謝林娜++蘇夢(mèng)蕓++朱明明++貢宏濤++朱麗梅++徐敏++張波

摘要：采用酶聯(lián)免疫法對(duì)來(lái)源于國(guó)內(nèi)不同蝴蝶蘭種植場(chǎng)9個(gè)蝴蝶蘭品種的45個(gè)樣本攜帶建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的情況進(jìn)行檢測(cè)調(diào)查。結(jié)果表明：（1）9個(gè)蝴蝶蘭品種的45株苗中共有9株感染建蘭花葉病毒，感染率為20%，強(qiáng)陽(yáng)性概率為2.2%；9個(gè)品種中均有樣本檢測(cè)出齒蘭環(huán)斑病毒，45株苗中有32株感染齒蘭病毒病，感染率為711%，強(qiáng)陽(yáng)性率為37.8%；另有8株苗發(fā)生復(fù)合感染，感染率為17.8%，蝴蝶蘭中齒蘭環(huán)斑病毒的發(fā)生情況要明顯重于建蘭花葉病毒。不同品種蝴蝶蘭植株感染病毒后，在葉片上的病毒病癥狀初期主要表現(xiàn)為葉片上有明顯的褪綠、黃化現(xiàn)象，但有的病株不僅表現(xiàn)出黃化、褪綠，還形成了明顯的黃色斑點(diǎn)、斑紋以及皰狀結(jié)構(gòu)，尤其是感染齒蘭環(huán)斑病毒和復(fù)合感染2種病毒的病株均發(fā)現(xiàn)發(fā)病的葉片后期會(huì)出現(xiàn)黑色向內(nèi)凹陷的壞死斑，部分品種的花也出現(xiàn)了異常癥狀，如紅色花瓣黃化和花瓣出現(xiàn)壞死斑。

關(guān)鍵詞：蝴蝶蘭；建蘭花葉病毒；齒蘭環(huán)斑病毒；ELISA檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S436.8+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）03-0080-03

收稿日期：2015-12-28

基金項(xiàng)目：江蘇省大學(xué)生創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新計(jì)劃（編號(hào)：201513573029Y）；江蘇省南京市江寧區(qū)科技發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：2015Ed01）。

