李海旭， 石繼祥， 石文俊， 劉孚瑛， 章篩林， 周 強(qiáng)

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院骨科， 上海 200062

·短篇論著·

新西蘭大白兔組織工程骨的構(gòu)建及體內(nèi)異位成骨效果

李海旭， 石繼祥， 石文俊， 劉孚瑛， 章篩林， 周 強(qiáng)*

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院骨科， 上海 200062

目的： 探討新西蘭大白兔組織工程骨股骨旁異位成骨(ectopic bone formation)的效果。方法： 選取新西蘭大白兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，與生物陶瓷構(gòu)建組織工程骨，種植到新西蘭大白兔股骨的骨膜旁，第8周獲得異位成骨組織，檢測(cè)分析收獲的異位成骨材料結(jié)構(gòu)。結(jié)果： 第8周的異位成骨材料內(nèi)有骨組織形成，成骨材料結(jié)構(gòu)清晰，組織內(nèi)部有新血管形成，熒光蛋白標(biāo)記的標(biāo)本有熒光蛋白表達(dá)。結(jié)論： 組織工程骨在體內(nèi)可順利異位成骨。

組織工程骨；異位成骨；結(jié)構(gòu)

臨床上大量骨缺損的修復(fù)一直是個(gè)難題，相對(duì)自體骨、異體骨和人工合成材料使用的局限性，組織工程骨具有良好的相容性和可重復(fù)性，有望成為骨缺損修復(fù)的良好材料[1]。移植的干細(xì)胞與周圍微環(huán)境的相互作用非常重要，局部組織微環(huán)境可以影響干細(xì)胞的黏附和遷移，血供良好顯然可以更好地促進(jìn)成骨[2]。本研究將組織工程骨種植到軟組織條件正常的股骨旁進(jìn)行異位成骨(ectopic bone formation)研究，并對(duì)其成骨過(guò)程、內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析。

1 材料與方法

1.1 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo) 取實(shí)驗(yàn)用4周齡新西蘭大白兔1只，體質(zhì)量為1.5 kg，經(jīng)兔耳緣靜脈注射1%戊巴比妥鈉，按1 mL/kg的劑量行全身麻醉。于雙側(cè)脛骨近端作骨穿，穿刺成功后用含有0.2 mL肝素鈉溶液的注射器取骨髓4.0 mL，骨髓轉(zhuǎn)移至離心管，再加入等量的PBS洗滌后離心5 min，重復(fù)2次。棄上清液，加入含有10%體積血清的培養(yǎng)基重懸后接種于100 mL的塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后半量換液，此后每2 d全量換液。待原代培養(yǎng)細(xì)胞鋪滿瓶底面積80%～90%時(shí)，加入0.25%的胰蛋白酶消化2.0～3.0 min，加入含有血清的L-DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心5 min，棄上清液，吹打細(xì)胞后以1∶2接種，并對(duì)獲得的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。用DMEM條件培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸納、0.05 mmol/L抗壞血酸)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)[3]。取部分成骨誘導(dǎo)后的基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色確認(rèn)成骨活性。取部分成骨誘導(dǎo)后的基質(zhì)干細(xì)胞，利用熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)慢病毒包裝載體進(jìn)行熒光蛋白標(biāo)記(上海澳斯生物技術(shù)服務(wù)有限公司協(xié)助完成)。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，其他試劑購(gòu)自Sigma公司。

1.2 組織工程骨的構(gòu)建 成骨誘導(dǎo)后的基質(zhì)干細(xì)胞懸液(107個(gè)/ mL)滴加到12 mm×6 mm×6 mm的β-磷酸三鈣生物陶瓷(實(shí)驗(yàn)專用)柱狀體支架并完全浸潤(rùn)，按原條件培養(yǎng)3 d后待用，β-磷酸三鈣生物陶瓷由上海貝奧路生物材料有限公司提供。

1.3 異位成骨材料獲取 取6只清潔級(jí)新西蘭大白兔，按0.3 mL/kg的劑量進(jìn)行靜脈注射1%戊巴比妥鈉麻醉。麻醉后嚴(yán)格消毒，將組織工程骨置于雙側(cè)股骨旁，逐層縫合軟組織，術(shù)后未予以抗生素，繼續(xù)飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。標(biāo)記組2只大白兔植入GFP標(biāo)記的組織工程骨；無(wú)標(biāo)記組4只植入無(wú)標(biāo)記的組織工程骨，第8周取材分析。標(biāo)記組材料作冰凍切片；無(wú)標(biāo)記組的新西蘭大白兔4只左心室內(nèi)灌注凝膠墨汁，待末梢循環(huán)可見(jiàn)黑色后取材，包括股骨和周邊附著的異位成骨材料一起聚酯液包裹固定，7 d后做硬切片觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

