秦偉帥，董書甲，姜?jiǎng)P凱,2，封文濤，劉燦珍，趙新節(jié)*

1(齊魯工業(yè)大學(xué)，山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南，250353) 2(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東 濟(jì)南，250100) 3(煙臺(tái)張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰荆綎| 煙臺(tái)，264000)

采用頂空固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用法分析氮源濃度對(duì)酵母香氣物質(zhì)合成的影響

秦偉帥1，董書甲1，姜?jiǎng)P凱1,2，封文濤3，劉燦珍1，趙新節(jié)1*

1(齊魯工業(yè)大學(xué)，山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南，250353) 2(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東 濟(jì)南，250100) 3(煙臺(tái)張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰?，山東 煙臺(tái)，264000)

為探討氮源濃度對(duì)酵母香氣物質(zhì)合成的影響，采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)和氣質(zhì)聯(lián)用法(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS)分析了不同氮源濃度的模擬葡萄汁酒精發(fā)酵后的揮發(fā)性香氣成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：揮發(fā)性香氣成分的總量隨氮源濃度的提高而增加；乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、乙酸、辛酸、己酸、2,3-丁二醇、異戊醇的含量隨氮源濃度的提高而增加；異丁醇的含量隨氮源濃度的提高而下降。

可同化氮;酵母;香氣物質(zhì);頂空固相微萃取(HS-SPME)；氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)

氮源是酵母進(jìn)行正常的生命活動(dòng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素。釀酒酵母在發(fā)酵代謝過(guò)程中優(yōu)先利用簡(jiǎn)單的氮源，如銨離子和游離的α-氨基氮化合物。脯氨酸為亞氨基酸，在酵母發(fā)酵過(guò)程中難以被利用，酵母在發(fā)酵過(guò)程中也可以利用一些小分子多肽，因此，酵母菌的可同化氮(yeast assimilable nitrogen，YAN)為除脯氨酸外的游離α-氨基氮化合物、銨態(tài)氮和小分子多肽[1]。葡萄酒的香氣是品種香氣、發(fā)酵香氣、陳釀香氣的特殊混合[2]，是葡萄酒品質(zhì)與風(fēng)格的重要標(biāo)志。葡萄酒的香氣化合物包括高級(jí)醇、揮發(fā)性酸、酯類等等。酵母代謝是產(chǎn)生葡萄酒香氣的途徑之一，并與發(fā)酵基質(zhì)中的氮源關(guān)系密切，因此氮源是葡萄酒中某些芳香物質(zhì)的前體[3]。

目前較多的研究認(rèn)為，釀酒酵母進(jìn)行正常的生長(zhǎng)代謝所需要的最低可同化氮濃度為 140～150 mg N/L，比較合適的可同化氮素含量為 200～500 mg N/L，超過(guò)500 mg N/L則認(rèn)為可同化氮素含量過(guò)量[12]。HERNNDEZ-ORTE等[4]的研究表明,葡萄汁中的氨基酸與發(fā)酵后葡萄酒中的香氣存在相關(guān)性，并通過(guò)向葡萄汁中添加氨基酸的方法提高了葡萄酒中揮發(fā)性香氣化合物的含量，加快了酵母酒精發(fā)酵的速度，提高了葡萄酒的品質(zhì)。BARBOSA等[6]的研究表明，適量提高可同化氮濃度可以提高葡萄酒中的香氣物質(zhì)的含量。目前關(guān)于氮源與香氣成分關(guān)系的研究通常受到葡萄品種香氣的影響，而以模擬葡萄汁為試材研究氮源濃度與酵母自身香氣物質(zhì)合成的報(bào)道相對(duì)較少。

本研究以模擬葡萄汁為試驗(yàn)材料，采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPM E)和氣質(zhì)聯(lián)用法(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS)分析了不同氮源濃度的模擬葡萄汁酒精發(fā)酵后的揮發(fā)性香氣成分，并研究了氮源濃度與香氣物質(zhì)合成的聯(lián)系，為探究氮源與酵母自身香氣物質(zhì)合成的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