作者簡(jiǎn)介：謝林娜（1993—），女，江蘇徐州人，主要從事蝴蝶蘭病毒檢測(cè)研究。E-mail：492205674@qq.con。

通信作者：朱麗梅，博士，教授，主要從事園藝植物病蟲(chóng)害及防治的教學(xué)與科研工作。E-mail：910703164@qq.com。

蝴蝶蘭是蘭科蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis）中重要的觀賞植物，蘭花病毒病一直是嚴(yán)重危害蝴蝶蘭品質(zhì)的一類重要病害，目前世界上已報(bào)道的蘭花病毒有25種，寄主范圍廣泛、易傳染、防治困難。其中發(fā)生最廣、危害最嚴(yán)重的是建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaie potexvirus，CymMV）和齒蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossum ringspot to-bamovirus，ORSV），且經(jīng)常發(fā)生復(fù)合感染的情況。這2種病毒能使蘭花葉片形成褪色斑、壞死斑、花葉斑等癥狀，致使蝴蝶蘭植株生長(zhǎng)不良、葉片無(wú)光澤、花朵質(zhì)量下降，甚至植株死亡，降低了蝴蝶蘭的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，給蝴蝶蘭的生產(chǎn)企業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。目前國(guó)際上對(duì)蝴蝶蘭病毒病還未有防治的有效藥劑，因此對(duì)病毒病的早期發(fā)現(xiàn)，早期隔離處理病株非常有必要，但蝴蝶蘭病株早期通常只有輕微的癥狀表現(xiàn)，或根本不表現(xiàn)病癥，通過(guò)單純的癥狀觀察已經(jīng)無(wú)法確認(rèn)，必須利用病毒檢測(cè)技術(shù)鑒定后才能確定是否染病并篩選無(wú)毒苗供進(jìn)一步無(wú)性繁殖試管苗，所以病毒檢測(cè)技術(shù)也是進(jìn)行植物脫除病毒工作的前提必備條件，通過(guò)病毒檢測(cè)技術(shù)鑒定出哪些植株攜帶有規(guī)定病毒，才能確定脫毒試驗(yàn)的研究對(duì)象[4-5]。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)蘭花病毒應(yīng)用范圍最廣的檢測(cè)技術(shù)，與傳統(tǒng)方法相比具有檢測(cè)靈敏度強(qiáng)、特異性高以及檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)，其中雙抗體夾心ELISA和三抗體夾心ELISA應(yīng)用最為廣泛。有研究表明，該方法對(duì)蘭科不同屬類的2種主要病毒CymMV和ORSV的檢測(cè)具有較高的精確度和穩(wěn)定性，目前是蘭花病毒檢測(cè)的常規(guī)手段[6-9]。基于上述緣由，本研究采用雙抗體夾心ELISA和三抗體夾心ELISA對(duì)國(guó)產(chǎn)蝴蝶蘭種苗主要來(lái)源地（廣東省、江蘇省等基地）生產(chǎn)的9個(gè)蝴蝶蘭品種試管苗攜帶2種主要病毒的情況進(jìn)行檢測(cè)調(diào)查，以期了解國(guó)內(nèi)蝴蝶蘭生產(chǎn)用苗攜帶病毒的真實(shí)狀況，同時(shí)本研究還對(duì)不同花系感染2種病毒后的癥狀進(jìn)行了比較和分析，以期為蝴蝶蘭的種植及蘭花病毒病害防治提供參考和依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

蝴蝶蘭檢測(cè)樣本為從廣東省、江蘇省等蝴蝶蘭種植基地購(gòu)買的試管苗，一共3個(gè)色系9個(gè)品種，其中紅色花系包括巨寶、汕農(nóng)鳳凰、超群九號(hào)、香妃4個(gè)品種，樣品編號(hào)分別為247、359、257、363；粉色花系包括芝娃娃、五彩珍珠，樣品編號(hào)分別為207、732；黃色花系包括萬(wàn)花筒、黃金男孩、幻想曲，樣品編號(hào)分別為369、890、743。

樣品提取緩沖液、包被緩沖液、PBST緩沖液、ECI緩沖液、PNP緩沖液、包被用的抗體（CymMV和ORSV）、堿性磷酸酶標(biāo)記物（CymMV和ORSV），還有96孔微孔板，陽(yáng)性對(duì)照品等購(gòu)自上海必優(yōu)生生物公司，其余藥品均為分析純，購(gòu)自生工生物工程（上海）技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)對(duì)溫室中不同品種的蝴蝶蘭植株進(jìn)行標(biāo)記，每個(gè)品種5株成熟植株作為檢測(cè)樣本，采取樣本葉片作為檢測(cè)材料，運(yùn)用ELISA血清法進(jìn)行病毒檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性率。

[JP+1]本試驗(yàn)采用ELISA血清學(xué)檢測(cè)方法，分別對(duì)樣品建蘭花葉病毒（CymMV）和齒蘭環(huán)斑病毒（ORSV）2種蘭花病毒進(jìn)行獨(dú)立互不干擾的病毒檢測(cè)工作，[JP+1]由于2種病毒的檢測(cè)操作方法基本相同，所以以下試驗(yàn)步驟均適用于2種病毒的檢測(cè)。[JP]

1.2.1DAS-ELISA方法檢測(cè)ORSV的步驟

1.2.1.1包被酶標(biāo)板和孵育

每孔加抗體溶液100 μL，將酶標(biāo)板置于4 ℃條件下過(guò)夜（但不要長(zhǎng)于24 h）。孵育結(jié)束后，將反應(yīng)孔中的試劑倒出，再加入250 μL PBST緩沖液，之后快速倒出，2次以上。洗好后將微孔板倒扣在吸水紙上以弄干孔中殘留液體。

