仇保豐 景瑾 董蓉蓮 宋鴻雁 劉春 朱順星 邵義祥 劉文斌 李建

摘要：根據(jù)GenBank中已發(fā)表的柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella） SAG10基因序列，利用計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)1對引物，從E. tenella江蘇株的第2代裂殖子中成功克隆出SAG10基因。將該基因與GenBank中國內(nèi)外不同E. tenella分離株的SAG10基因進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)E. tenella江蘇株與北京株的SAG10基因同源性最高，高達(dá)99%，其后依次為楊凌株、豪頓株。4種不同分離株SAG10基因的ORF之間有11個(gè)堿基不同，其中3個(gè)為無義突變，8個(gè)為有義突變。分析4種分離株SAG10基因推導(dǎo)蛋白質(zhì)的親水性、抗原指數(shù)、表面可及性發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外不同E. tenella分離株SAG10蛋白的抗原性總體比較接近且很強(qiáng)，但國內(nèi)不同分離株之間的抗原性更加接近，并優(yōu)于國外的豪頓株，這可能是由于氨基酸突變引起蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和親水性等發(fā)生變化而引起。將上述SAG10基因序列與復(fù)頂門原蟲的其他相關(guān)SAGs基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)Eimeria屬球蟲SAGs基因之間相對比較保守，且與犬新孢子蟲（Neospora caninum）、N. hughesi、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）的SAG基因之間同源性較低，與已有觀點(diǎn)一致；但神經(jīng)肉孢子蟲（Sarcocystis neurona）的2條SAG1基因序列卻與E. tenella的SAG1基因序列表現(xiàn)出更高的同源性，這與其他研究結(jié)論不符。

關(guān)鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲；SAG10基因；克隆；分析

中圖分類號(hào)： Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）03-0024-04

雞球蟲基因克隆始于1987年，迄今已有240多個(gè)基因被成功克隆，雞球蟲的重組疫苗也得到了廣泛研究[1]。有分析認(rèn)為，參與艾美耳球蟲宿主細(xì)胞入侵過程的相關(guān)分子是最具應(yīng)用潛力的保護(hù)性抗原，如子孢子和裂殖子表面抗原（surface antigens，簡稱SAGs）以及微線、棒狀體、折光體等分泌型亞細(xì)胞器的分泌蛋白[1-2]。柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）表面抗原SAG10（surface antigen 10）是一種C端具有疏水性的糖基化磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，簡稱GPI）錨定結(jié)構(gòu)域的表面蛋白[3]。由于SAG10基因在E. tenella子孢子和第2代裂殖子階段均有表達(dá)，且SAGs被認(rèn)為在啟動(dòng)頂復(fù)門原蟲識(shí)別、黏附和侵襲宿主細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)、免疫逃避、宿主特異性等方面均發(fā)揮著重要作用，因此國外很多學(xué)者正加大對SAG10等表面抗原的研究力度[3-6]。韓德強(qiáng)等[7]、麥博等[2]分別對E. tenella北京株、楊凌株的SAG10基因進(jìn)行了研究，但目前尚無對E. tenella江蘇株SAG10基因進(jìn)行研究的報(bào)道。麥博等研究發(fā)現(xiàn)，SAG10在不同E. tenella株間存在抗原性差異，這與認(rèn)為E. tenella不存在明顯株間抗原性差異的傳統(tǒng)觀點(diǎn)相對立[2]。本研究通過對E. tenella江蘇（Jiangsu）株的SAG10基因進(jìn)行克隆，并將其與國內(nèi)外學(xué)者在GenBank中公布的E. tenella豪頓（Houghton）株、北京（Beijing）株、楊凌（Yangling）株的SAG10基因進(jìn)行比對和分析，為研究 E. tenella SAG10的生物學(xué)功能、篩選E. tenella保護(hù)性抗原等工作提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1球蟲卵囊