2.1 成骨干細(xì)胞誘導(dǎo)與GFP標(biāo)記 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞鏡下為梭狀單核細(xì)胞，有偽足吸附在培養(yǎng)皿表面，擴(kuò)增后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)12 d，細(xì)胞仍然為梭狀單核細(xì)胞，貼壁良好(圖1A)，細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)效果通過(guò)堿性磷酸酶染色陽(yáng)性得到確認(rèn)(圖1B)，GFP熒光蛋白慢病毒包裝載體可將成骨誘導(dǎo)后的基質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記上GFP(圖1C)。

圖1 成骨干細(xì)胞誘導(dǎo)、堿性磷酸酶的成骨鑒定與GFP標(biāo)記

A：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)第11 天；B：成骨誘導(dǎo)后的干細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽(yáng)性；C：綠色熒光蛋白標(biāo)記的干細(xì)胞.Original magnification:×200

2.2 獲得異位成骨材料 組織工程骨直接置于雙側(cè)股骨旁(圖2A)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均無(wú)死亡或局部創(chuàng)口感染，大部分骨膜旁成骨材料固定充分，形態(tài)為類似植入前的完整柱狀(圖2B)，少部分異位成骨材料有吸收和碎裂，不再作進(jìn)一步檢測(cè)分析。

圖2 組織工程骨的植入與異位成骨材料的獲取

A：條狀組織工程骨植入股骨外側(cè)；B：8周后異位成骨材料附著牢固，形態(tài)完整

2.3 標(biāo)記GFP組織工程骨在異位成骨后GFP的表達(dá) GFP慢病毒包裝載體標(biāo)記干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，成骨誘導(dǎo)前標(biāo)記的干細(xì)胞存活和增殖能力下降，未用于后期實(shí)驗(yàn)。成骨誘導(dǎo)9 d后再進(jìn)行GFP標(biāo)記，原條件培養(yǎng)2 d后擴(kuò)增1次，細(xì)胞存活良好(圖1C)，用于標(biāo)記組實(shí)驗(yàn)，獲得的異位成骨材料形態(tài)完整，取出直接做冰凍切片，雖然組織容易破碎，仍然可見(jiàn)明確的GFP表達(dá)(圖3)。

圖3 熒光蛋白在異位成骨材料中的表達(dá)

A：第8周，冰凍切片后組織容易碎裂；B：異位成骨材料中有明確的GFP表達(dá).Original magnification: ×40(A), ×200(B)

2.4 異位成骨材料的結(jié)構(gòu)分析 標(biāo)本股骨F(femur)和異位成骨材料E(ectopic bone)的橫切面切片觀察(圖4)：可見(jiàn)無(wú)標(biāo)記組6個(gè)異位成骨標(biāo)本形態(tài)完整，牢固附著于股骨旁(圖4A)。正常股骨皮質(zhì)內(nèi)哈弗管被墨汁染成黑色，清楚顯示，異位成骨材料有類似骨組織結(jié)構(gòu)形成，形態(tài)良好(圖4B)；骨組織內(nèi)的血管樣結(jié)構(gòu)和彌漫分布的骨細(xì)胞清晰(圖4C)。邊緣附著的組織工程骨，有類似正常骨組織的骨樣結(jié)構(gòu)和骨細(xì)胞，部分血管樣結(jié)構(gòu)(圖4D)。由于聚酯液固定的組織切片較厚，光學(xué)顯微鏡最大放大到200倍，可以觀察到異位成骨材料內(nèi)的細(xì)胞大小和結(jié)構(gòu)類似正常骨組織，無(wú)法對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)仔細(xì)辨認(rèn)分析，不能確認(rèn)成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞。

圖4 股骨旁異位成骨材料與正常股骨結(jié)構(gòu)的對(duì)照

A：股骨標(biāo)本橫切面切片，完整的股骨F(femur)干邊緣附著異位成骨材料E(ectopic bone)；B：股骨與異位成骨材料結(jié)構(gòu)相似；C：正常股骨內(nèi)有血管和骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)；D：異位成骨材料內(nèi)新生血管和骨細(xì)胞樣結(jié)構(gòu).Original magnification: ×10(A), ×40 (B), ×200(C,D)

3 討 論

作為自體骨的替代材料，組織工程骨具有數(shù)量和質(zhì)量上的優(yōu)勢(shì)，利用自體干細(xì)胞作為種子細(xì)胞、人工骨作為支架材料構(gòu)建組織工程骨的方法一直是研究熱點(diǎn)[12]。多種來(lái)源干細(xì)胞構(gòu)建的組織工程骨均有不同的骨缺損修復(fù)能力，骨髓來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞具有取材方便，成骨能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[4]，而且比其他來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞釋放更多的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，可以促進(jìn)血管再生，為骨形成創(chuàng)造更好的條件[4-5]。

