許世超,溫俊男,江 南,李 嬌,王才富,董 凱,張憶一

(1.天津工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，天津 300387；2.天津工業(yè)大學(xué) 中空纖維膜材料與膜過程省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387)

實(shí)驗(yàn)技術(shù)

NaOH蝕刻玻碳電極的大腸桿菌DNA電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建及檢測

許世超1，2*,溫俊男1,江 南1,李 嬌1,王才富1,董 凱1,張憶一1

(1.天津工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，天津 300387；2.天津工業(yè)大學(xué) 中空纖維膜材料與膜過程省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387)

以NaOH蝕刻后的玻碳電極為基底制備了高靈敏與高選擇性的大腸桿菌電化學(xué)DNA傳感器。經(jīng)NaOH蝕刻后的玻碳電極被活化且在電極表面形成羧基層，為DNA探針的固定提供了更多位點(diǎn)，在偶聯(lián)劑EDC/NHS的作用下，端氨修飾的探針DNA與羧基的羧氨反應(yīng)使其以肽鍵的形式固定在電極表面，極大地提升了傳感器的靈敏度。通過電化學(xué)循環(huán)伏安法(CV)和差分脈沖法(DPV)對所制備傳感器的靈敏度和選擇性進(jìn)行表征，得到該傳感器對大腸桿菌的線性檢測范圍為12.5～62.5 nmol/L，檢出限可達(dá)1.20×10-9mol/L。

大腸桿菌；NaOH蝕刻；電化學(xué)生物傳感器

大腸埃希氏菌(Escherichia coli)簡稱大腸桿菌(E.coli)，分類于腸桿菌科、埃希氏菌屬，為革氏染色陰性直桿菌[1]。部分大腸桿菌為致病性大腸桿菌，當(dāng)其進(jìn)入人體一些組織器官時可能會引起感染，如腹膜炎、膀胱炎、腹瀉等，因此對大腸桿菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測具有重要意義[2]。傳統(tǒng)的大腸桿菌檢測方法的特點(diǎn)是檢測結(jié)果準(zhǔn)確度較高，但檢測時間長，操作過程繁瑣，不利于大腸桿菌的快速檢測[3-6]。目前采用的快速檢測大腸桿菌的方法主要有濾膜法[7]、多管發(fā)酵法[8]、熒光免疫檢測技術(shù)[9]、酶聯(lián)免疫吸附法[10]、化學(xué)發(fā)光法[11]、電化學(xué)檢測法[12-14]等。

本文采用NaOH蝕刻后的玻碳電極成功地制備出能夠特異性快速檢測大腸桿菌的電化學(xué)生物傳感器，其原理為采用NaOH在玻碳電極表面蝕刻一層羧基基團(tuán)，并以EDC/NHS作為連接劑將端氨修飾的大腸桿菌DNA與電極表面的羧基以肽鍵連接[3,15-16]，通過電化學(xué)特性的改變達(dá)到檢測大腸桿菌的目的。該方法檢測時間短，具有較高的靈敏度和選擇性，其檢出限可達(dá)1.20×10-9mol/L。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀(天津贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠)；亞甲基藍(lán)、NHS(98%)、EDC、Tris(上海阿拉丁試劑公司)。以上試劑均為分析純。

電化學(xué)工作站(美國阿美泰克-普林斯頓公司)；甘汞電極(參比電極)、鉑絲電極(輔助電極)、玻碳電極(工作電極)(天津艾達(dá)恒晟有限公司)。

1.2 電化學(xué)DNA傳感器的構(gòu)建及檢測

(1)將玻碳電極用粒徑為0.5 μm的氧化鋁拋光粉進(jìn)行拋光打磨處理5 min，然后將玻碳電極依次置于一定量的濃度為0.5 mol/L的HNO3溶液、無水乙醇以及超純水中各超聲1 min[17]。將處理好的玻碳電極置于鐵氰化鉀溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，其掃描速率為50 mV/s，掃描范圍為-0.2～0.6 V。

(2)將拋光處理好的玻碳電極置于1 mol/L的NaOH溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，將電極表面充分活化后，在其表面蝕刻大量羧基基團(tuán)，完成電極表面的NaOH蝕刻。進(jìn)行電化學(xué)蝕刻時，掃描速率為50 mV/s，掃描范圍為-0.1～1.2 V。