E. tenella分離自江蘇省某雞場，由南通市出入境檢驗(yàn)檢疫局有害生物檢疫實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。

1.1.2試驗(yàn)雞

1日齡AA肉雞，購自江蘇省南通市某商品雞孵化場，飼養(yǎng)于嚴(yán)格消毒且無球蟲的籠舍中，飼料中不含抗球蟲藥。

1.1.3試劑

焦碳酸二乙酯（DEPC），購自Amresco公司；莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MLV）、Oligo（dT）15 Primer，購自Promega公司；pMD18-T克隆載體、Taq DNA聚合酶、dNTP、DL 2 000 Marker、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、DNA膠回收試劑盒，均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Tabares等在GenBank中發(fā)表的E. tenella SAG10基因序列[3]（登錄號(hào)：AJ586552），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對特異性擴(kuò)增引物，上游引物為5′-CA[ZZ（Z]GGATCC[ZZ）]ATGCTACAGCGGAAGCTAC-3′，下游引物為5′-TG[ZZ（Z]GAATTC[ZZ）]TAAAGTCATAATGCCGAAC-3′，擴(kuò)增的目的片段長度為799 bp。為便于后續(xù)操作，分別在上、下游引物中設(shè)計(jì)了酶切位點(diǎn)BamHⅠ、EcoRⅠ（如下劃線部分所示）。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.2cDNA模板的制備

將30羽1日齡AA肉雞飼養(yǎng)至14日齡，經(jīng)口接種新鮮孢子化卵囊1×105個(gè)/羽，接種后 120 h 殺雞取盲腸。參考文獻(xiàn)[8]的方法分離和純化 E. tenella 第2代裂殖子，再采用一步法[9]提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄cDNA作為PCR模板。

1.2.3SAG10基因的克隆及鑒定

采用特異性引物進(jìn)行SAG10基因的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10×Taq buffer 2.5 μL、MgCl2（25 mmol/L）1.0 μL、dNTP Mix（10 mmol/L each）0.5 μL、上游及下游引物（50 μmol/L）各0.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL、滅菌雙蒸水14.5 μL、cDNA模板5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 55 s，58 ℃ 55 s，72 ℃ 55 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸15 min。循環(huán)完畢后，向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入5 μL上樣緩沖液，在1%瓊脂糖凝膠上電泳，并在紫外燈下觀察結(jié)果?；厥誗AG10基因目的條帶，連接pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化DH5α，用BamHⅠ+EcoRⅠ雙酶切及PCR鑒定出陽性克隆，挑取3個(gè)克隆送至寶生物工程（大連）有限公司測序，將測序結(jié)果輸入“http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/”進(jìn)行網(wǎng)上比對。

1.2.4SAG10蛋白的特性分析

采用DNAStar 4.0軟件分別編輯GenBank中報(bào)道的E. tenella豪頓株、北京株、楊凌株、本研究克隆的江蘇（Jiangsu）株的SAG10基因序列，分析開放閱讀框（ORF）的堿基序列，并推導(dǎo)出編碼蛋白的氨基酸序列。采用MegAlign Clustal V軟件對SAG10基因ORF的堿基序列和推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比對，分析E. tenella不同分離株之間SAG10基因堿基和推導(dǎo)氨基酸的突變情況，進(jìn)一步采用DNAStar Protean軟件預(yù)測這些突變引起SAG10蛋白親水性結(jié)構(gòu)（Hydrophilicity Plot）、抗原性指數(shù)（Antigenicindex）、表面可及性（Surface Probability Plot）的變化情況。

1.2.5SAG10基因遺傳進(jìn)化分析

分別收集若干條GenBank中公布的E. tenella和毒害艾美耳球蟲、新孢子蟲、肉孢子蟲、弓形蟲等其他頂復(fù)門原蟲SAGs基因家族（SAGs gene family）序列，結(jié)合GenBank中已公布及本研究克隆的E. tenella SAG10基因序列，共同采用MEGA 6.06軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化發(fā)生樹，分析本研究克隆SAG10基因和其他SAG基因之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1SAG10基因的克隆