商業(yè)釀酒酵母：EC1118，購(gòu)自上海杰兔工貿(mào)有限公司。

材料：葡萄糖、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、肌醇、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、磷酸氫二銨(DAP)、NaCl(分析純)。

香氣標(biāo)準(zhǔn)品：1-丙醇、異丁醇、2,3-丁二醇、苯乙醇、異戊醇、乙酸、異丁酸、辛酸、己酸、癸酸、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、己酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；內(nèi)標(biāo)4-甲基-2-戊醇(色譜醇98%)購(gòu)自美國(guó)Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

萬(wàn)分之一天平、高壓蒸汽滅菌鍋、顯微鏡、分光光度計(jì)、培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄、DVB/CAR/PDMS 復(fù)合萃取頭(50/30μm)，美國(guó)Supelco公司；GC-7890B/MS-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)160、400、480 mg/L三種氮源濃度，以谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸作為有機(jī)氮源，磷酸氫二銨(DAP)作為無(wú)機(jī)氮源。

模擬葡萄汁參照張瑾等[5]的方法配制，由儲(chǔ)液Ⅰ、儲(chǔ)液Ⅱ和儲(chǔ)液Ⅲ組成，成分組成如下：

儲(chǔ)液Ⅰ:在 375 mL蒸餾水中加入 200 g葡萄糖,定容至 500 mL；

儲(chǔ)液Ⅱ:在 250 mL蒸餾水中加入 6 g酒石酸，3 g蘋果酸，0.5 g檸檬酸；

儲(chǔ)液Ⅲ:在 250 mL蒸餾水中加入 6 mg 肌醇、可同化氮(YAN)。160、400、480 mg/L三種氮源濃度(分別以YAN160、YAN400、YAN480表示)的模擬葡萄汁中的氮源組成見(jiàn)表1。

表1 不同濃度氮源模擬葡萄汁的氮源組成 單位：g/L

將儲(chǔ)液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合后用 KOH 調(diào)節(jié)pH至3.25，高壓滅菌，現(xiàn)用現(xiàn)配。

將酵母活化后，按0.3 g/L的標(biāo)準(zhǔn)接種于模擬葡萄汁中，將接種后的模擬葡萄汁放于培養(yǎng)箱中25 ℃下培養(yǎng)。

1.4 分析方法

1.4.1 酵母菌計(jì)數(shù)

發(fā)酵啟動(dòng)后，每天進(jìn)行酵母菌的稀釋平板計(jì)數(shù)，每組處理做3次重復(fù)取平均值。

1.4.2 還原糖的測(cè)定

還原糖采用DNS法測(cè)定。發(fā)酵開(kāi)始后每隔100 h測(cè)定1次還原含量，每組處理做3次重復(fù)取平均值。

1.4.3 發(fā)酵參數(shù)測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后采用蒸餾法測(cè)定發(fā)酵液的酒精度；酸堿滴定法測(cè)定總酸；DNS法測(cè)定還原糖；蒸餾法測(cè)定揮發(fā)酸[17]，每組處理做3次重復(fù)取平均值。

1.4.4 香氣成分的定性與定量分析

香氣物質(zhì)提?。簠⒄誃ARBOSA等[6]的方法進(jìn)行。在20 mL頂空瓶中，加入8 mL發(fā)酵液，2g Na Cl和20 μL的2.00 g/L內(nèi)標(biāo)物(4-甲基-2-戊醇)，以及轉(zhuǎn)子。放置于45 ℃的可加熱磁力攪拌器上，預(yù)熱10 min后進(jìn)行萃取，萃取50 min后進(jìn)樣，解析10 min。

色譜條件：色譜柱為VF-WAXms(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；升溫程序：40 ℃下保持2 min，然后以6 ℃/min的速度升到230 ℃，保持15 min；載氣為氦氣，平均線速度為25 cm/s;不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度 230 ℃；檢測(cè)器溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z30～400。

定量分析：采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 氮源濃度對(duì)酵母生長(zhǎng)與發(fā)酵速率的影響