1.2.1.2樣品的提取及點(diǎn)樣孵育

[JP2]本試驗(yàn)以蝴蝶蘭植株的葉片作ELISA試驗(yàn)的檢測(cè)樣品，將葉片剪碎后，再用研缽將其研磨至綠色汁液全部浸出，在每份樣品提取后徹底清洗研缽，以免造成樣品間的相互污染。樣品研磨后，按1 ∶[KG-*3]10[樣品質(zhì)量（g） ∶[KG-*3]提取緩沖液體積（mL）]的比例在提取緩沖液中研磨樣品。[JP]

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)圖表，取100 μL樣品提取稀釋液于各樣品孔中，取100 μL樣品提取緩沖液于陰性對(duì)照孔中，取 100 μL 陽(yáng)性質(zhì)控物溶液于陽(yáng)性對(duì)照孔中。之后將微孔板放在恒濕箱中，置于冰箱4 ℃條件下過(guò)夜。

1.2.1.3酶標(biāo)記物的制備

點(diǎn)樣孵育時(shí)間結(jié)束后即進(jìn)行洗板，將反應(yīng)孔中的試劑倒出，再加入250 μL PBST緩沖液，之后快速倒出，重復(fù)7次。之后在各反應(yīng)孔中加入100 μL酶標(biāo)記物稀釋液，在恒濕箱中室溫（25 ℃）下孵育2 h。

1.2.1.4顯色與讀數(shù)

酶標(biāo)記物孵育結(jié)束后進(jìn)行洗板，步驟同“1.2.1.3”節(jié)，重復(fù)8次。之后在各反應(yīng)孔中加入100 μL PNP底物溶液，在恒濕箱中避光孵育60 min。出現(xiàn)顏色反應(yīng)后，以2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上以波長(zhǎng) 405 nm 讀數(shù)。

1.2.2TAS-ELISA方法檢測(cè)CyMV的步驟

除加入的包被抗體和酶標(biāo)抗體不一樣，操作步驟與“1.2.1”節(jié)所述相同?！?.2.1”節(jié)中的包被抗體是兔抗ORSV，酶標(biāo)抗體是堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗ORSV，本法中的包被抗體是鼠抗CymMV和酶標(biāo)抗體是堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗-鼠抗CymMV。

1.2.3數(shù)據(jù)分析

根據(jù)P/N值對(duì)所測(cè)樣品的帶毒情況進(jìn)行評(píng)估，其中P/N<2視為陰性，P/N≥2視為陽(yáng)性（染?。琍/N>5視為強(qiáng)陽(yáng)性。利用SPSS軟件對(duì)脫毒試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著差異性分析，P/N=樣品孔D405 nm/陰性孔D405 nm。

2結(jié)果與分析

2.1不同品種蝴蝶蘭2種病毒的ELISA檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，9個(gè)蝴蝶蘭品種的45株苗中共有9株感染建蘭花葉病毒病，感染率為20%，強(qiáng)陽(yáng)性概率為2.2%，其中247、369、890號(hào)這3個(gè)品種的樣本中均沒(méi)檢測(cè)出建蘭花葉病毒，743號(hào)品種樣本的感染率最高，為60%，其次為363號(hào)品種，感染率為40%。所檢測(cè)的9個(gè)品種均有樣本檢測(cè)出齒蘭環(huán)斑病毒，被檢測(cè)的45個(gè)樣本中，32株感染齒蘭病毒病，總計(jì)感染率為71.1%，強(qiáng)陽(yáng)性率為37.8%。另有8株苗發(fā)生復(fù)合感染，感染率為17.8%，其中743、359、207號(hào)的感染率最高，達(dá)到100%，3個(gè)品種的強(qiáng)陽(yáng)性率也分別達(dá)到40%、80%、20%，其次為890，5個(gè)樣本中有4個(gè)陽(yáng)性，369品種病毒的感染率最低，為20.0%，這45個(gè)樣本2種病毒檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明蝴蝶蘭齒蘭環(huán)斑病毒的感染情況要明顯重于建蘭花葉病毒。

