曾林，譚霄，張慶*，楊穎，唐潔

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川省食品生物技術重點實驗室，四川 成都，610039) 2(西華大學 古法發(fā)酵(釀造)生物技術研究所，四川 成都，610039)3(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南，250101)

四川泡菜中產γ-氨基丁酸植物乳桿菌BC114發(fā)酵條件優(yōu)化

曾林1,2，譚霄1，張慶1,2*，楊穎3，唐潔1

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川省食品生物技術重點實驗室，四川 成都，610039) 2(西華大學 古法發(fā)酵(釀造)生物技術研究所，四川 成都，610039)3(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南，250101)

為拓展產γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)微生物資源，以四川泡菜為分離源，從中分離具有產GABA能力的乳酸菌，并對其進行發(fā)酵條件優(yōu)化。通過高效液相色譜法對篩選到的GABA菌株進行表達能力評估發(fā)現，菌株BC114在含10 g/L L-谷氨酸鈉的MRS培養(yǎng)基于37 ℃發(fā)酵48 h后，發(fā)酵液中GABA質量濃度為1.72 g/L。以MRS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，采用單因素試驗和響應面中心組合試驗設計對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基組成為葡萄糖15 g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、K2HPO41.50 g/L、L-谷氨酸鈉17 g/L、乙酸鈉5 g/L、MnSO40.05 g/L、MgSO40.10 g/L、吐溫-80 1 mL/L；培養(yǎng)條件為pH 5.50、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間80 h、接種量4%。在此優(yōu)化條件下，植物乳桿菌BC114產GABA能力達到3.82 g/L，較優(yōu)化前提高了2.22倍。

植物乳桿菌BC114；γ-氨基丁酸；響應面分析法

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，簡稱GABA)是通過谷氨酸脫羧酶(GAD)生物合成的非蛋白質氨基酸[1]。在哺乳動物中，GABA以一種重要的抑制性神經遞質存在于中樞神經系統中[2]，具有降低血壓、利尿、增強記憶等多種生理功能[3-5]。GABA既是一種具有顯著藥理作用的藥物[6]，又被視為具有保健功能的新型功能性因子，在食品、醫(yī)藥等領域具有十分樂觀的應用前景[7]。因此，GABA的合成引起了人們的廣泛關注和重視。

GABA在動植物體內分布廣泛，但其天然含量低，從天然組織中分離提取難度大[8]，目前獲得GABA的方法主要有化學合成、植物富集法和微生物發(fā)酵法三大類[9]。相比而言，化學合成GABA法反應條件復雜、污染大；植物富集法產GABA難度大、含量低；而微生物發(fā)酵法產GABA條件溫和、安全性好，成為了目前GABA生產的理想方法[10]。近年來，含有谷氨酸脫羧酶的霉菌[11]、酵母[12]和乳酸菌[13]等作為發(fā)酵劑用于微生物發(fā)酵生產GABA，Anussara Ratanaburee[14]等利用LactobacillusnamurensisNH2和PediococcuspentosaceusHN8作發(fā)酵劑生產富含GABA發(fā)酵豬肉香腸；Ja Young Kim[15]等利用LactobacillusbrevisGABA100發(fā)酵生產GABA黑莓果汁。然而，優(yōu)良菌株的缺乏制約了GABA發(fā)酵法的進一步發(fā)展，Naser Tajabadi[16]等從蜂蜜中分離產GABA的LactobacillusplantarumTaj-Apis362, 響應面優(yōu)化后GABA質量濃度僅0.721 g/L; 黃桂東[17]等從黃酒發(fā)酵液中分離出的LactobacillusplantarumMJ0301進行培養(yǎng)基優(yōu)化后GABA質量濃度僅1.59 g/L。因此，如何獲取優(yōu)良菌株成為了開發(fā)GABA微生物發(fā)酵法的重要任務。

本研究以四川泡菜為原料，分離、篩選出高產GABA的乳酸菌菌株，以MRS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，采用響應面優(yōu)化設計試驗對影響GABA產量的各因子及其交互作用進行優(yōu)化，確定篩選菌株的最佳發(fā)酵條件，旨在為高產GABA菌株的開發(fā)、應用以及產GABA發(fā)酵條件優(yōu)化等相關研究及后續(xù)研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