從E. tenella第2代裂殖子中提取總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)2個(gè)泳道中均有1條約799 bp的條帶（圖1），與預(yù)期大小相吻合。切膠并回收目的條帶后，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。

2.2SAG10基因的鑒定

提取pMD18-T-SAG10基因重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定，可獲得與預(yù)期大小一致的目的條帶，進(jìn)一步采用PCR方法進(jìn)行鑒定，也能得到約799 bp的條帶（圖2），與理論值相吻合。從雙酶切和PCR鑒定的陽性克隆中挑取3個(gè)菌落進(jìn)行DNA測序，然后將測序結(jié)果輸入GenBank進(jìn)行Blast比對， 發(fā)現(xiàn)本研究克隆的E. tenella江蘇株SAG10基因與GenBank中公布的E. tenella北京株SAG10基因同源性最高，高達(dá)99%，其后依次為楊凌株、豪頓株，表明SAG10基因克隆成功。

2.3SAG10的蛋白特性分析

目前，GenBank中公布的E. tenella SAG10基因序列共有4條，其中同源性為100%的2條豪頓株SAG10基因序列由國外不同研究小組發(fā)表，北京株、楊凌株SAG10基因序列均由國內(nèi)學(xué)者發(fā)表（表1）。這4條SAG10基因均只有完整的ORF部分，無兩端序列，全長786 bp，編碼261個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為27.9 ku。本研究克隆的E. tenella江蘇（Jiangsu）株SAG10基因全長799 bp，其中不僅包含E. tenella SAG10基因完整ORF，同時(shí)還包含引物設(shè)計(jì)過程中人為添加的保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)。采用DNAStar 4.0軟件分析本研究克隆的SAG10基因的ORF，并推導(dǎo)出氨基酸序列，與GenBank中發(fā)表的4條序列共同采用MegAlign Clustal V軟件比對ORF內(nèi)堿基序列和推導(dǎo)氨基酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種不同E. tenella分離株SAG10基因之間共有11個(gè)位點(diǎn)存在差異（本研究中引物設(shè)計(jì)時(shí)人為引入的突變未計(jì)算在內(nèi)，下同），除去第426、435、552位3個(gè)位點(diǎn)的堿基突變?yōu)闊o義突變外，其余8個(gè)堿基突變均為有義突變，引起了8個(gè)氨基酸突變（表1）。進(jìn)一步采用DNAStar Protean軟件中的Kety-Doolittle、Jameson-Wolf、Emini算法，依次分析SAG10蛋白的親水性結(jié)構(gòu)、抗原指數(shù)、表面可及性的變化情況。結(jié)果顯示，不同E. tenella分離株SAG10蛋白的N端和C端疏水性均較強(qiáng)，而中間段則有很多親水性區(qū)域。國內(nèi)外不同E. tenella分離株之間，SAG10蛋白抗原性總體比較接近，且抗原性很強(qiáng)，但國內(nèi)不同分離株之間的抗原性更加接近，它們與國外豪頓株的氨基酸序列在140～160位差異均較大，且國內(nèi)分離株的抗原性優(yōu)于國外豪頓株（圖3）。這可能是由于E. tenella國內(nèi)分離株和國外豪頓株的SAG10氨基酸序列在140～160位變化頻率較高（表1），引起蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和親水性發(fā)生一定變化而導(dǎo)致。

160位氨基酸序列位于SAG10蛋白表面的可能性較大，一定程度上可解釋為何該區(qū)域氨基酸突變頻率較高會(huì)對國內(nèi)外分離株之間抗原性差異產(chǎn)生影響。

