丁正蛟，孟 帥，劉亞君

(云南大學 云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650091)

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鬼傘屬真菌的殺線蟲活性

丁正蛟，孟 帥，劉亞君*

(云南大學 云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650091)

研究了10種鬼傘屬真菌對全齒復活線蟲的毒殺活性，并用HPLC法分析了殺線蟲毒素在各真菌中的分布。結(jié)果表明，有7種鬼傘屬真菌表現(xiàn)出明顯的殺線蟲活性，且殺線蟲活性與其殺線蟲毒素的分布呈正相關。

鬼傘屬；殺線蟲活性；殺線蟲毒素

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)約21屬90多種擔子菌可以捕食線蟲。Luo等[1]報道毛頭鬼傘(C.comatus)可以捕殺全齒復活線蟲(Panagrellus redivivus)和根結(jié)線蟲。研究發(fā)現(xiàn)，鬼傘屬真菌的殺線蟲活性與殺線蟲毒素密切相關，毛頭鬼傘含有多種殺線蟲毒素[2]。作者在此研究了10種鬼傘屬真菌對全齒復活線蟲的毒殺活性，測定了殺線蟲毒素的分布，建立了每種真菌的代謝物HPLC圖譜，構建了化學成分相似性聚類樹，以期找到代謝物和殺線蟲活性之間的相關性，為深入研究鬼傘屬真菌的殺線蟲活性提供幫助。

1 實驗

1.1 真菌的培養(yǎng)

10種鬼傘屬真菌均保藏于云南生物資源保護與利用國家重點實驗室的培養(yǎng)物保藏中心。 將10種真菌分別接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(直徑9cm培養(yǎng)平板)上，22 ℃靜置培養(yǎng)12d，提取代謝物。每種真菌做3個平行。

1.2 代謝物的提取

代謝物的提取參照Smedsgaard[3]和Andersen等[4]建立的微萃取法并加以改進。用100mL氯仿-甲醇(1∶1，體積比)浸提10種真菌培養(yǎng)物； 然后用100mL乙酸乙酯萃取殘余物，最后用100mL丙醇萃取；合并所有萃取物，減壓蒸發(fā)溶劑，干燥，得代謝提取物。

1.3 代謝物化學成分的測定

將干燥的代謝提取物溶解于1mL甲醇中，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，以從毛頭鬼傘中分離的一系列殺線蟲毒素作為外標，采用HPLC法測定代謝物的化學成分。

HPLC色譜條件：Agilent1100系統(tǒng)(Agilent，USA)，SB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm，Agilent，USA)，DAD檢測器全掃描，5%～100%乙腈線性梯度洗脫，流速1.0mL·min-1，60min。 所用化學品均為Merck公司HPLC級，水為雙蒸水。

1.4 殺線蟲活性的測定

將全齒復活線蟲置于燕麥片培養(yǎng)基(燕麥片20g+水80mL)上于25 ℃培養(yǎng)7d，通過Baermann漏斗法[5]從培養(yǎng)基中分離線蟲。

殺線蟲活性的測定參照文獻[6]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

將10種真菌代謝提取物的HPLC圖譜與總圖譜進行比較，其中毒素存在的賦予值“1”，毒素缺乏的賦予值“0”。以毛頭鬼傘的色譜圖為標準，采用UPGMA法構建化學成分相似性聚類樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 鬼傘屬真菌的殺線蟲活性

10種鬼傘屬真菌培養(yǎng)物和提取物的殺線蟲活性如表1所示。

表1 10種鬼傘屬真菌培養(yǎng)物和提取物的殺線蟲活性

Tab.1 Nematicidal activities of culture and extract from ten kinds of Coprinus fungi

注：“++”表示線蟲致死率在80%以上(18 h)，“+”表示線蟲致死率在50%～80%(18 h)，“-”表示線蟲致死率小于 50%(18 h)。

由表1可知，在10種鬼傘屬真菌中，4#、5#、6#真菌的培養(yǎng)物和提取物都具有明顯的殺線蟲活性，7#、8#、10#真菌的培養(yǎng)物和提取物有一定的殺線蟲活性，1#、2#、3#真菌的培養(yǎng)物和提取物殺線蟲活性很弱，9#真菌的培養(yǎng)物殺線蟲活性也很弱，但其提取物具有較強的殺線蟲活性。表明，部分鬼傘屬真菌具有殺線蟲活性，且殺線蟲活性強度不同。