四川泡菜中分離出的12 株具有產GABA能力的乳酸菌菌株，NCBI登錄號為KU761831～KU761842，西華大學食品與生物工程學院保藏。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，K2HPO42 g/L，乙酸鈉5 g/L，MnSO40.05 g/L，MgSO40.10 g/L，吐溫-80 1 mL/L，調節(jié)pH6.20，121 ℃條件下滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎上添加10 g/L L-谷氨酸鈉。

取經活化培養(yǎng)16 h的種子液(約108CFU/mL)，以4%的接種量接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，30 ℃靜止培養(yǎng)48 h。

1.3 GABA表達能力評估

采用HPLC定量分析對各菌株產GABA能力進行評估。參照張術聰[18]等柱前衍生的方法對發(fā)酵液中GABA進行柱前衍生。HPLC分析條件：色譜柱為島津-GL INERTSIL ODS-3(4.6 mm×150 mm，5 um)；紫外檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；流動相A為甲醇，流動相B為醋酸鈉(pH 6.20)∶甲醇∶四氫呋喃(420∶75∶5，V/V/V)；流速1 mL/min；梯度洗脫時，流動相B比例為：0～6 min，80%～50%；6～9 min，50%～20%；9～10 min，20%～0%；10～11 min，維持0%；11～15 min，返回80%。

1.4 篩選菌株生理生化特征和16S rRNA測序分析

根據《伯杰氏系統細菌學手冊》[19]和《乳酸細菌分類鑒定及試驗方法》[20]中試驗方法進行常規(guī)的生化測試，同時采用16S rRNA測序分析，所得序列提交至NCBI進行Blast比對。

1.5 單因素試驗

根據查閱文獻及前期實驗篩選[21-22]，以MRS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，按4%的接種量，選取影響菌株GABA產量和生長情況(A600nm)的因素：L-谷氨酸鈉質量濃度(0～20 g/L)，初始pH(5～7)，發(fā)酵溫度(30～38 ℃)和發(fā)酵時間(24～84 h)進行單因素試驗。

1.6 響應面優(yōu)化設計試驗

采用響應面分析方法對篩選菌株產GABA發(fā)酵條件進行優(yōu)化，根據CCD的中心組合設計原理[17]，以L-谷氨酸鈉質量濃度、初始pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間4個因子為自變量，以GABA產量為響應值，設計了四因素三水平的響應面分析試驗，并用Design-Expert7.0軟件對實驗數據進行回歸分析。

2 結果與分析

2.1 GABA表達能力評估分析

利用HPLC定量分析對菌株產GABA能力進行評估。其標準曲線為Y=9E+06X-18007(R2=0.999 2)。因此，可用于菌株發(fā)酵液中的GABA進行定量分析，定量結果如圖1所示，12 株菌株發(fā)酵液中γ-氨基丁酸質量濃度為0.28～1.72 g/L，其中菌株BC114發(fā)酵產γ-氨基丁酸質量濃度較高，達1.72 g/L。周青[23]等從泡菜中篩選到一株植物乳桿菌，發(fā)酵液中GABA質量濃度達1.26 g/L，并通過正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件及其培養(yǎng)基成分，發(fā)酵液中GABA產量提高了79%。因此，菌株BC114發(fā)酵生產GABA更具有優(yōu)勢，下一步可對其進行發(fā)酵條件及其培養(yǎng)基成分的優(yōu)化。

圖1 四川泡菜中篩選的12株乳酸菌產GABA能力的大小(不同字母表示數據差異顯著，P<0.05)Fig.1 Comparison of GABA production by 12 LAB strains isolated from Sichuan Pickle

2.2 菌株BC114生理生化特征及16S rRNA測序分析

通過常規(guī)的生理生化特征分析，菌株BC114為革蘭氏陽性菌，在15～45 ℃培養(yǎng)條件下，能在厭氧和有氧條件下生長良好，結果見表1，同化碳源試驗表明，纖維二糖、果糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蜜二糖、棉籽糖、核糖、山梨糖、蔗糖和海藻糖為陽性；阿拉伯糖、松三糖、鼠李糖和D-木糖為陰性。16S rRNA基因測序分析菌株BC114(KU761835)與LactobacillusplantarumJCM 1149 (NR_115605.1)相似度為100%，因此，結合生理生化特征，菌株BC114被鑒定為L.plantarum。

