高 雪，劉文文，王星敏

(1.重慶工商大學(xué) 天然藥物研究重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400067；2.重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067；3.重慶市公安局物證鑒定中心，重慶 400021)

固相支撐液液萃取/氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定血液中雙甲脒、殺蟲脒及其代謝產(chǎn)物

高 雪1,2*，劉文文3，王星敏2

(1.重慶工商大學(xué) 天然藥物研究重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400067；2.重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067；3.重慶市公安局物證鑒定中心，重慶 400021)

建立了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定血液中雙甲脒、殺蟲脒及其代謝產(chǎn)物的分析方法。優(yōu)化了樣品前處理方法及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析條件，樣品經(jīng)固相支撐液液萃取柱(SLE)凈化，乙腈-二氯甲烷(體積比1∶1)洗脫后，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)下檢測(cè)。結(jié)果表明，2,4-二甲基苯胺、4-氯鄰甲苯胺和雙甲脒在1.0～1 000 ng/mL范圍內(nèi)，其余目標(biāo)物在2.0～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；定量下限為1.0～2.0 ng/mL，加標(biāo)回收率為88.6%～113%。該方法簡(jiǎn)便、快捷、樣品用量小，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，適用于血液中6種目標(biāo)物的同時(shí)檢測(cè)。

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；固相支撐液液萃??；血液；殺蟲脒；雙甲脒；代謝產(chǎn)物

圖1 6種目標(biāo)物的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Molecular structures of six compounds

三元取代的甲脒類化合物具有潛在的殺螨和殺菌活性，以其為基礎(chǔ)開發(fā)出的殺蟲脒(Chlordimeform)和雙甲脒(Amitraz)農(nóng)藥[1](結(jié)構(gòu)式見圖1)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。雙甲脒和殺蟲脒被人體吸收后，代謝速度快，在體內(nèi)分別被代謝為單甲脒(N-2,4-Dimethylphenyl-N-methyl-formamidine,DMPF)、2,4-二甲基苯基甲酰胺(2,4-Dimethylformamidine,DMF)、2,4-二甲基苯胺(2,4-Dimethylaniline,DMA)和4-氯鄰甲苯胺(4-Chloro-2-methylaniline)(結(jié)構(gòu)式見圖1)，母體及代謝產(chǎn)物均對(duì)人體具有危害性[2-3]，因其濫用或使用不當(dāng)而導(dǎo)致的人體中毒事件多有發(fā)生[4-5]。因此，在生物檢材中，對(duì)雙甲脒和殺蟲脒原藥及其代謝物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)很有必要。血液作為易得的生物檢材，常見于中毒案件中的檢測(cè)分析，因此建立血液基質(zhì)中雙甲脒、殺蟲脒殺蟲劑及其代謝產(chǎn)物的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法十分必要。

目前針對(duì)甲脒類農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法研究主要針對(duì)蜂蜜和魚類等農(nóng)副產(chǎn)品，常見檢測(cè)方法為氣相色譜法[6-7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8-11]和液相色譜-質(zhì)譜法[12-13]。而針對(duì)中毒血液檢材中甲脒類農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法研究較少。

固相支撐液液萃取法(SLE)作為一種較新的前處理方法，在傳統(tǒng)液液提取方法的基礎(chǔ)上，采用硅藻土作為吸附劑，利用其吸水性強(qiáng)、具有惰性等特點(diǎn)，快速地吸附樣品基質(zhì)中的水分使目標(biāo)物與水分分離，具有不易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象、基質(zhì)效應(yīng)降低和需要樣品量少等優(yōu)點(diǎn)。相較于固相微萃取法(SPME)[14]、液液萃取法(LLE)[15-16]、固相萃取法(SPE)[17-18]等傳統(tǒng)血液前處理方法，有效提高了樣品的提取能力和效率，近年來被廣泛應(yīng)用于血液和尿液的前處理[19]。此外，相比于氣相色譜-質(zhì)譜法的全掃描方式，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的抗噪音和干擾能力更強(qiáng)，對(duì)目標(biāo)物具有更高的選擇性和靈敏度，更適合于多組分、低含量水平生物基質(zhì)中農(nóng)藥的檢測(cè)。

本研究利用固相支撐液液萃取(SLE)法,建立了適合血液基質(zhì)中常見甲脒類農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的前處理方法,然后使用GC-MS/MS 對(duì)其進(jìn)行定性定量分析,從而為血液中常見的甲脒類農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物檢測(cè)提供了科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津TQ-8040型氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：日本島津公司產(chǎn)品；Allegra X-64R型高速冷凍離心機(jī)：貝克曼公司產(chǎn)品；HGC-24型氮吹儀:天津恒奧公司產(chǎn)品；Millipore Direct-Q3型純水儀:美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；SLE固相支撐液液萃取小柱:天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品。