2.4SAG10基因遺傳進(jìn)化分析

本研究收集了GenBank中已發(fā)表的E. tenella 4條SAG10基因和1～2條不等的SAG1、SAG5、SAG8、SAG9、SAG11、SAG12基因序列。同時(shí)收集了毒害艾美耳球蟲（Eimeria necatrix）SAG基因家族序列和犬新孢子蟲（Neospora caninum）、洪氏新孢子蟲（Neospora hughesi）、神經(jīng)肉孢子蟲（Sarcocystis neurona）的SAG1基因序列，以及剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）SAG1（別稱P30）和SAG5（可分為A、B、C、D共4種多肽）的基因序列，結(jié)合本研究克隆的E. tenella SAG10基因序列，共同采用MEGA 6.06軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化發(fā)生樹（圖4）。結(jié)果表明，E. tenella和E. necatrix的SAGs基因家族序列均分布在進(jìn)化樹的同一較大分支上，表明艾美耳屬（Eimeria）球蟲的SAGs基因之間可能相對比較保守。N. caninum、N. hughesi、T. gondii的SAG基因則分布在進(jìn)化樹的另一較大分支上，其中同為新孢子蟲屬（Neospora）的N. caninum和N. hughesi SAG1基因序列也分布在同一親緣關(guān)系較近的分支上，這與Eimeria屬球蟲SAGs基因的特性相似。另外，GenBank中已發(fā)表的4條E. tenella SAG10基因與本研究克隆SAG10基因的親緣關(guān)系較近，分布在同一較小分支上，且E. tenella江蘇株和北京株的SAG10基因分布最近，與“2.2”節(jié)中江蘇株SAG10基因的BLAST結(jié)果一致。

已有研究認(rèn)為，頂復(fù)門原蟲的SAGs編碼基因在組織寄生型原蟲（包囊形成型原蟲，如T. gondii、S. neurona、N. caninum）間是高度同源的，但Eimeria與隱孢子蟲、瘧原蟲及這三者與弓形蟲間無任何同源性[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，T. gondii、N. caninum、N. hughesi、Eimeria球蟲SAGs基因之間確實(shí)表現(xiàn)出了上述特點(diǎn)，但例外的是，S. neurona的2條SAG1基因卻與T. gondii、N. caninum、N. hughesi的SAGs基因序列均表現(xiàn)出了較低的同源性，反而與Eimeria球蟲SAGs基因分布在進(jìn)化樹的同一較大分支上，且與E. tenella的SAG1基因間表現(xiàn)出較高的同源性，這與上述已有觀點(diǎn)明顯不符。

3結(jié)論與討論

GPI錨定蛋白是一類通過其羧基末端的糖基化磷脂酰肌醇結(jié)構(gòu)錨定于真核細(xì)胞膜表面的蛋白，與傳統(tǒng)的跨膜型表面蛋白不同，它們不跨越細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層，只通過其羧基末端的GPI錨定于細(xì)胞上，同時(shí)這種GPI錨在磷脂酶C的處理下又可從細(xì)胞膜上脫落[12]。已發(fā)現(xiàn)的GPI錨定蛋白種類很多，包括水解酶、細(xì)胞黏附分子、表面抗原、受體、朊病毒等[13]。GPI錨定蛋白功能廣泛，涉及細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長發(fā)育、分化[CM（25]、程序性死亡等重要生命過程，與血栓形成、白血病等很多[CM）][FL）]

[FK（W22][TPCBF4.tif][FK）]

疾病有著一定聯(lián)系[14]。SAGs是一類GPI錨定蛋白，大量分布于弓形蟲、瘧原蟲、隱孢子蟲、新孢子蟲等侵襲性階段蟲體細(xì)胞表面，是蟲體與宿主細(xì)胞黏附的主要分子[10]。目前，弓形蟲的SAGs已被深入研究，但針對E. tenella SAGs的研究仍有待進(jìn)一步加強(qiáng)[3，10]。