2.2 鬼傘屬真菌殺線蟲毒素的分布

從毛頭鬼傘中分離得到的7種殺線蟲毒素(Ⅰ～Ⅶ)在10種鬼傘屬真菌中的分布情況如表2所示。

表2 殺線蟲毒素在10種鬼傘屬真菌中的分布

Tab.2 Distribution of nematotoxin in ten kinds of Coprinus fungi

注：Ⅰ為5-methylfuran-3-carboxylic acid；Ⅱ為5-hydroxy-3,5-dimethylfuran-2(5H)-one；Ⅲ為5-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-5-methylfuran-2(5H)-one；Ⅳ為4,6-dihydroxyisobenzofuran-1,3-dione；Ⅴ為4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one；Ⅵ為4,6-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one；Ⅶ為3-formyl-2,5-dihydroxybenzyl acetate?！?”表示檢測到殺線蟲毒素，“-”表示未檢測到殺線蟲毒素。

由表2可知，在7種真菌中檢測到了殺線蟲毒素同系物，與它們的殺線蟲活性相對應。比較表1和表2發(fā)現(xiàn)：9#真菌沒有檢測到殺線蟲毒素但其代謝提取物卻有著較強的殺線蟲活性，而殺線蟲活性較強的7#真菌的殺線蟲毒素分布不如殺線蟲活性較弱的8#真菌，這可能是因為，鬼傘屬真菌中可能還存在其它具有殺線蟲活性的化合物，而不僅僅只有殺線蟲毒素Ⅰ～Ⅶ；1#真菌雖檢測到殺線蟲毒素但殺線蟲活性卻很弱，可能是因為所含殺線蟲毒素的含量較低所致。

2.3 鬼傘屬真菌化學成分相似性聚類樹分析

基于10種鬼傘屬真菌的殺線蟲毒素分布(表2)進行聚類分析得到的樹形圖如圖1所示。

從圖1可以看到， 10種鬼傘屬真菌被歸在2個不同的簇。一個簇包括強殺線蟲活性的3個物種，另一個簇中物種的殺線蟲活性不明顯；具有相似活性的物種在聚類距離上接近。這表明鬼傘屬真菌的殺線蟲活性和其殺線蟲毒素的分布呈正相關。

圖1 10種鬼傘屬真菌化學成分相似性聚類樹Fig.1 Cluster tree of ten kinds of Coprinus fungi based on chemical composition similarity

3 結(jié)論

所測試的10種鬼傘屬真菌中有7種對全齒復活線蟲有明顯的毒殺活性，且其毒殺活性與殺線蟲毒素的分布呈正相關。若能對影響殺線蟲活性的代謝物進行進一步的分離和鑒定，必會為鬼傘屬真菌殺線蟲特性提供更多的證據(jù)。

[1] LUO H,MO M H,ZHANG K Q.An unusual structure designated spinous ball was found on a nematophagousBasidiomycetousfungusCoprinuscomatus[J].Mycological Research,2004,96：1219-1226.

[2] 劉亞君.鬼傘屬真菌殺線蟲活性化合物分離、鑒定[D].昆明：云南大學,2005.

[3] SMEDSGAARD J.Micro-scale extraction procedure for standardized screening of fungal metabolite production in cultures[J].Journal of Chromatography A,1997,760(2):264-270.

[4] ANDERSEN B,KROGER E,ROBERTS R G.Chemical and morphological segregation ofAlternariaalternata,A.gaisenandA.longipes[J].Mycological Research,2001,105(3):291-299.

[5] GRAY N F.Ecology of nematophagous fungi:comparison of the soil sprinkling method with the Baermann funnel technique in the isolation of endoparasites[J].Soil Biology & Biochemistry,1984,16(1):81-83.

[6] STADLER M,ANKE H,BERGQUIST K E,et al.Lachnumon and lachnumol A,new metabolites with nematicidal and antimicrobial activities from the ascomyceteLachnumpapyraceum(Karst.) Karst.Ⅱ.structural elucidation[J].Journal of Antibiotics,1993,46(6):968-971.

Nematicidal Activity ofCoprinusFungi

DING Zheng-jiao,MENG Shuai,LIU Ya-jun*

(StateKeyLaboratoryforConservationandUtilizationofBio-ResourceinYunnan,YunnanUniversity,Kunming650091,China)

NematicidalactivitiesoftenkindsofCoprinusfungiagainstPanagrellus redivivuswerestudied.DistributionofnematotoxininvariousfungiwasanalyzedbyHPLC.Resultsindicatedthat,sevenkindsofCoprinusfungishowedsignificantnematicidalactivity,andthenematicidalactivitywaspositivelyrelatedtodistributionofnematotoxin.

Coprinus;nematicidalactivity;nematotoxin

國家自然科學基金資助項目(30860009，31260446)

2016-11-22

丁正蛟(1992-)，男，云南曲靖人，碩士研究生，研究方向：植物保護，E-mail:526543777@qq.com；通訊作者：劉亞君，副研究員，E-mail:lyj@ynu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.04.005

Q939

A

1672-5425(2017)04-0019-02

丁正蛟，孟帥，劉亞君.鬼傘屬真菌的殺線蟲活性[J].化學與生物工程，2017，34(4)：19-20，27.