胡久平，鄢平，戚珊珊，趙輝

1(西藏月王藏藥科技有限公司，西藏 拉薩，850000) 2(西藏高原微生物發(fā)酵工程技術研究中心，西藏 拉薩，850000) 3(拉薩市青稞發(fā)酵工程技術研究中心，西藏 拉薩，850000)

發(fā)酵條件對青稞紅曲中Monacolin K和β-葡聚糖的影響

胡久平，鄢平，戚珊珊，趙輝*

1(西藏月王藏藥科技有限公司，西藏 拉薩，850000) 2(西藏高原微生物發(fā)酵工程技術研究中心，西藏 拉薩，850000) 3(拉薩市青稞發(fā)酵工程技術研究中心，西藏 拉薩，850000)

研究了青藏高原環(huán)境下高溫發(fā)酵溫度、低溫發(fā)酵溫度、發(fā)酵濕度和發(fā)酵溫濕度的波動性對青稞紅曲中Monacolin K和β-葡聚糖含量的影響。單因素、正交試驗和驗證試驗表明，發(fā)酵條件對青稞紅曲中Monacolin K含量影響的主次因素為：高溫發(fā)酵溫度>低溫發(fā)酵溫度>發(fā)酵濕度，最佳發(fā)酵條件為高溫發(fā)酵溫度30 ℃，低溫發(fā)酵溫度為21 ℃，發(fā)酵濕度為60%。以優(yōu)化的發(fā)酵條件進行驗證試驗，青稞紅曲中Monacolin K含量可達1.94%。青稞紅曲中β-葡聚糖含量僅與高溫發(fā)酵階段紅曲的生長情況有關。發(fā)酵過程中溫濕度波動對青稞紅曲中Monacolin K含量有較大影響。

發(fā)酵；青稞紅曲；Monacolin K；β-葡聚糖

青稞紅曲以青稞為基質經(jīng)紅曲霉發(fā)酵而成。紅曲霉在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生Monacolin K(MK)、色素等次級代謝產(chǎn)物，因發(fā)酵基質不同還可不同程度地保留發(fā)酵基質中的功效成分。ENDO[1]在紅曲霉代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了Monacolin K。研究表明，Monacolin K可以有效降低人體內(nèi)膽固醇水平[2]。他汀類藥物是當今藥品市場上主要降血脂藥物之一，而洛伐他汀作為新型降血脂藥因其獨特療效，被譽為治療心血管系統(tǒng)疾病的里程碑藥物。NEW MAN等[3-7]研究表明，β-葡聚糖具有降血脂、降低膽固醇、降血糖、抗運動疲勞等作用。青稞作為世界上麥類作物中β-葡聚糖含量最高的作物，其β-葡聚糖平均含量為6.57%，西藏優(yōu)良品種藏青25中可達8.6%，是小麥平均含量的50倍。本研究探討了紅曲霉菌以青稞為發(fā)酵基質在青藏高原環(huán)境下，固態(tài)發(fā)酵過程中的溫度、濕度對Monacolin K和β-葡聚糖的影響，為青藏高原環(huán)境下紅曲霉菌發(fā)酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

紅曲霉菌(QZGYC G0009),保藏于青藏高原微生物國家地方聯(lián)合工程研究中心。

1.1.2 主要儀器和試劑

1260安捷倫高效液相色譜,安捷倫科技有限公司；DH-360A 電熱恒溫光照培養(yǎng)箱,北京科偉興儀器有限公司；SW-CJ-1F 凈化工作臺,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器，上海三申公司；ZK-82A型真空干燥箱；UV759紫外可見分光光度計,上海元析儀器有限公司。

洛伐他汀標準品，美國Sigma公司；PM 273Megazyme 混聯(lián)β-葡聚糖檢測試劑盒，博歐實德生物技術有限公司；葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、KH2PO4、K2HPO4、瓊脂粉、麥芽糖、酵母膏(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)菌種斜面培養(yǎng)基：沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基(麥芽糖5 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，瓊脂粉40 g，水1 000 mL，pH自然)，自制。

(2)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：青稞(市售)粉碎成3～4瓣，于拌料機中加50%的水(m/m)，浸泡15 min，拌勻，每瓶取300 g裝于1 000 mL三角瓶中，于0.1 MPa下滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