由圖1可以看出，到達(dá)穩(wěn)定期后酵母菌的數(shù)量隨著氮源濃度的升高逐漸增大，說(shuō)明高氮條件有利于酵母菌的繁殖。酵母菌到達(dá)穩(wěn)定期的時(shí)間隨著氮源濃度的升高逐漸增加，說(shuō)明隨著氮源濃度的提高酵母的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期逐漸延長(zhǎng)。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中酵母生長(zhǎng)量的變化Fig.1 The dynamic change of yeasts during fermentation

由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵800 h后，3組發(fā)酵液的酒精發(fā)酵基本結(jié)束，說(shuō)明3種氮源濃度都能滿足酵母酒精發(fā)酵的需要；發(fā)酵速率隨著氮源濃度的升高而加快，說(shuō)明高氮條件可以加快酵母的發(fā)酵速率。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量的變化Fig.2 The change of sugar concentration during fermentation

2.2 不同氮源濃度對(duì)發(fā)酵液理化指標(biāo)的影響

由表2可以看出，3組發(fā)酵液的殘?zhí)?、總酸、酒精的含量差別很?。粨]發(fā)酸的含量隨著氮源濃度的升高而增加。這說(shuō)明發(fā)酵液的酒精度、殘?zhí)?、總酸受氮源濃度的影響較小，而揮發(fā)酸的含量與氮源密切相關(guān)。

表2 不同氮源濃度發(fā)酵液的理化指標(biāo)

2.3 不同氮源濃度對(duì)揮發(fā)性香氣成分的影響

利用SPME-GC-MS對(duì)3種氮源濃度發(fā)酵液香氣成分進(jìn)行分析,共定性定量16種揮發(fā)性香氣物質(zhì),包括6種酯、5種酸和5種高級(jí)醇。YAN480的發(fā)酵液中揮發(fā)性香氣化合物總量為1 335.63 mg/L，在3組發(fā)酵液中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的含量最多。由表3可以看出，香氣物質(zhì)總量隨氮源濃度的提高而增加，這與JIMéNEZ-MART等[9]的研究結(jié)果相近。

葡萄酒中由酵母合成的酯類是在酵母體內(nèi)合成酶的催化下，由醇和酸形成[7]。酯類能賦予葡萄酒新鮮的水果香氣，在葡萄酒的品評(píng)中發(fā)揮著重要的作用[8]。由表3可以看出，在3種氮源濃度的發(fā)酵液中，定性定量的酯類共有6種。其中3種氮源濃度的發(fā)酵液中乙酸乙酯的含量最高，占酯類化合物總量的90%以上，其次為辛酸乙酯。酯類化合物的總量隨氮源濃度的提高而增加，這與繆成鵬等[10]的研究結(jié)果相似。在所測(cè)定的酯類化合物中乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯的含量隨氮源濃度的提高而增加；乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯的含量隨氮源濃度的提高變化不大。

在酵母的氨基酸代謝及糖酵解過(guò)程中產(chǎn)生的α-酮酸會(huì)經(jīng)過(guò)脫羧反應(yīng)生成相應(yīng)的醛類，醛類再由乙醛脫氫酶氧化形成相應(yīng)的酸[8]。適量的脂肪酸可以賦予葡萄酒新鮮感，但脂肪酸含量過(guò)高時(shí)則會(huì)掩蓋葡萄酒的其他風(fēng)味，給葡萄酒帶來(lái)不好的影響[15]。乙酸是葡萄酒中的主要揮發(fā)酸,對(duì)葡萄酒的品質(zhì)有著重要的影響。乙酸含量過(guò)高會(huì)使葡萄酒帶有濃郁的醋酸味，降低酒的品質(zhì)[12]。本研究定性定量了5種酸，這5種酸中乙酸的含量最高，癸酸的含量最低。乙酸、辛酸、己酸的含量隨氮源濃度的提高而增加。HERNANDEZ-ORTE 等[11]的研究發(fā)現(xiàn)己酸、辛酸等中鏈脂肪酸隨可同化氮素含量的提高而增加，BELY等[13]研究發(fā)現(xiàn)，可同化氮含量為200 mg/L時(shí)，乙酸含量最低，降低或增加可同化氮含量都會(huì)增加乙酸含量，這與本研究的結(jié)果相近。3組樣品的異丁酸、癸酸的含量隨著氮源濃度的提高變化不大。

