王 倩，邵偉力，高艷菲，何建新，陳 利，崔世忠

(1.中原工學院紡織學院，河南 鄭州 450007； 2.天津工業(yè)大學先進紡織復合材料教育部重點實驗室，天津 300387； 3.紡織服裝產業(yè)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450000)

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PLGA/TSF靜電紡納米纖維的仿生礦化及生物相容性

王 倩1,3，邵偉力1,2,3，高艷菲1,2,3，何建新1，陳 利2，崔世忠1,2,3

(1.中原工學院紡織學院，河南 鄭州 450007； 2.天津工業(yè)大學先進紡織復合材料教育部重點實驗室，天津 300387； 3.紡織服裝產業(yè)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450000)

利用靜電紡絲和模擬體液仿生礦化技術制備了聚乳酸-羥基乙酸共聚物/柞蠶絲素/羥基磷灰石((PLGA/TSF/HA)骨組織工程復合支架。通過掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)、X射線衍射測試(XRD)和熱重分析(TG)對復合納米纖維的形貌結構進行了表征。此外，在復合納米纖維支架材料上接種人骨髓間充質干細胞(hMSCs)，通過四甲基偶氮噻唑藍比色(Four methyl azo thiazole blue colorimetric，MTT)法，觀察細胞在材料表面的生長情況評價納米纖維的生物相容性。結果顯示，PLGA/TSF納米纖維氈具有精細的三維結構，纖維直徑分布均勻，表面光滑。礦化后HA顆粒均勻地分布在PLGA/TSF納米纖維表面，礦物含量約占63%。與PLGA/TSF納米纖維支架相比，PLGA/TSF/HA納米纖維支架的親水性、生物相容性都得到顯著提高。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物； 柞蠶絲素； 羥基磷灰石； 生物相容性

1 引 言

支架、細胞、因子是骨組織工程研究的三大問題，而支架的研究又是其中最基礎的問題。天然骨是由有機相的增韌相(膠原蛋白)和納米無機相(羥基磷灰石，HA)的增強相組成的復合材料[1]。模擬天然骨的結構和成分，通過有機可降解高聚物與HA復合的方式可制備出性能優(yōu)良的可降解吸收的骨修復與替換材料[2]。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是一種常見的可降解生物材料，在體內對組織細胞無害、生物相容性好、無毒、易加工[3-4]。然而，這些聚合物材料表面是疏水性的，從而具有較低的細胞增殖、粘附能力[5-6]。此外，有很多報道證明這些多孔支架顯示較低的生物活性和力學性能[7]。HA具有良好的親水性和生物相容性，有利于細胞的粘附和分化。除了把HA 直接加入紡絲液和其他材料一起共紡是常用的方法以外，還可以采用電噴射法、交替礦化法、電沉積法和模擬體液礦化法等把HA沉積到支架的表面，這些方法各有其優(yōu)缺點，其中模擬體液礦化是比較常用的方法。

柞蠶絲素蛋白(TSF)由于其含有特殊的氨基酸序列，使得被廣泛地運用于組織工程支架，已有報道也證明TSF能夠促進成骨細胞的增殖，粘附和分化[8-10]。本文從仿生天然骨組織細胞外基質的角度出發(fā)，利用靜電紡絲技術制備PLGA/TSF復合納米纖維，通過模擬體液仿生礦化獲得PLGA/TSF/HA納米纖維支架材料。最后通過體外人骨髓間充質干細胞(hMSCs)培養(yǎng)研究復合支架的生物相容性。

2 實 驗

2.1 材 料

柞蠶繭(購自中國河南南陽)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA，重均分子量為18萬，國藥集團)，人骨髓間充質干細胞株(hMSCs)(購自國家實驗細胞資源共享平臺)、MEM-EBSS培養(yǎng)基(購自美國Hyclone公司)、胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS，購自美國Hyclone公司)、 NEAA(非必需氨基酸，購自美國Hyclone公司)、PBS液(購自美國Hyclone公司)、所有試劑均為分析純。