2.3L-谷氨酸鈉質量濃度、初始pH、發(fā)酵溫度和時間對L.plantarumBC114生長及GABA產量的影響

L-谷氨酸鈉質量濃度增大可使GABA支路中碳流量增加，并調節(jié)GAD活性。L-谷氨酸鈉質量濃度對菌株BC114生長及GABA產量的影響如圖2-a所示，L-谷氨酸鈉質量濃度對菌株BC114產GABA有較大的影響，而菌體濃度基本保持不變。隨著L-谷氨酸鈉質量濃度的增大，GABA的產量也隨之增加，當L-谷氨酸鈉質量濃度超過15 g/L后，GABA產量緩慢減少。因此選擇15 g/L為L-谷氨酸鈉的最優(yōu)質量濃度。

表1 菌株BC114主要的生理生化測試

培養(yǎng)基pH值可通過影響生物體內的酶反應、細胞膜對營養(yǎng)物質的運輸等方式來影響菌體的生長及代謝產物的積累。試驗將培養(yǎng)基的初始pH分別調節(jié)為pH5.00～7.00，探討培養(yǎng)基的初始pH對L.plantarumBC114的生長及GABA產量的影響。結果表明，菌體濃度在初始pH6.00時最高，隨著pH升高菌體濃度緩慢降低，GABA質量濃度在初始pH 5.50時最高，隨pH升高GABA產量迅速降低(如圖2-b)。劉佳榮[24]等篩選獲得的L.plantarumLp-Dfa301在pH 5.00時產GABA能力最強，Naser Tajabadi[25]等篩選獲得的L.plantarumTaj-Apis362在pH 5.50時產GABA能力最強。綜上所述，試驗選擇pH 5.50是合理的，可供后續(xù)研究。

發(fā)酵溫度對L.plantarumBC114的生長及GABA產量的影響結果如圖2-c所示，隨著發(fā)酵溫度的提高，GABA的產量逐漸增加，36 ℃時達到最高值，隨著溫度的繼續(xù)升高，GABA產量降低。由于高溫或低溫條件下都會影響菌體GABA代謝關鍵酶的活性、穩(wěn)定性、與底物的結合程度等，進而影響菌體的生長與代謝；Naser Tajabadi[16]等研究表明L.plantarumTaj-Apis362合成GABA關鍵酶(GAD)在36 ℃時活性最高，故選取發(fā)酵溫度36 ℃。

圖2 L-谷氨酸鈉，初始pH，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對菌株BC114生長及GABA產量的影響Fig.2 Effects of sodium L-glutamate concentration, initial pH, temperature and fermentation time on the growth of L .plantarum BC114 and the yield of GABA

發(fā)酵時間對L.plantarumBC114生長及GABA產量的影響如圖2-d所示，在發(fā)酵24 h后，隨著時間延長，菌體濃度緩慢減少，發(fā)酵60 h后菌體濃度基本保持不變，同時隨著發(fā)酵時間增加，發(fā)酵液中GABA產量也隨之增加，在發(fā)酵72 h達到最大，因此選擇72 h為最優(yōu)發(fā)酵時間。

2.4 響應面試驗結果

基于文獻和單因素試驗結果[26-27]，選取L-谷氨酸鈉、初始pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間度作為響應面分析的有效變量。以L-谷氨酸鈉質量濃度15 g/L、培養(yǎng)溫度36 ℃，初始pH 5.50和發(fā)酵時間72 h為響應面分析中心點(如表2)，進行四因素三水平的響應面試驗。

表2 響應面試驗設計方案與響應值

對表2試驗數據進行多項擬合回歸，以GABA產量為因變量，L-谷氨酸鈉質量濃度、初始pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間為自變量建立回歸方程：

Y=3.77+0.031A+0.14B-0.012C+0.24D-0.089AB-0.011AC+0.068AD-0.015BC+0.031BD-0.026CD-0.21A2-0.24B2-0.36C2-0.21D2

依據回歸方程，利用Design-Expert 7.0軟件繪制響應曲面圖(圖3)。對模型方程求導得到最大預測值GABA產量為3.87 g/L，此時對應變量的最佳值：發(fā)酵溫度為37.11 ℃、L-谷氨酸鈉質量濃度為16.59 g/L、初始pH5.48和發(fā)酵時間為79.47 h。