2.2不同品種蝴蝶蘭病毒病的癥狀觀察

所檢測(cè)的9個(gè)蝴蝶蘭品種，無(wú)論是感染建蘭花葉病毒還是感染齒蘭環(huán)斑病毒或者復(fù)合感染，病株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)初期在葉片上表現(xiàn)出明顯的褪綠、黃化（圖1-2、圖2-1、圖2-2、圖3-2、圖4-1、圖5-1、圖6-1、圖7-1），有的病株在初期不僅表現(xiàn)出黃化，還形成了明顯的黃色斑點(diǎn)、斑紋等花葉癥狀（圖1-1、圖3-1、圖6-2、圖6-3、圖7-1、圖7-2、圖8-1、圖8-2、圖9-1、圖9-2、圖9-3），感染齒蘭環(huán)斑病毒和復(fù)合感染的病株發(fā)病葉片上出現(xiàn)明顯的壞死斑，也有的病株樣本葉片出現(xiàn)大量、小的壞死凹陷斑，如890號(hào)復(fù)合感染的病葉（圖6-3），207號(hào)單獨(dú)感染齒蘭環(huán)斑病毒的病葉（圖3-3、圖3-5），其余病株樣本則出現(xiàn)較大的、黑色凹陷病斑（圖3-6、圖4-3、圖5-2、圖7-2、圖9-4），部分品種的花也出現(xiàn)了癥狀，如開(kāi)紅花的247、257號(hào)花瓣明顯黃化（圖1-3、圖7-3），207、743號(hào)花瓣出現(xiàn)壞死斑（圖3-4、圖3-5、圖9-5）。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)利用ELISA法對(duì)國(guó)內(nèi)一些較大型蝴蝶蘭生產(chǎn)基地常規(guī)品種的試管苗進(jìn)行2種主要蘭花病毒的檢測(cè)和調(diào)查。數(shù)據(jù)顯示，9個(gè)蝴蝶蘭品種的45株苗中共有9株感染建蘭花葉病毒病，感染率為20.0%，強(qiáng)陽(yáng)性概率為2.2%，32株感染齒蘭病毒病，感染率為71.1%，另有8株苗發(fā)生復(fù)合感染，感染率為17.8%。其中743、359、207號(hào)的感染率最高，達(dá)到100.0%，3個(gè)品種的強(qiáng)陽(yáng)性率也分別達(dá)到40.0%、800%、20.0%，說(shuō)明我國(guó)生產(chǎn)蝴蝶蘭種苗品質(zhì)不容樂(lè)觀，各蘭花基地種苗生產(chǎn)所面臨的品種由于嚴(yán)重帶毒而導(dǎo)致品質(zhì)退化。

據(jù)報(bào)道，蘭花病毒病的癥狀極其復(fù)雜，不同病毒病在不同時(shí)期侵染相同品種的蘭花，其癥狀各異；同種病毒侵染相同品種的蘭花，其癥狀也不盡相同。在栽培過(guò)程中，品種、栽培環(huán)境、季節(jié)、本身營(yíng)養(yǎng)條件等都會(huì)影響癥狀的表現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是紅花品種還是黃花品種，不同品種蝴蝶蘭植株感染病毒后，在葉片上都會(huì)形成明顯的病毒病癥狀，所檢測(cè)的9個(gè)品種無(wú)論是感染建蘭花葉病毒還是齒蘭環(huán)斑病毒或者復(fù)合感染，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)初期病株的葉片上表現(xiàn)出明顯的褪綠、黃化癥狀， 感染齒蘭環(huán)斑病毒和復(fù)合感染的病株發(fā)病時(shí)葉片上出現(xiàn)[FL）]

[FK（W9][TPXLN9.tif；S+5mm][FK）][LM]

[KH*4D]

明顯的壞死斑。因此，蘭花植株是否有病毒病，是感染了建蘭花葉病毒還是齒蘭環(huán)斑病毒，或是其他病害，僅僅從癥狀上判斷是很不準(zhǔn)確的，仍然須要通過(guò)ELISA等方法測(cè)定才能確診，因此蝴蝶蘭的早期檢測(cè)以及脫毒研究引入生產(chǎn)環(huán)節(jié)勢(shì)在必行。

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