甲醇、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、甲基叔丁基醚(色譜純，美國(guó)Tieda公司)；pH值分別為4.0，6.0，8.0，10.0和12.0的緩沖溶液(Fluka 公司)；雙甲脒、單甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺、2,4-甲基苯胺、殺蟲脒、4-氯-2-甲基苯胺(北京百靈威公司)；空白血液從重慶市血液中心獲取。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱：島津SH-Rxi-5 Sil MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱；升溫程序：50 ℃保留1 min，以25 ℃/min升溫至125 ℃/min，然后以10 ℃/min升溫至300 ℃/min；載氣(He)流速1.5 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL；碰撞氣：Ar(99.999%)；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：250 ℃。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源；電子能量：70 eV；離子源溫度：200 ℃；色譜質(zhì)譜接口溫度；280 ℃；溶劑延遲時(shí)間：2 min；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)進(jìn)行檢測(cè)；其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 6種目標(biāo)物的保留時(shí)間及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times(Rt) and MRM parameters of six compounds

* quantitative ion

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確移取待測(cè)血液100 μL，加入pH 8.0的緩沖溶液400 μL，渦旋混勻后將樣品加入固相支撐液液萃取柱中，待樣品全部均勻吸附在填料上后，平衡5 min。每次使用1.5 mL的乙腈-二氯甲烷混合洗脫溶劑(體積比1∶1)進(jìn)行洗脫，連續(xù)洗脫3次。合并收集到的洗脫液在40 ℃加熱下用氮?dú)獯蹈珊?，用甲醇?fù)溶后定容至50 μL，進(jìn)氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 洗脫溶劑的優(yōu)化 為了有效地將所有目標(biāo)物從SLE柱上洗脫下來，將標(biāo)準(zhǔn)工作液添加到空白血液中配成濃度為200.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品。選取甲醇、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷5種液液提取和固相萃取常用的溶劑作為洗脫溶劑進(jìn)行洗脫實(shí)驗(yàn)，洗脫次數(shù)和洗脫體積按照文獻(xiàn)操作[20]。結(jié)果表明，乙腈作為洗脫溶劑時(shí)對(duì)2,4-二甲基苯胺、單甲脒、雙甲脒和4-氯-2-甲基苯胺的洗脫效率大于80%，二氯甲烷對(duì)2,4-二甲基苯基甲酰胺、雙甲脒和殺蟲脒的洗脫效率大于80%，為使所有目標(biāo)物都能被有效洗脫，進(jìn)一步考察了乙腈-二氯甲烷溶劑的洗脫能力。結(jié)果表明當(dāng)洗脫溶劑乙腈-二氯甲烷的配比為1∶1時(shí)對(duì)所有目標(biāo)物的回收率均大于80%，因此最終選擇其作為洗脫溶劑。

圖2 不同pH值對(duì)目標(biāo)物回收率的影響(n=3)Fig.2 Effect of different pH values on recoveries of target compounds(n=3)

2.1.2 樣品溶液pH值對(duì)回收率的影響 已有文獻(xiàn)報(bào)道表明，雙甲脒及殺蟲脒使用液液提取法在堿性條件下的回收率較高[21]。本實(shí)驗(yàn)考察了濃度為500.0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液加標(biāo)樣品在不同 pH值(pH 4.0,6.0，8.0，10.0，12.0)下的回收率，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，在pH 8.0條件下所有目標(biāo)物的回收率均大于80%，因此本實(shí)驗(yàn)選取pH 8.0為最佳提取pH值。

2.2 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本方法采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行分析，應(yīng)用特征離子對(duì)進(jìn)行目標(biāo)物的定性定量檢測(cè)。為了獲取不同目標(biāo)物穩(wěn)定可靠的質(zhì)譜條件，保證定性定量分析的準(zhǔn)確性，分別對(duì)每種目標(biāo)物離子對(duì)的母離子、子離子和碰撞能等一系列參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的每種目標(biāo)物特征離子對(duì)MRM色譜圖見圖3，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

圖3 6種目標(biāo)物的定量離子MRM圖譜(500 ng/mL)Fig.3 MRM chromatograms of six targeted compounds(500 ng/mL)