(3)在偶聯(lián)劑NHS/EDC的作用下，單鏈DNA探針中修飾的氨基與電極表面的羧基形成肽鍵，使單鏈探針DNA固定在電極表面[3]。其具體操作步驟為：采用微量進(jìn)樣器量取5 μL單鏈DNA探針溶液，10 μL Tris-HCL溶液(含有20 mmol/L EDC，10 mmol/L NHS，pH 7.2)滴加至玻碳電極表面，在40 ℃下反應(yīng)1 h，反應(yīng)完成后用Tris-HCl緩沖液和超純水進(jìn)行沖洗，去除未組裝的單鏈DNA，構(gòu)建完成電化學(xué)DNA傳感器[18]，通過CV和DPV法對已構(gòu)建成功的傳感器進(jìn)行性能表征。

(4)以亞甲基藍(lán)(MB)[19]作為雜交指示劑，使其充分嵌入雜交DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)中，并通過DPV法對電化學(xué)信號進(jìn)行檢測。其具體方法為：將雜交完成后的電極浸沒在一定濃度的溶有亞甲基藍(lán)的Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行自組裝，組裝完成后，依次采用Tris-HCl緩沖液和超純水進(jìn)行沖洗，除去未組裝的亞甲基藍(lán)，將處理后的電極置于Tris-HCl溶液中進(jìn)行DPV信號檢測。

圖1 裸玻碳電極(a)和蝕刻過的玻碳電極(b)的循環(huán)伏安圖Fig.1 CVs of bare GCE(a) and NaOH etching GCE(b)bottom liquid:1 mmol/L K3Fe(CN)6 solution

2 結(jié)果與討論

2.1 NaOH蝕刻玻碳電極的循環(huán)伏安曲線

分別將裸玻碳電極與經(jīng)過NaOH蝕刻的玻碳電極置于鐵氰化鉀溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，其結(jié)果如圖1所示。與裸玻碳電極相比，經(jīng)過NaOH蝕刻的玻碳電極的峰電流變小，峰位差變大，表明在經(jīng)過NaOH蝕刻后，玻碳電極表面形成一層羧基，由于羧基的存在增大了玻碳電極表面的電阻，降低了電子傳導(dǎo)率，導(dǎo)致其峰電流變小，峰位差變大。

對玻碳電極進(jìn)行NaOH蝕刻后，考察了掃描圈數(shù)對玻碳電極的影響。結(jié)果顯示，在掃描圈數(shù)為1～7圈時，電流變化較大，此時，電極表面并未完全活化，羧基層正在逐步形成。繼續(xù)掃描8～20圈時，掃描曲線趨于穩(wěn)定，重合度較好，表明經(jīng)過20圈掃描后完成了玻碳電極表面的NaOH蝕刻，在玻碳電極表面形成一層以羧基為主的官能團(tuán)[3]。

2.2 掃描速率對NaOH蝕刻玻碳電極的循環(huán)伏安曲線的影響

考察了掃描速率對NaOH蝕刻后玻碳電極的循環(huán)伏安曲線的影響(圖2)。結(jié)果顯示，隨著掃描速率的增加，玻碳電極的電化學(xué)信號產(chǎn)生規(guī)律性的變化。分別將氧化峰峰值電流(Ipa)與還原峰峰值電流(Ipc)進(jìn)行線性擬合，結(jié)果顯示，峰值電流與掃描速率呈良好的線性關(guān)系(圖2插圖)，其中，氧化峰峰值電流擬合曲線的線性擬合方程為：Ipa=0.012 71v+1.223(r=0.997 6)；還原峰峰值電流曲線線性擬合方程為：Ipc=-0.012 86v-1.651(r=0.995 5)。

由以上分析可知，NaOH蝕刻玻碳電極為典型的表面控制過程[20]。根據(jù)Laviron方程計算出電極表面官能團(tuán)濃度c。計算公式如下：

Ip=nFQX/(4RT)

(1)

Q=nFAc

(2)

式中，n為電子轉(zhuǎn)移數(shù)目，F(xiàn)為法拉第常數(shù)，Q為還原峰的積分值，X為掃描速率，R為氣體摩爾常數(shù)，T為熱力學(xué)溫度；由上式計算出經(jīng)NaOH蝕刻后的玻碳電極表面的羧基濃度約為 2.021×10-6mol/cm2。

2.3 不同組裝成分的循環(huán)伏安曲線

圖2 電化學(xué)蝕刻后的玻碳電極在不同掃速下的循環(huán)伏安圖Fig.2 CV curves of NaOH etching GCE in different scan rates bottom liquid:PBS buffer；scan range:0.01-1 V/s；inset:linear fit of electrochemical etching of glassy carbon electrode with different scan speeds of oxidation peak current(Ipa) and reduction peak current(Ipc)