表3 不同氮源濃度發(fā)酵液的香氣物質(zhì)濃度 單位：mg/L

葡萄酒中適量的高級(jí)醇有助于增強(qiáng)葡萄酒風(fēng)味的復(fù)雜性，當(dāng)總量≤300 mg/L時(shí)，對(duì)葡萄酒風(fēng)味是有益的；當(dāng)總量>400 mg/L，則會(huì)對(duì)葡萄酒的品質(zhì)造成消極的影響[12]。葡萄醪液α-氨基態(tài)氮含量為180～195 mg/L時(shí)酵母高級(jí)醇的生成量適中[14]。本研究定性定量了5種醇類，這5種醇類中異戊醇的含量最高，其次為1-丙醇，2,3-丁二醇的含量最低。異戊醇、2,3-丁二醇的含量隨氮源濃度的提高而增加；異丁醇的含量與隨氮源濃度的提高而降低。GARDE-CERDN等[16]的研究表明異丁醇的含量與氮源濃度呈負(fù)相關(guān)，這與本研究的結(jié)果相似。3組樣品中1-丙醇含量變化不大。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，隨著氮源濃度的提高，酵母菌達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間增加，酵母菌的數(shù)量增加，發(fā)酵速率加快，揮發(fā)酸的含量增加。利用SPME-GC-MS對(duì)3種氮源濃度發(fā)酵液香氣成分進(jìn)行分析,共定性定量了16種揮發(fā)性香氣物質(zhì),包括6種酯、5種酸和5種高級(jí)醇。香氣物質(zhì)總量隨氮源濃度的提高而增加；乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯的含量隨著氮源濃度的提高而增加；乙酸、辛酸、己酸的含量隨著氮源濃度的提高而增加；2,3-丁二醇、異戊醇的含量隨著氮源濃度的提高而增加；異丁醇的含量隨著氮源濃度的提高而降低。

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Effect of the different concentration of nitrogen sources on the formation of aroma compounds produced by yeast

QIN Wei-shuai1，DONG Shu-jia1，JIANG Kai-kai1,2，F(xiàn)ENG Wen-tao3， LIU Can-zhen1，ZHAO Xin-jie1*

1(Shandong Key Laboratory of Microbial Engineering, Qilu University of Technology, Jinan 250353，China) 2(Institute of Agro-Food Science and Technology, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100，China) 3(Yantai ChangYu Pioneer Wine Company Limited ，Yantai 264000，China)

To explore the effect of different concentration of nitrogen sources on the formation of aroma compounds produced by yeast, the volatile aroma compounds of synthetic must from different concentration of nitrogen sources after alcoholic fermentation was determined by head space solid phase microextraction (HS-SPME) followed by the gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results showed that the sum of aroma compound increased with the increase of nitrogen concentration. The concentration of ethyl acetate, acetic acid, 2-phenylethyl ester, dodecanoic acid, ethyl ester, acetic acid, octanoic acid, hexanoic acid, 2,3-butanediol, 1-butanol, and 3-methyl increased with the increase of nitrogen concentration. The concentration of 1-propanol, 2-methyl decreased with the increase of nitrogen concentration.

assimilation nitrogen;yeast;aroma compound;headspace solid-phase microextraction(HS-SPME)；gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703011

博士(趙新節(jié)教授為通訊作者,E-mail：719612304@qq.com)。

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系果品產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(SDAIT-06-14);山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)基金(SDAIT-03-021-12)；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“膠東半島產(chǎn)區(qū)特色葡萄酒香氣質(zhì)量提升關(guān)鍵技術(shù)研究”(2015GNC113010)

2016-08-22,改回日期：2016-11-25