(1)斜面培養(yǎng)：取紅曲霉菌點種于斜面培養(yǎng)基上，30 ℃，避光培養(yǎng)7 d。

(2)種子液培養(yǎng)：將點種于茄子瓶斜面中的菌落，以50 mL無菌水洗孢，制成終濃度為106個/mL 的均一懸液。以5%(v/v)接種于添加0.2%青稞粉的改良沙氏液態(tài)培養(yǎng)基中，30 ℃，160 r/min，閉光培養(yǎng)3 d。

1.2.2 發(fā)酵溫度的影響

青稞紅曲發(fā)酵分為高溫發(fā)酵階段和低溫發(fā)酵階段。

(1)高溫發(fā)酵：將種子液按10%(v/m)接種于滅菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中并搖散。分別置于27、30、33、36℃下發(fā)酵4 d，后轉入20 ℃下發(fā)酵10 d，整個發(fā)酵過程濕度保持在40%，收獲發(fā)酵產(chǎn)物，于60 ℃下烘干，粉碎備用。

(2)低溫發(fā)酵：將種子液按10%(v/m)接種于滅菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中并搖散，于33 ℃下發(fā)酵4 d后，分別于15、18、21、24 ℃下發(fā)酵10 d，整個發(fā)酵過程濕度保持在40%，收獲發(fā)酵產(chǎn)物于60 ℃下烘干，粉碎備用。

1.2.3 發(fā)酵濕度的影響

將種子液按10%(v/m)接種于滅菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中并搖散。分別置于33 ℃下發(fā)酵4 d，轉入20 ℃下發(fā)酵10 d，整個發(fā)酵過程分別在濕度40%、50%、60%、70%下進行，收獲發(fā)酵產(chǎn)物于60 ℃下烘干，粉碎備用。

1.2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

為篩選出最佳發(fā)酵條件組合，根據(jù)單因素試驗結果，以青稞紅曲中Monacolin K為評價指標，對高溫發(fā)酵溫度、低溫發(fā)酵溫度、發(fā)酵濕度3個因素進行正交試驗，每個因素選擇3個水平，按L9(34)正交表設計試驗，各個因素水平見表1。

表1 配方優(yōu)化正交試驗因素與水平

1.2.5 溫、濕度波動性的影響

(1)溫度的波動性試驗：將種子液按10%(v/m)接種于滅菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中并搖散。于27～35 ℃下高溫發(fā)酵4 d，后置于15～27 ℃下低溫發(fā)酵10 d，對照組高溫發(fā)酵階段溫度保持在33 ℃，低溫階段發(fā)酵溫度保持在20 ℃，整個發(fā)酵過程濕度保持在40%，收獲發(fā)酵產(chǎn)物于60 ℃下烘干，粉碎備用。

(2)濕度的波動性試驗：將種子液按10%(v/m)接種于滅菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中并搖散。置于33 ℃下高溫發(fā)酵4 d，后轉入20 ℃下發(fā)酵10 d，發(fā)酵過程濕度保持在20%～75%，對照組濕度保持在60%，收獲發(fā)酵產(chǎn)物于60 ℃下烘干，粉碎備用。

1.2.6 青稞紅曲中Monacolin K的檢測[8]

標準曲線的制作：配制質量濃度為0.1、1、10、30、75、150、300 μg/mL的Monacolin K標準溶液。分析時，用洗脫液平衡分析柱，基線穩(wěn)定后將不同質量濃度的Monacolin K標準品也進行HPLC分析，測定峰面積，以峰面積為縱坐標，Monacolin K含量為橫坐標作圖，線性關系良好，r在0.999 5以上時，進行后續(xù)樣品測定。

固態(tài)發(fā)酵樣品處理及色譜條件：將青稞紅曲粉碎(40目，粉狀)并充分混合均勻。準確稱取400～600.0 mg試樣于50 mL容量瓶中。加入30 mL 75%vol乙醇，搖勻，室溫下超聲50 min。加75%vol乙醇至接近刻度，再超聲10 min，之后冷卻至室溫，用75%vol乙醇定容至50 mL。以3 500 r/min的旋轉速度離心10 min。取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液待用。色譜柱： C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)；流動相：V(甲醇)∶V(水)∶V(磷酸)=385∶115∶0.14；柱溫：20～25 ℃；紫外檢測器，波長 238 .0 nm。流速：1 mL/min；進樣量：20 μL；樣品預處理后經(jīng) 0.45 μm 濾膜過濾后用HPLC測定。

Monacolin K含量按公式(1)計算：

(1)