考察了不同組裝成分電極的循環(huán)伏安曲線(見圖3)。由圖3可見，對裸玻碳電極(曲線a)和組裝單鏈DNA探針的玻碳電極(曲線b)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描時，循環(huán)伏安曲線上并無明顯的氧化還原峰出現(xiàn)，這是因?yàn)樵谶@兩種電極表面未組裝雜交指示劑MB，在雜交過后的玻碳電極表面進(jìn)行MB自組裝之后，在-0.249 V和-0.314 V出現(xiàn)了MB的氧化還原峰。以上結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)的電化學(xué)DNA傳感器成功構(gòu)建，雜交指示劑MB已成功組裝到雜交后的玻碳電極表面，并表現(xiàn)出良好的電化學(xué)氧化還原性能。

圖3 電化學(xué)DNA傳感器組裝的循環(huán)伏安圖Fig.3 CV curves of electrochemical DNA sensor scan range:-0.6-0.2 V,scan rate:50 mV/s；a.bare GCE electrode，b.bare GCE electrode with single-stranded DNA，c.bare GCE electrode with hybrid DNA

圖4 電化學(xué)DNA傳感器與不同DNA雜交后的差分脈沖伏安圖Fig.4 DPV curves of hybridization between electrochemical DNA sensor and different DNAa.bare GCE electrode；b.bare GCE electrode with probe DNA；c.multi-base mismatch target DNA；d.two base mismatched target DNA；e.single base mismatch target DNA；f.fully complementary target DNA；bottom liquid：Tris-HCl buffer(50 nmol/L，pH=7.2)；DNA hybridization solution concentration:50 nmol/L,hybridization temperature：37 ℃，hybridization time:1 h；inset：relative peak histogram

2.4 傳感器的特異性檢測

采用DPV法對制備的電化學(xué)生物傳感器的特異性進(jìn)行表征，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4(a-f)所示。由圖4可以看出，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，玻碳電極表面的探針DNA與互補(bǔ)的目標(biāo)DNA(曲線f)進(jìn)行雜交時，電化學(xué)信號最強(qiáng)，這是由于探針DNA與互補(bǔ)的目標(biāo)DNA形成了完整的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，雜交指示劑MB能夠充分嵌入DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中，產(chǎn)生較強(qiáng)的電化學(xué)信號。當(dāng)探針DNA與單堿基錯配的目標(biāo)DNA(曲線e)以及兩堿基錯配的目標(biāo)DNA(曲線f)進(jìn)行雜交時，由于其未形成完整的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，雜交指示劑MB不能充分地嵌入雙鏈結(jié)構(gòu)中，造成其電化學(xué)信號與完全互補(bǔ)的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)(曲線f)相比有明顯的減少。當(dāng)探針DNA與多堿基錯配的目標(biāo)DNA(曲線c)進(jìn)行雜交時，幾乎未形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，因此其電化學(xué)信號僅比未雜交的探針DNA(曲線b)略微增強(qiáng)，其原因是：在進(jìn)行雜交時，微量的ssDNA通過物理作用吸附在玻碳電極表面并與雜交指示劑MB進(jìn)行自組裝，產(chǎn)生微量的電化學(xué)信號，曲線a為裸玻碳電極與探針DNA的空白試驗(yàn)，其信號相對強(qiáng)度對比如圖4插圖所示。以上結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)所制備的電化學(xué)DNA傳感器具有良好的特異性與選擇性，能夠?qū)Υ竽c桿菌DNA進(jìn)行快速的特異性檢測。

圖5 不同溫度條件下差分脈沖信號與不同雜交時間的關(guān)系圖Fig.5 DPV curves of relationship between different temperatures and different hybridization times a.25 ℃，b.37 ℃，c.50 ℃，d.65 ℃

圖6 電化學(xué)DNA傳感器與不同濃度目標(biāo)DNA雜交的差分脈沖曲線圖Fig.6 DPV curves of hybridization signs between electroche-mical DNA sensor and different concentrations of target DNA concentration of target DNA(a-e):12.5,25.0,37.5,50.0,62.5 nmol/L;insert:linear relationship between concentration of target DNA and electrochemical signals