骨髓內(nèi)各種細(xì)胞總數(shù)的0.01%是基質(zhì)干細(xì)胞，如此少的數(shù)量限制了直接移植修復(fù)骨缺損的可行性[6]。只有在體外對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增誘導(dǎo)后，才可能期望植入體內(nèi)獲得較多的骨組織[1]。

本研究選取骨髓基質(zhì)干細(xì)胞順利擴(kuò)增后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，通過(guò)堿性磷酸酶染色確認(rèn)其具有成骨活性。選作支架的β-磷酸三鈣生物陶瓷是臨床上常用的骨缺損修復(fù)填充物，主要成分為無(wú)機(jī)物，自身基本無(wú)成骨作用，其形態(tài)規(guī)則、性能穩(wěn)定，多孔結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞植入的特性，是組織工程骨的優(yōu)良支架。

組織工程骨攜帶的基質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)多渠道促進(jìn)成骨，一方面自身轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞，另一方面釋放各種遞質(zhì)，募集各種有利骨形成的細(xì)胞至其周邊，其中還包括宿主本身的基質(zhì)干細(xì)胞[7]。有許多實(shí)驗(yàn)室研究直接將構(gòu)建的組織工程骨植入骨缺損，可以獲得良好的骨缺損修復(fù)效果，但從臨床應(yīng)用方面考慮，該類方法有相當(dāng)多的限制，一般骨缺損部位往往伴軟組織損傷，不能提供良好的血供，骨折部位抵抗力較弱，容易發(fā)生變態(tài)反應(yīng)或感染，局部微環(huán)境不利于干細(xì)胞的存活。如果同時(shí)有金屬內(nèi)固定材料，可能會(huì)造成災(zāi)難性的感染。異位成骨的方法為將組織工程骨植入到體內(nèi)非骨折的部位，如皮下、肌筋膜下和骨膜旁等[8-10]，利用局部良好的微環(huán)境提供所需的血供和其他有利條件，促進(jìn)其形成需要的骨組織。

異位成骨的干細(xì)胞究竟可以存活多久，是否直接參與骨形成，往往需要通過(guò)干細(xì)胞的標(biāo)記物確認(rèn)。基因追蹤可用于異種干細(xì)胞移植[10]，精確定位植入的種子細(xì)胞，而同種移植顯然熒光蛋白標(biāo)記更加便捷。本研究熒光蛋白標(biāo)記的組織工程骨在體內(nèi)第8周有明確的熒光顯示，種子細(xì)胞能在體內(nèi)較長(zhǎng)時(shí)間存活，不排除其在體內(nèi)進(jìn)一步分化、增殖，積極參與骨組織形成。

本研究應(yīng)用的是同種異體干細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨，在宿主體內(nèi)未發(fā)生炎性反應(yīng)或排異，為臨床應(yīng)用提供了安全保障支持。已經(jīng)有學(xué)者[11,13]利用人體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增誘導(dǎo)，與多孔支架構(gòu)建組織工程骨植入裸鼠皮下，獲得了良好的異位成骨，且沒(méi)有明顯的炎性反應(yīng)，提示在克服免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)上，有可能利用異位成骨方法獲得修復(fù)骨缺損的優(yōu)良材料。

異位成骨材料修復(fù)骨缺損過(guò)程相對(duì)復(fù)雜、影響因素較多，涉及到骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、成骨干細(xì)胞的誘導(dǎo)、支架材料的選擇、異位成骨部位和手術(shù)方式的選擇等一系列因素，任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常均不可能獲得滿意的結(jié)果。本研究結(jié)果提示異位成骨可以獲得成功，有望為臨床骨缺損的修復(fù)提供優(yōu)良的填充材料。

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[本文編輯] 葉 婷， 曉 路

The structure analysis of ectopic bone formed by engineered bone in the New-Zealand rabbits

LI Hai-xu, SHI Ji-xiang, SHI Wen-jun, LIU Fu-ying, ZHANG Shai-lin, ZHOU Qiang*

Department of Orthopaedic, Putuo Hospital, Shanghai Traditional Medical University, Shanghai 200062, China

Objective： To study the structure of ectopic bone formed beside the New-Zealand rabbit femoral bone.Methods： Bone marrow stroma stem cells (BMSCs) were taken from New-Zealand rabbits to built engineered bone constructs, the constructs were embedded near the rabbit femoral bone, the ectopic bone constructs were harvested at 8thweek for further examination and study.Results： At 8thweek, the ectopic bone had a clear bone-like structure, together with new blood supply, green fluorescent protein could be seen in samples seeded by marked cells.Conclusions： This study showed that the ectopic bone formation could be successfulinvivo.

engineered bone constructs; ectopic bone formation; structure

2016-08-01 [接受日期] 2017-01-05

上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題(20114205).Supported by Research Project of Shanghai Health and Family Planning Commission (20114205).

李海旭，碩士生.E-mail: 553606395@qq.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 021-22233252, E-mail: zhouqiang619@aliyun.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20160775

R 683

A