式中：X，試樣中MonacolinK的含量，mg/g；h1，樣品中內(nèi)酯型洛伐他汀峰面積；h2，樣品中酸式洛伐他汀峰面積；c，標準洛伐他汀(內(nèi)酯)溶液質量濃度，mg/mL;50，試樣定容體積，mL;h3，標準洛伐他汀(內(nèi)酯)溶液峰面積；m，試樣稱取質量，g。

1.2.7 青稞紅曲中β-葡聚糖的測定[9]

用研磨機或離心粉碎機將樣品粉碎成可通過0.5mm篩網(wǎng)的粉末；精確稱量80～120mg樣品粉末，加入玻璃離心管中(16mm×120mm，17mL容量)，輕拍離心管，確保所有的樣品都在離心管底部；用0.2mL含水乙醇(50%vol)使樣品濕潤以利于分散，加磷酸鈉緩沖液(4.0mL,20mmol/L,pH6.5),用渦旋混合器攪拌；混合好后，立即將離心管置于沸水浴中孵育60s，用渦旋混合器劇烈攪拌，再次沸水孵育2min，再次攪拌；再次50 ℃孵育離心管及其內(nèi)容物，平衡5min；加入地衣聚糖酶(0.2mL,10U)，攪拌內(nèi)容物，用封口膠密封離心管，50 ℃孵育1h，期間用渦旋混合器定時劇烈攪拌(3～4次)；加入醋酸鈉緩沖液(5.0mL,200mmol/L,pH4.0)，用渦旋混合器劇烈混合離心管內(nèi)容物；將離心管在室溫下平衡5min，離心(1 000g,10min)，分別向3個試管(12mL容量)底部小心準確移取0.1mL；將溶于50mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.0)的β-葡聚苷酶(0.1mL,0.2U)加入其中2個試管中(反應)，第3個試管(反應空白)，加50mmol/L醋酸鹽緩沖液(0.1mL，pH4.0)，50 ℃孵育所有試管10min；每管加GOPOD試劑(3.0mL)， 再次50 ℃孵育20min；從水浴中取出試管，在510nm下1h內(nèi)測定吸收光度值。

(2)

式中：ΔA=A處理(反應)后的吸光光度值-A空白；F為吸光光度值轉換為葡萄糖質量的因子，F(xiàn)=100×D-葡萄糖的質量(μg)/100μgD-葡萄糖的吸光光度值；300=體積校正(如從30.0mL取0.1mL);1/1000,從μg轉化為mg;100/W=一定質量干粉中β-葡聚糖含量以百分比表述的因子，W為樣品的干物質質量，mg；162/180=β-葡聚糖中游離的D-葡萄糖轉化為D-葡萄糖酐的因子。

1.2.8 統(tǒng)計分析方法

試驗設計和數(shù)據(jù)皆采用Minitab16.0進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 高溫發(fā)酵階段溫度對MonacolinK和β-葡聚糖含量的影響

紅曲高溫發(fā)酵階段主要是紅曲霉的生長過程，基本上不代謝產(chǎn)生MonacolinK，但對低溫發(fā)酵階段MonacolinK的合成累積有潛在影響(圖1)。

圖1 高溫對Monacolin K及β-葡聚糖的影響Fig.1 The effects of different high temperature on Monacolin K and β-glucans production

由圖1可知，在不同高溫發(fā)酵溫度下青稞紅曲中Monacolin K含量先升后降，30 ℃時Monacolin K產(chǎn)量最高，這可能是因為30 ℃最適紅曲霉菌的生長，前期的生長情況對微生物后期次級代謝產(chǎn)物含量有較大影響。β-葡聚糖的含量基本上與Monacolin K含量相反，β-葡聚糖作為一種糖類物質，在紅曲霉菌生長過程中會產(chǎn)生相關的酶將其分解利用，所以紅曲霉菌的生長情況會直接影響青稞紅曲中β-葡聚糖的含量。

2.2 低溫發(fā)酵階段溫度對Monacolin K和β-葡聚糖含量的影響

低溫發(fā)酵階段是青稞紅曲中功能物質合成累積的階段，低溫發(fā)酵溫度對青稞紅曲中功能性物質的影響如圖2所示。

圖2 低溫對Monacolin K及β-葡聚糖的影響Fig.2 The effects of different low temperature on Monacolin K and β-glucans production