麥博等對E. tenella楊凌株SAG10基因及其氨基酸序列進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)SAG10在不同E. tenella株間存在抗原性差異[2]。簡永利等對E. tenella楊凌株SAG2基因進(jìn)行研究后也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象[10]。但這些發(fā)現(xiàn)與認(rèn)為E. tenella不存在明顯株間抗原性差異的傳統(tǒng)觀點(diǎn)相對立。韓德強(qiáng)等對E. tenella北京株SAG10基因進(jìn)行了研究，未報(bào)道是否發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象[7]。為澄清這一問題，同時(shí)為研究E. tenella SAG10的生物學(xué)功能以及為篩選理想的E. tenella保護(hù)性抗原等提供信息，本研究對E. tenella江蘇株的SAG10基因進(jìn)行了克隆，并將它與國內(nèi)外在GenBank中發(fā)表的E. tenella豪頓株、北京株、楊凌株的SAG10基因進(jìn)行了系統(tǒng)比對和分析。結(jié)果表明，E. tenella江蘇株SAG10基因與GenBank中收錄的E. tenella北京株SAG10基因同源性最高，高達(dá)99%，其后依次為楊凌株、豪頓株SAG10基因。對4種不同E. tenella分離株SAG10基因和推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，SAG10基因之間共有11個(gè)位點(diǎn)存在差異，其中8個(gè)堿基突變?yōu)橛辛x突變，引起了8個(gè)氨基酸突變。分析SAG10蛋白的親水性、抗原性、表面可能性等特性發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外不同E. tenella分離株之間的SAG10蛋白抗原性總體比較接近，且抗原性很強(qiáng)，但國內(nèi)不同分離株之間的抗原性更加接近，它們均與國外豪頓株的氨基酸序列在140～160位差異較大，且國內(nèi)分離株的抗原性優(yōu)于國外豪頓株。這可能是由于E. tenella國內(nèi)分離株和國外豪頓株的SAG10氨基酸序列在140～160位變化頻率較高，引起蛋白的空間構(gòu)象、親水性等發(fā)生變化而導(dǎo)致。

目前對于E. tenella SAGs的研究深度遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于弓形蟲等其他復(fù)頂門原蟲SAGs，因此在開展E. tenella SAGs的蛋白結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能等研究過程中，常須要從弓形蟲等其他復(fù)頂門原蟲SAGs的研究中獲得啟發(fā)，并進(jìn)行對比和推測。簡永利等研究發(fā)現(xiàn)，E. tenella楊凌株與豪頓株的SAG2基因序列高度同源，但與T.gondii、Neospora caninum、Sarcosystis neurona SAG2無任何同源性[10]。更有觀點(diǎn)認(rèn)為，頂復(fù)門原蟲的SAGs編碼基因在組織寄生型原蟲（包囊形成型原蟲，如T. gondii、S. neurona、N. caninum）間是高度同源的，但Eimeria與隱孢子蟲、瘧原蟲及這三者與弓形蟲間無任何同源性[10-11]。為證實(shí)這一觀點(diǎn)，本研究收集了GenBank中已發(fā)表的E. tenella 4條SAG10基因和1～2條不等的SAG1、SAG5、SAG8、SAG9、SAG11、SAG12的基因序列，同時(shí)收集了E. necatrix、N. caninum、N. hughesi、S. neurona、T. gondii的相關(guān)SAG基因序列，結(jié)合本研究克隆的E. tenella SAG10基因序列，共同采用MEGA 6.06軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化發(fā)生樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E. tenella和E. necatrix的SAGs基因家族的序列均分布在進(jìn)化樹的同一較大分支上，表明同為Eimeria屬的球蟲SAGs之間可能相對比較保守。N. caninum、N. hughesi、T. gondii的SAG基因則分布在進(jìn)化樹的另一較大分支上，其中，同為Neospora屬的N. caninum和N. hughesi SAG1基因序列也分布在同一親緣關(guān)系較近的分支上，這與Eimeria屬球蟲SAGs基因的特性相似，也與上述其他學(xué)者的觀點(diǎn)一致。但例外的是，S. neurona的2條SAG1基因卻均與T. gondii、N. caninum、N. hughesi的SAG1基因序列表現(xiàn)出了較低的同源性，反而與Eimeria球蟲SAGs基因分布在進(jìn)化樹的同一較大分支上，且與E. tenella的SAG1基因間表現(xiàn)出較高的同源性，這與已有研究結(jié)果[10-11]明顯不符。導(dǎo)致這一異?，F(xiàn)象的原因有待進(jìn)一步研究，同時(shí)須分析比對更多的序列。

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