2.2 試驗過程

按照1∶30的浴比將柞蠶繭放入質量分數(shù)為0.5%的碳酸鈉溶液中，煮沸脫膠三次，用去離子水沖洗，然后在室溫下干燥。將脫膠后的柞蠶絲置于50℃ 9mol/L硫氰酸鋰溶液中攪拌溶解2h，然后用截留分子量為8000～14000的透析袋透析3天。將透析后的溶液鼓風濃縮，然后冷凍干燥制得純柞蠶絲素膜。將TSF和PLGA按照1∶9的質量比混合后置于六氟異丙醇中，在25℃磁力攪拌器攪拌一周制得質量分數(shù)為13%的紡絲溶液。靜電紡絲條件如下：電壓20kV，紡絲距離18cm，紡絲流量0.3mL/h。將獲得的PLGA/TSF復合納米纖維氈置于1.5倍的模擬體液中，在36.5℃經過48h后取出樣品，最后用蒸餾水清洗3遍用于測試以及細胞培養(yǎng)實驗。其中模擬體液的配制為：1L模擬體液中含有NaCl(7.996g)，NaHCO3(0.350g)，KCl(0.224g)，K2HPO4·3H2O(0.228g)，MgCl2·6H2O(0.305g)，CaCl2(0.278g)，Na2SO4(0.071g)，并在溶液為36.5℃下用三羥甲基胺基甲烷和1∶4的鹽酸調其pH值至7.4。

2.3 支架材料的形貌和結構表征

采用 JSM-6360 型掃描電子顯微鏡觀察納米纖維表面形貌。利用G2 20s-twin 型高分辨型透射電子顯微鏡觀察纖維結構形貌。利用D/max-2550PC 18kW轉靶X射線衍射儀對樣品結構進行X射線衍射分析。

2.4 熱重分析(TG)

為進一步確定所制備PLGA/TSF/HA復合納米纖維中礦物的含量，利用TG 209 F1 Libra型熱分析儀對復合納米纖維進行熱重分析，以10.0℃/min加熱速度升溫到1000℃。

2.5 接觸角測定

采用德國Dataphysics OCA20接觸角測量儀測試不同納米纖維支架的親水性。測試條件：恒溫20℃，相對濕度65%。

2.6 細胞培養(yǎng)

在37℃，5% CO2，95%濕度條件下無菌培養(yǎng)hMSCs。通過在倒置顯微鏡下觀察，當hMSCs形成單層，鋪滿培養(yǎng)瓶底80%以上時，進行傳代。用PBS液清洗培養(yǎng)瓶三次，加入胰酶-EDTA消化3分鐘，1000r/min離心5min，棄上清夜加入含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，吹打成均勻細胞懸液，調整細胞密度為1×l04/mL于培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。

2.7 細胞與材料的復合

先將滅菌后的材料放于24孔板中，浸泡于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基24小時，再接種hMSCs于孔板中。然后根據(jù)分組需要調整細胞密度，將密度為5×104/mL的細胞懸液加入相應的24孔板中，每孔加入1mL，進行細胞的形態(tài)學觀察及MTT測定。

2.8 細胞在支架材料上的增殖、粘附情況分析

首先將各組材料放入24孔培養(yǎng)板中，用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基浸泡24h，然后調整hMSCs密度為1×105個/mL，接種于放有不同材料的培養(yǎng)板內，每孔加入培養(yǎng)液1mL，然后分別于第1、4、7d各取三組材料加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h；終止培養(yǎng)后，棄上清液，每孔加入420μL DMSO，振蕩10分鐘。吸取每孔液體100μL到96孔平底板內，選擇492nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度值，記錄并分析結果。

在培養(yǎng)第4、7天時，從各組培養(yǎng)孔隨機取出一塊材料，先用PBS漂洗3遍，2.5%戊二醛固定，然后用40～100%乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯置換，臨界點干燥，樣品噴金后用掃描電鏡觀察細胞形態(tài)。

2.9 統(tǒng)計分析

3 結果分析與討論

3.1 復合納米纖維支架的形貌分析

圖1顯示了PLGA/TSF靜電紡納米纖維礦化前后的形貌?？梢钥闯鯬LGA/TSF靜電紡納米纖維支架呈現(xiàn)無紡的交錯結構，具有十分精細的三維纖維網絡架構。纖維表面光滑，平均直徑分布均勻，為350～450nm。礦化后，圖1(b)纖維表面完全被晶體顆粒覆蓋，說明PLGA/TSF納米纖維可以誘導礦物粒子的沉積。TEM照片(c)顯示了礦物晶體均勻地分布在纖維表面。此外，圖1(d)顯示了復合納米纖維表面的顆粒是由納米級的片狀晶體構成。

圖1 靜電紡復合納米纖維掃描電鏡和透射電鏡照片 (a) PLGA/TSF； (b) 礦化后； (c) 礦化后TEM照片；(d) PLGA/TSF/HA復合納米纖維局部放大照片； (e) PLGA/TSF納米纖維直徑分布Fig.1 SEM and TEM images of electrospun composite nanofibers (a) PLGA/TSF; (b) TEM images of mineralized nanofibers;(d) Partial enlarged images of PLGA/TSF/HA composite nanofibers; (e) Diameter distribution histograms of PLGA/TSF nanofiber

