(jù)顯示,9個(gè)蝴蝶蘭品種的45株苗中共有9株感染建蘭花葉病毒病,感染率為20.0%,強(qiáng)陽(yáng)性概率為2.2%,32株感染齒蘭病毒病,感染率為71.1%,另有8株苗發(fā)生復(fù)合感染,感染率為17.8%。其中743、359、207號(hào)的感染率最高,達(dá)到100.0%,3個(gè)品種的強(qiáng)陽(yáng)性率也分別達(dá)到40.0%、800%、20.0%,說(shuō)明我國(guó)生產(chǎn)蝴蝶蘭種苗品質(zhì)不容樂(lè)觀,各蘭花基地種苗生產(chǎn)所面臨的品種由于嚴(yán)重帶毒而導(dǎo)致品質(zhì)退化。
據(jù)報(bào)道,蘭花病毒病的癥狀極其復(fù)雜,不同病毒病在不同時(shí)期侵染相同品種的蘭花,其癥狀各異;同種病毒侵染相同品種的蘭花,其癥狀也不盡相同。在栽培過(guò)程中,品種、栽培環(huán)境、季節(jié)、本身營(yíng)養(yǎng)條件等都會(huì)影響癥狀的表現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn),無(wú)論是紅花品種還是黃花品種,不同品種蝴蝶蘭植株感染病毒后,在葉片上都會(huì)形成明顯的病毒病癥狀,所檢測(cè)的9個(gè)品種無(wú)論是感染建蘭花葉病毒還是齒蘭環(huán)斑病毒或者復(fù)合感染,在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)初期病株的葉片上表現(xiàn)出明顯的褪綠、黃化癥狀, 感染齒蘭環(huán)斑病毒和復(fù)合感染的病株發(fā)病時(shí)葉片上出現(xiàn)[FL)]
[FK(W9][TPXLN9.tif;S+5mm][FK)][LM]
[KH*4D]
明顯的壞死斑。因此,蘭花植株是否有病毒病,是感染了建蘭花葉病毒還是齒蘭環(huán)斑病毒,或是其他病害,僅僅從癥狀上判斷是很不準(zhǔn)確的,仍然須要通過(guò)ELISA等方法測(cè)定才能確診,因此蝴蝶蘭的早期檢測(cè)以及脫毒研究引入生產(chǎn)環(huán)節(jié)勢(shì)在必行。
參考文獻(xiàn):
[1]Khentry Y,Paradornuwat A,Tantiwiwat S,et al. Incidence of Cymbidium mosaic virus and Odontoglossum ringspot virus in Dendrobium spp. in Thailand[J]. Crop Protection,2006,25(9):926-932.
[2]Hu J S,F(xiàn)erreira S. Detection of Cymbidium mosaic virus,Odonto-glossum ringspot virus,tomato spotted wilt virus,and potyvirues infecting orchids in Hawaii[J]. Plant Disease,1993,77(5):464-467.
[3]沛然. CymMV及ORSV在蝴蝶蘭上的癥狀表現(xiàn)及高溫對(duì)其影響[D]. 北京:北京林業(yè)大學(xué),2009.
[4]靖晶. 蝴蝶蘭組織培養(yǎng)與脫除病毒技術(shù)研究[D]. 北京:北京林業(yè)大學(xué),2011.
[5]柳愛(ài)春,劉超,趙蕓,等. 利用ELISA檢測(cè)兩種蘭花病毒的研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,21(2):91-95.
[6]宋海超,張勇,刑波,等. 熱帶蘭花兩種病毒的ELISA檢測(cè)[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào),2011,2(2):148-152.
[7]高煥利. 齊茄黑環(huán)病毒和建蘭花葉病毒檢測(cè)方法的研究[D]. 楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2007.
[8]潘俊松,劉志昕. 建蘭花葉病毒的分離、鑒定及檢測(cè)研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào),1997,18(1):63-70.
[9][JP2]明艷林,李梅,鄭國(guó)華. RT-PCR檢測(cè)齒蘭環(huán)斑病毒技術(shù)的建立[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,32(3):345-347.