表3 響應面設計的回歸方程系數顯著性檢驗及方差分析

注：*. 差異顯著(P<0.05)；**.差異極顯著(P<0.01)。

圖3 各因素交互影響的響應面法立體分析圖Fig.3 Response surface plots showing the interaction effect of factors on the yield of GABA

2.5 響應面模型的驗證和優(yōu)化

為了驗證預測值的真實性，按照響應面分析法得到的優(yōu)化組合，并根據實際應用情況，以葡萄糖15 g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、K2HPO41.50 g/L、L-谷氨酸鈉17 g/L、乙酸鈉5 g/L、MnSO40.05 g/L、MgSO40.10 g/L、吐溫-80 1 mL/L、pH 5.50、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間80 h、接種量4%進行發(fā)酵，GABA的產量為3.82 g/L，該實驗值與模型的預測值3.87 g/L接近，從而驗證了預測值的準確性，說明優(yōu)化模型可靠。同時，與優(yōu)化前(初始培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：1.72 g/L)相比，GABA的產量提高了2.22倍，表明優(yōu)化方案設計合理有效，所獲的優(yōu)化培養(yǎng)基及發(fā)酵條件能夠明顯提高L.plantarumBC114產GABA的產量。

3 結論

本研究對四川泡菜中分離得到12 株具有產GABA能力的乳酸菌菌株進行能力評估，篩選出菌株L.plantarumBC114產GABA的產量最高，在含10 g/LL-谷氨酸鈉的MRS培養(yǎng)基發(fā)酵48 h后，發(fā)酵液中GABA質量濃度為1.72 g/L。以MRS為基礎培養(yǎng)基，GABA產量為響應值，根據單因素試驗結果，采用響應面法對L.plantarumBC114產GABA發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得出最適培養(yǎng)基成分為葡萄糖15 g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、K2HPO41.50 g/L、L-谷氨酸鈉17 g/L、乙酸鈉5 g/L、MnSO40.05 g/L、MgSO40.10 g/L、吐溫-80 1 mL/L；培養(yǎng)條件為pH 5.50、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間80 h、接種量4%。在此優(yōu)化條件下，植物乳桿菌BC114產GABA能力達到3.82 g/L，較優(yōu)化前提高了2.22倍。

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Optimization of γ-aminobutyric acid production byLactobacillusplantarumBC114 from Sichuan pickle

ZENG Lin1,2, TAN Xiao1, ZHANG Qing1,2*, YANG Ying, TANG Jie1

1(Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan, College of Food and Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China) 2(Biotechnology Institute of Ancient Brewing, Xihua University, Chengdu 610039, China) 3(Food and Drug Institute of Shandong, Shandong, Jinan 250101, China)

The aim of the present study was to optimize the fermentation conditions of γ-aminobutyric acid (GABA)-producing by lactic acid bacteria from Sichuan Pickle. The performance of GABA- producing strains was evaluated by high performance liquid chromatography (HPLC) method. The results showed that strain BC114 had the higher GABA-producing ability (1.72 g/L) in MRS broth with 10 g/L initial glutamic acid after fermented at 37 ℃ for 48 h. On the basis of MRS culture medium, fermentation conditions ofLactobacillusplantarumBC114 for GABA were optimized by response surface central composite design (CCD). The results showed that the optimal fermentation medium was comprised of glucose 15 g/L, beef extract 10 g/L, peptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, trisodium amine 2 g/L, dipotassium phosphate 1.50 g/L, L- glutamate 17 g/L, sodium acetate 5 g/L, manganese sulfate 0.05 g/L, magnesium sulfate 0.10 g/L, and Twain-80 1 mL/L. And the optimal fermentation condition was as follows: pH 5.50, fermentation temperature 37 ℃, fermentation time 80 h and inoculum amount 4%. Under the optimized conditions, the production of GABA by L. plantarum BC114 reached 3.82 g/L, which was 2.22-fold higher than that before the optimization.

LactobacillusplantarumBC114; γ-aminobutyric acid; response surface methodology

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703021

碩士研究生(張慶副教授為通訊作者,E-mail：biozhangq@163.com)。

四川省應用基礎項目(2016JY0253)；教育部春暉計劃項目(Z2014060)；四川省食品生物技術重點實驗室項目(szjj2016-019)

2016-09-13，改回日期：2016-12-05