3.2 XRD和TG分析

圖2(a)為PLGA/TSF靜電紡納米纖維礦化前后的XRD譜線。礦化48小時后，在2θ=31.6°，45.5°，56.3°處分別出現(xiàn)了歸屬于HA (211)，(222)，(004)晶面的衍射峰，波峰較強，說明在纖維表面形成的礦物確實為HA。

為了確定仿生礦化后復合納米纖維中礦物的含量，我們通過TG對礦化前后的樣品進行測試。圖2(b)顯示，PLGA/TSF/HA復合納米纖維中礦物約占63%，這與人體骨中礦物HA含量極為接近。

圖2 不同靜電紡納米纖維復合支架的XRD分析圖譜(a)和TG分析曲線(b)Fig.2 (a) XRD and (b) TG curves of different electrospun nanofiber composite scaffolds

3.3 復合支架表面的接觸角分析

材料表面的親疏水性對細胞的粘附、遷移、增殖和分化都有重要的影響。如圖3所示，純PLGA納米纖維氈表面較為疏水，接觸角為129.5°，而當加入了 10%的TSF后，納米纖維氈的接觸角顯著下降至62.3°。因為TSF含有大量的羧基、氨基等活性基團，加入TSF極大地改善了材料的親水性能。礦化后，接觸角進一步降低至56.8°，這是由于礦化物中含有的HA是親水物質，并且礦化物在纖維膜內部沿著納米纖維軸向生長，所以礦化后的納米纖維膜的親水性能進一步得到改善。

圖3 不同靜電紡納米纖維氈的接觸角Fig.3 Contact angle of different electrospun nanofiber mats

3.4 細胞增殖性分析

不同基底上培養(yǎng)細胞不同時期的生長活力通過MTT法測試，結果如圖4所示。培養(yǎng)1天時，所有支架上細胞數(shù)目較少，三組中PLGA/TSF/HA上細胞生長略多。在培養(yǎng)4天后，PLGA/TSF/HA組細胞明顯多于其它兩組，這種趨勢一直持續(xù)至第7天，此時細胞增殖較快且PLGA/TSF/HA增殖能力最強，說明PLGA/TSF/HA復合材料具有很好的生物相容性。

圖4 不同時間點細胞在不同支架材料上的增殖曲線, *表示具有統(tǒng)計意義(P<0.05)Fig.4 Growth curve of cells on the materials at different time points. *Statistical significance of P<0.05

圖5 細胞在PLGA/TSF和PLGA/TSF/HA復合納米纖維支架上培養(yǎng)第4、7天后掃描電鏡照片F(xiàn)ig.5 SEM of cells cultured on PLGA/TSF and PLGA/TSF/HA composite nanofibers after 4 and 7 days of culture

3.5 細胞粘附性分析

通過SEM可以進一步觀察不同培養(yǎng)時間的細胞形態(tài)。如圖5所示，在培養(yǎng)第4、7天后，細胞在兩種支架上呈多角形并且有很多絲狀偽足，尤其是到第7天時，細胞互相融合成網。這是因為TSF的加入和礦化物的存在，PLGA/TSF和PLGA/TSF/HA的親水性與純PLGA相比得到提高，其表面的功能基團和粘附位點也大大增加。值得注意的是，在PLGA/TSF/HA復合支架上細胞密度明顯高于PLGA/TSF組，且細胞與PLGA/TSF/HA支架材料貼合得更緊密，說明礦化后新生成的HA納米晶體顯著地改善了復合支架材料的生物相容性，這可能是由于球狀礦化物改變了復合納米纖維膜的納米拓撲結構所致。

4 結 論

1.通過靜電紡絲制備的PLGA/TSF納米纖維氈具有精細的三維結構，纖維直徑分布均勻，表面光滑。礦化后HA顆粒均勻地分布在PLGA/TSF納米纖維表面，礦物含量約占63%，這與人體骨礦物含量極為接近。

2.仿生礦化后，PLGA/TSF/HA納米纖維支架的親水性有一定的改善，細胞具有更好的增殖能力和粘附，這種經改進的生物相容性復合支架材料有望應用于骨組織工程。

[1] 崔福齋,馮慶玲.生物材料學[M]. 北京：清華大學出版社有限公司,2004.