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系與方法檢出限 使用不含目標(biāo)物的空白血液為基質(zhì)，添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配成系列含有6種目標(biāo)物的基質(zhì)添加樣品，采用“1.2”條件進(jìn)行氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，以各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(x，ng/mL)為橫坐標(biāo),定量離子對(duì)的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，6種目標(biāo)物在測(cè)試范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

在空白血液中，添加一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照建立好的處理方法和儀器檢測(cè)條件對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，以每種目標(biāo)物定量離子對(duì)色譜峰的信噪比≥10時(shí)來確定目標(biāo)物的定量下限(LOQ)。結(jié)果表明，6種目標(biāo)物的LOQ為1.0～2.0 ng/mL(表2)。

表2 6種目標(biāo)物的定量下限、線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率與精確度(n=6)Table 3 The quantitation limits ,linear equations,correlation coefficients(r2),recoveries and RSDs of six compounds(n=6)

2.3.2 準(zhǔn)確度與精密度 取不含6種目標(biāo)物的空白血液為基質(zhì)，添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液后分別配成濃度為L(zhǎng)OQ，50.0 ng/mL，500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，每個(gè)濃度配制6個(gè)樣品，按本文優(yōu)化的前處理和檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)定每種目標(biāo)物的含量，計(jì)算回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。測(cè)得回收率為88.6%～113%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于11.6 %，方法的準(zhǔn)確度和精密度符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

2015年3月，某女，27 歲，被疑為殺蟲脒農(nóng)藥中毒經(jīng)搶救無效死亡，于死后采集心血按照本方法進(jìn)行樣品前處理并檢測(cè)。結(jié)果檢測(cè)出殺蟲脒濃度為187.5 ng/mL，4-氯鄰甲苯胺濃度為278.3 ng/mL，樣品色譜圖見圖4。2015年6月，在某廢棄房屋中發(fā)現(xiàn)1具未知名尸體，現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)疑似農(nóng)藥瓶，提取現(xiàn)場(chǎng)農(nóng)藥瓶和心血按照本文方法進(jìn)行樣品前處理并檢測(cè)。結(jié)果農(nóng)藥瓶中檢出雙甲脒和單甲脒成分，心血中檢出雙甲脒濃度為89.5 ng/mL，單甲脒濃度為21.5 ng/mL，DMF濃度為70.6 ng/mL，DMA濃度為154.3 ng/mL。

3 結(jié) 論

本文采用SLE/GC-MS/MS檢測(cè)方法，建立了血液中雙甲脒、殺蟲脒及其代謝產(chǎn)物的測(cè)定方法。血液樣品中目標(biāo)物經(jīng)SLE方法凈化富集后，進(jìn)行GC-MS/MS測(cè)定。本方法可同時(shí)定性定量分析血液中6種目標(biāo)物，回收率高、 檢出限低、精密度好，能夠滿足日常中毒案件中對(duì)于雙甲脒、殺蟲脒及其代謝產(chǎn)物的檢驗(yàn)需求。

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Determination of Amitraz,Chlordimeform and Their Metabolites in Blood by Solid Supported Liquid Extraction and Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

GAO Xue1,2*,LIU Wen-wen3,WANG Xing-min2

(1.Chongqing Key Laboratory of Natural Medicine Research,Chongqing Technology and Business University,Chongqing 400067,China；2.College of Environment and Resources,Chongqing Technology and Business University,Chongqing 400067,China；3.Chongqing Institute of Forensic Science,Chongqing 400021,China)

A method was developed for the determination of amitraz,chlordimeform and their metabolites in blood by gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS).The conditions for sample pretreatment and GC-MS/MS parameters were optimized.The samples were pretreated by solid supported liquid extraction(SLE),and eluted with acetonitrile-dichloromethane(1∶1).The detection was carried out by GC-MS/MS in multiple reaction monitoring(MRM) mode.Good linear relationships for 2,4-dimethylaniline(DMA),4-chloro-2-methylaniline and amitraz were obtained in the range of 1.0-1 000 ng/mL,and those for other three compounds were obtained in the range of 2.0-1 000 ng/mL,with correlation coefficients more than 0.99.The limits of quantitation were in the range of 1.0-2.0 ng/mL,and the recoveries ranged from 88.6% to 113%.With the advantages of simplicity,rapidness,low sample consumption,accuracy and reliability,this methed is suitable for the determination of six compounds in blood.

gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS)；solid supported liquid extraction；blood；chlordimeform；amitraz；metabolites

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.04.017

2016-09-18；

2016-11-24

O657.63；F767.2

A

1004-4957(2017)04-0539-05

*通訊作者：高 雪，副研究員，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué),E-mail:gaoxue@ctbu.edu.cn