由圖2可知，當?shù)蜏匕l(fā)酵溫度控制在21 ℃時，青稞紅曲中的Monacolin K含量最高可達1.55%，這是因為低溫發(fā)酵階段是青稞紅曲次級代謝產(chǎn)物Monacolin K合成累積的階段，適宜的溫度有利于功能性物質的合成累積。各個低溫下最終發(fā)酵產(chǎn)物中β-葡聚糖含量差別不大，這說明低溫發(fā)酵過程基本上不消耗β-葡聚糖。

2.3 濕度對青稞紅曲中Monacolin K和β-葡聚糖含量的影響

濕度在紅曲發(fā)酵過程中對功能性物質的合成累積有重大影響[10]。濕度對青稞紅曲中Monacolin K和β-葡聚糖含量的影響如圖3所示。

圖3 濕度對Monacolin K及β-葡聚糖的影響Fig.3 The effects of humidity on Monacolin K and β-glucans production

由圖3可知，青稞紅曲中Monacolin K含量隨著發(fā)酵濕度的增加而增加，發(fā)酵濕度60%和70%間Monacolin K含量增加量不顯著(P>0.05)。β-葡聚糖含量是隨著發(fā)酵濕度增加而減少的，且發(fā)酵濕度在60%和70%時β-葡聚糖含量存在顯著性差異(P<0.05)。

2.4 發(fā)酵條件正交試驗優(yōu)化結果

高溫發(fā)酵溫度、低溫發(fā)酵溫度和發(fā)酵濕度是影響青稞紅曲產(chǎn)Monacolin K的重要因子，為了確定這3個因素對青稞紅曲Monacolin K產(chǎn)量作用大小，進行了正交試驗，試驗結果見表2。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果與分析

由表2可知，以青稞紅曲中Monacolin K含量為評價指標，各因素對青稞紅曲中Monacolin K含量的影響程度依次為高溫發(fā)酵溫度>低溫發(fā)酵溫度>發(fā)酵濕度。最佳組合為A2B2C3，即高溫發(fā)酵溫度為30 ℃，低溫發(fā)酵溫度為21 ℃，發(fā)酵濕度為70%，但是考慮到西藏高原干燥氣候條件，發(fā)酵濕度在60%基礎上調(diào)高10%所需能耗，單因素試驗結果表明濕度為60%和70%時，青稞紅曲中Monacolin K含量間無顯著差別(P>0.05)，β-葡聚糖含量卻存在著顯著性差異(P<0.05),因此選擇發(fā)酵濕度為60%，即調(diào)整最佳組合為A2B2C2，即高溫發(fā)酵溫度為30 ℃，低溫發(fā)酵溫度為21 ℃，發(fā)酵濕度為60%。在此優(yōu)化后的發(fā)酵條件下進行驗證試驗，青稞紅曲中的Monacolin K含量可達1.94%。

2.5 發(fā)酵溫度波動性對青稞紅曲中Monacolin K和β-葡聚糖含量的影響

為考察青稞紅曲發(fā)酵過程中溫度在一定范圍內(nèi)波動對代謝產(chǎn)物含量是否影響，進行發(fā)酵溫度波動性試驗，其結果如圖4所示。

圖4 溫度波動情況及對Monacolin K和β-葡聚糖含量的影響Fig.4 The effects of temperature fluctuation on Monacolin K and β-glucans production

由圖4可知發(fā)酵過程在波動性的溫度下較恒定溫度對青稞紅曲中的Monacolin K和β-葡聚糖含量有明顯的影響。波動性溫度顯然不利于Monacolin K合成累積，這可能是因為波動性的溫度不利于紅曲霉菌在高溫發(fā)酵階段的生長；另外紅曲霉菌各類次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，特定的代謝產(chǎn)物一般對應特定的溫度范圍，波動性的溫度則不利于Monacolin K的合成累積，還有可能會產(chǎn)生一些不期望的代謝物產(chǎn)生。在波動性溫度下紅曲霉菌的生長情況較恒定溫度下的差，而紅曲霉菌的生長過程中會分解利用β-葡聚糖，恒定溫度情況下紅曲霉菌生長更好，從而消耗的β-葡聚糖也會更多。

2.6 發(fā)酵濕度波動性對青稞紅曲中Monacolin K和β-葡聚糖含量的影響

紅曲發(fā)酵需要較高的濕度，發(fā)酵過程中的濕度對青稞紅曲中的Monacolin K和β-葡聚糖含量有明顯影響。濕度的波動性對青稞紅曲中Monacolin K和β-葡聚糖含量影響如圖5所示。