[2] Zhou H, Lee J. Nanoscale hydroxyapatite particles for bone tissue engineering[J]. Acta Biomaterialia, 2011, 7: 2769～2781.

[3] Ngiam M, Liao S, Patil AJ, et al. The fabrication of nano-hydroxyapatite on PLGA and PLGA/coIlagen nanofibrous composite scaffolds and their effects in osteoblastic behavior for bone tissue engineering[J]. Bone, 2009, 45:4～16.

[4] Lee JH, Rim NG, Jung HS, Shin H. Control of osteogenic differentiation and mineralization of human mesenchymal stem cells on composite nanofibers containing poly[lactic-co-(glycolic acid)] and hydroxyapatite[J]. Macromolecular bioscience, 2010, 10:173～182.

[5] Shen H, Hu, XX, Yang F, et al. Cell Affinity for bFGF Immobilized Heparin-Containing Poly(lactide-co-glycolide) Scaffolds[J]. Biomaterials, 2011, 32: 3404～3412.

[6] Liu XW, Okada M, Maeda H, et al. Hydroxyapatite/ Biodegradable Poly(L-lactide-co-caprolactone) Composite Microparticles as Injectable Scaffolds by a Pickering Emulsion Route[J]. Acta Biomaterialia. 2011, 7:821～828.

[7] Kum, CH, Cho Y, et al. Biodegradable Poly(L- lactide) Composites by Oligolactide-Grafted Magnesium Hydroxide for Mechanical Reinforcement and Reduced Inflammation[J]. Journal of Materials Chemistry B, 2013, 1: 2764～2772.

[8] 邵偉力,何建新,崔世忠.羥基磷灰石/柞蠶絲素核殼結構納米纖維的制備及表征[J]. 東華大學學報自然科學版, 2013, 39(1):21～25.

[9] 譚衛(wèi)琳,張琦,何健新,等. 絲素/納米纖維素晶須/殼聚糖多孔復合支架的應用[J]. 材料科學與工程學報, 2015, 33 (6): 868～872.

[10] Shao WL, He JX, Sang F, et al. Coaxial electrospun aligned tussah silk fibroin nanostructured fiber scaffolds embedded with hydroxyapatite-tussah silk fibroin nanoparticles for bone tissue engineering[J]. Materials Science and Engineering C， 2016, 58: 342～351.

Biomimetic Mineralization and Biocompatibility of PLGA/TSF Electrospun Nanofibers

WANG Qian1， SHAO Weili1,2,3， GAO Yanfei1,2,3， HE Jianxin1， CHEN Li2， CUI Shizhong1,2,3

(1.School of Textiles, Zhongyuan University of Technology, Zhengzhou 450007, China; 2.Key Laboratory of Advanced Textile Composites (Ministry of Education), Institute of Textile Composites, Tianjin Polytechnic University, Tianjin 300387, China; 3.Collaborative Innovation Center of Textile and Garment Industry, Henan Province, Zhengzhou 450007, China)

PLGA/TSF/HA electrospun nanofibers for bone tissue engineer composite scaffolds were prepared by technologies of electrospinning and simulated body fluid biomimetic mineralization. The morphology and structure of composite nanofibers were characterized by SEM, TEM, XRD and TG. Besides, hMSCs were cultured in vitro to study the biocompatible properties of composite nanofibers, which were characterized by Four methyl azo thiazole blue colorimetric (MTT) and SEM. The results indicated that PLGA/TSF nanofibers have the refined three-dimensional structure and the uniform diameter distribution with the smooth surface. HA particles uniformly distributed on the surface of PLGA/TSF nanofibers after mineralization, and the content of mineral was about 63%. The hydrophily and biocompatibility of PLGA/TSF/HA nanofiber scaffolds were significantly enhanced compared with PLGA/TSF

poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA)； tussah silk fibroin (TSF)； hydroxyapatite (HA)； Biocompatible properties

1673-2812(2017)02-0253-05

2015-12-11；

2016-03-07

國家自然科學基金資助項目(51203196，U1204510)；NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金資助項目(U1204510)；河南省教育廳科學技術研究重點資助項目(14A540003，14A540006)；鄭州市普通科技攻關資助項目(141PPTGG400)

王 倩(1992-)，女，碩士研究生，研究方向為納米生物材料。E-mail：13290907967@163.com。

何建新，男，教授，主要從事靜電紡納米復合材料研究。E-mail：hejianxin771117@163.com。

TS102.1

A

10.14136/j.cnki.issn 1673-2812.2017.02.017