2.5 DNA雜交時間與雜交溫度的優(yōu)化

電化學(xué)DNA傳感器的檢測過程中，探針DNA與目標(biāo)DNA的雜交時間與雜交溫度會對差分脈沖信號具有一定影響。圖5的研究結(jié)果顯示，隨著溫度的升高，雜交時間逐漸縮短，當(dāng)雜交溫度達(dá)到65 ℃(曲線d)時，由于溫度過高，并未出現(xiàn)明顯的雜交現(xiàn)象，當(dāng)雜交溫度為25 ℃時，在100 min形成完整的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，當(dāng)雜交溫度升至37 ℃時，在60 min形成完整的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，當(dāng)雜交溫度達(dá)到50 ℃時，在40 min形成完整的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，但由于其溫度較高，形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)很快遭到破壞，其電化學(xué)信號明顯減少[21]。綜合以上分析，實(shí)驗(yàn)采用37 ℃作為DNA雜交的最佳溫度。

2.6 雜交指示劑MB的最佳組裝時間與最佳濃度考察

考察了雜交指示劑MB的組裝時間以及濃度的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)探針DNA與目標(biāo)DNA雜交后進(jìn)行MB組裝時，隨著組裝時間的增加，電化學(xué)信號逐漸增強(qiáng)，并在10 min處達(dá)到最大值，隨著時間的增加，電化學(xué)信號不再出現(xiàn)明顯的改變，因此選取10 min作為MB組裝的最佳時間。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，隨著MB濃度的逐漸增加，電化學(xué)信號逐漸增強(qiáng)，在MB濃度為6.76×10-5mol/L時達(dá)到最大值，此后隨著MB濃度的增加，電化學(xué)信號無明顯改變，因此選擇6.76×10-5mol/L作為亞甲基藍(lán)MB組裝的最佳濃度。

2.7 電化學(xué)生物傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及穩(wěn)定性

考察了傳感器與不同濃度目標(biāo)DNA雜交的差分脈沖曲線圖。結(jié)果顯示，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，隨著目標(biāo)DNA濃度的增加，電化學(xué)差分脈沖信號明顯增強(qiáng)(圖6)，將不同的目標(biāo)DNA濃度與電化學(xué)差分脈沖信號進(jìn)行線性擬合即可得圖6插圖，兩者具有良好的線性關(guān)系。其線性范圍為12.5～62.5 nmol/L,線性擬合方程為：Ip=-14.46-0.083 03C(r=0.974 5)(式中C為目標(biāo)DNA濃度，Ip為電信號值)，通過對平行試驗(yàn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差分析，可以看出，在線性檢測范圍內(nèi)本傳感器具有較好的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，根據(jù)3σ法，可以計算出實(shí)驗(yàn)制備的電化學(xué)DNA傳感器的檢出限為1.20×10-9mol/L。

3 結(jié) 論

本文構(gòu)建了基于NaOH蝕刻玻碳電極特異性檢測大腸桿菌特征序列DNA的電化學(xué)傳感器，并以亞甲基藍(lán)作為DNA雜交指示劑。對傳感器的特異性，DNA雜交時間及溫度，亞甲基藍(lán)的組裝時間及濃度條件進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，經(jīng)NaOH蝕刻后的玻碳電極表面羧基層的存在提高了傳感器的靈敏度，實(shí)現(xiàn)了在較短時間內(nèi)對大腸桿菌特征序列DNA的特異性檢測，其檢出限可達(dá)1.20×10-9mol/L。

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Preparation of an Electrochemical Biosensor Based on Sodium Hydroxide Etching Glassy Carbon Electrode and Its Detection on E.coli

XU Shi-chao1,2*，WEN Jun-nan1,JIANG Nan1,LI Jiao1，WANG Cai-fu1，DONG Kai1，ZHANG Yi-yi1

( 1.Environmental and Chemical Engineering，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300387，China；2.The State Key Laboratory of Hollow Fiber Membrane Materials and Membrane Processes,Tianjin Polytechnic University,Tianjin 300387，China)

A high sensitive and selective electrochemical DNA sensor for E.coli was prepared by using NaOH etched glassy carbon electrode(GCE) as the substrate.Carboxyl was brought to the surface of GCE via NaOH etching,which improved DNA probes surface density.DNA probes was immobilized on the surface of GCE through the peptide bond.The sensitivity and selectivity of the sensor were characterized by cyclic voltammetry(CV) and differential pulse voltammetric(DPV) methods.The sensor shows a high sensitive and selective response to ssDNA of E.coli,and its linear range was 12.5-62.5 nmol/L with a detection limit of 1.20×10-9mol/L.

E.coli；NaOH etching；electrochemical biosensor

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.04.020

2016-08-31；

2016-12-20

O657.1；Q523

A

1004-4957(2017)04-0555-05

*通訊作者：許世超，副教授，研究方向: 電化學(xué)生物傳感及納米催化材料,Tel：022-83955112，E-mail：xushichao@tjpu.edu.cn