圖5 濕度的波動情況及對Monacolin K和β-葡聚糖含量的影響Fig.5 The effects of humidity fluctuation on Monacolin K and β-glucans production

圖5表明在恒定濕度下青稞紅曲中Monacolin K含量可達1.94%，而在波動的濕度下Monacolin K含量僅為0.32%，這表明濕度的波動性對青稞紅曲中Monacolin K含量影響巨大。β-葡聚糖含量在波動濕度情況下較恒定濕度下高，可能是因為恒定濕度下更有利于紅曲的生長，從而分解利用更多的β-葡聚糖，紅曲生長情況越好其消耗的β-葡聚糖越多，因此恒定濕度下青稞紅曲中β-葡聚糖含量較波動性濕度下相對偏低。

3 結論

青稞紅曲是以青藏高原特色農(nóng)作物青稞為基質經(jīng)紅曲霉菌發(fā)酵而成，其不僅可較好保留青稞中的功效成分β-葡聚糖，且可發(fā)酵獲得較高含量的功能性物質Monacolin K。本研究以青稞紅曲中Monacolin K為指標對發(fā)酵溫度、發(fā)酵濕度、發(fā)酵溫度的波動性、發(fā)酵濕度的波動性進行研究。通過單因素試驗確定在青藏高原環(huán)境下有利于青稞紅曲中Monacolin K合成累積的溫度分別是高溫發(fā)酵階段30 ℃，低溫發(fā)酵階段21 ℃；發(fā)酵濕度為70%。通過正交試驗并結合西藏高原干燥的氣候條件、發(fā)酵成本和功能性物質有效提高量，確定最佳的發(fā)酵條件為高溫發(fā)酵溫度30 ℃，低溫發(fā)酵溫度21 ℃，發(fā)酵濕度60%。在此發(fā)酵條件下，青稞紅曲中Monacolin K含量可達1.94%，β-葡聚糖含量可達2.30%。本研究表明青稞紅曲中β-葡聚糖的含量與紅曲在高溫發(fā)酵階段生長情況有極為密切的關系，與低溫發(fā)酵階段的代謝產(chǎn)物合成累積基本上無關系。因此可通過選擇β-葡聚糖高含量的青稞品種作為發(fā)酵基質可有效提高青稞紅曲中β-葡聚糖的含量，其消耗率和功能性物質的產(chǎn)生率還需進一步研究。通過溫、濕度波動性試驗，結果表明發(fā)酵過程中溫、濕度的波動不利于青稞紅曲中Monacolin K的合成累積，因此青稞紅曲發(fā)酵過程控制顯得尤為重要。本研究首次對青藏高原環(huán)境下青稞紅曲發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K等功能性物質的環(huán)境條件進行研究，為青藏高原青稞紅曲工業(yè)化發(fā)酵提供了一定參考。

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The effect of fermentation conditions on the production of Monacolin K and β-glucan of hullesbarleyMonascus

HU Jiu-ping, YAN Ping,QI Shan-shan, ZHAO Hui*

1(Tibet Yuewang Tibetan Medicine Technology Co., Ltd., Lhasa 850000,China) 2(Microorganism fermentation engineering technology research center of the Tibetan plateau, Lhasa 850000, China) 3(Lhasa Hullesbarley Fermentation Engineering Technology Research Center, Lhasa 850000, China)

The effects of fermentation temperature (high and low temperature phase), humidity and the fluctuation of temperature and humidity on Monacolin K and β-glucan content of hullesbarleyMonasuson Tibetan plateau were investigated. The results of single factor experiment and orthogonal experiment indicated that the order of effect from high to low was temperature phase, low temperature phase and humidity. The best fermentation conditions were high fermentation temperature 30 ℃, low fermentation temperature 21℃ and 60% humidity. The Monacolin K production in hullesbarleyMonascuscould achieve 1.94% using these fermentation conditions. This research showed that the β-glucan content on hullesbarleyMonasucsjust had relationship with the growth ofMonascusin high temperature ferment phase. The fluctuations of temperature and humidity in the process of fermentation would have great influence on Monacolin K content in hullesbarleyMonascus.

fermentation;hullesbarleyMonascus; Monacolin K; β-glucan

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703024

碩士研究生(趙輝為通訊作者,E-mail：zhaoh@izangyao.com)。

國家科技型中小企業(yè)技術創(chuàng)新基金(12c26215406517)

2016-08-18，改回日期：2016-11-28