李婷婷，崔方超，馬艷，勵建榮*

1(大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連，116600) 2(渤海大學 食品科學與工程學院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州，121013)

群體感應AHLs對溫和氣單胞菌體外致腐因子分泌的影響

李婷婷1，崔方超2，馬艷2，勵建榮2*

1(大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連，116600) 2(渤海大學 食品科學與工程學院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州，121013)

以大菱鲆腐敗菌溫和氣單胞菌(Aeromonassobria，AS7)為研究對象，研究了不同處理方式(營養(yǎng)基質(zhì)、共生培養(yǎng)和添加不同種類的AHLs)對溫和氣單胞菌的致腐因子(嗜鐵素、胞外蛋白酶、生物被膜)產(chǎn)生情況的影響，結(jié)果表明，菌株AS7嗜鐵素的分泌受到培養(yǎng)基質(zhì)的影響，在脫脂牛奶等天然基質(zhì)中可以大量分泌嗜鐵素，而市售的合成培養(yǎng)基中不能分泌嗜鐵素；AHLs的添加對嗜鐵素的產(chǎn)生量有影響，其中，C8-HSL影響顯著，隨添加的增加，嗜鐵素分泌量呈現(xiàn)正相關(P<0.05)，而C6-HSL影響不顯著(P>0.05)；共生條件下，溫和氣單胞菌對熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌嗜鐵素的分泌有明顯促進作用；AHLs的添加可以促進溫和氣單胞菌胞外蛋白酶和生物被膜的產(chǎn)量，且呈現(xiàn)正相關(P<0.05)，說明AHLs對溫和氣單胞菌產(chǎn)生胞外蛋白酶、嗜鐵素和生物被膜具有調(diào)控作用。

溫和氣單胞菌；嗜鐵素；胞外蛋白酶；生物被膜；群體感應

引起水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要原因包括酶、微生物及脂肪氧化等作用，新鮮水產(chǎn)品富含營養(yǎng)物質(zhì)和水分，肌肉組織脆弱，可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量高，pH值接近中性，研究表明約30%的捕獲魚類是由于微生物單獨因素導致?lián)p失的[1]。腐敗菌通過分泌大量的胞外蛋白酶(蛋白水解酶、脂肪水解酶等)將組織結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)分解成小分子的醛類、酮類、胺類等，導致魚類質(zhì)地、風味和氣味改變，同時還分泌胞外多糖等其他代謝產(chǎn)物在魚肉表面形成黏液或產(chǎn)生有色物質(zhì)，最終導致魚體腐敗[2]。

AHLs信號分子作為大多數(shù)革蘭氏陰性菌信息交流的媒介調(diào)控著細菌某些特定表型的表達，如生物被膜的形成、嗜鐵素的分泌、胞外蛋白酶的合成及分泌、芽孢的產(chǎn)生、細菌的運動性等。WHAN[3]等研究發(fā)現(xiàn)，巴氏消毒奶腐敗變質(zhì)是由假單胞菌的生長引起的，假單胞菌的群體感應系統(tǒng)可以調(diào)控蛋白水解酶的活性，從而導致了巴氏消毒奶的腐敗變質(zhì)。綦國紅[4]等在魚源假單胞菌產(chǎn)生的AHLs信號分子對腐敗特性的影響研究中發(fā)現(xiàn)，其細菌腐敗特性的表達是通過群體感應現(xiàn)象來調(diào)控的，AiiA蛋白水解酶對假單胞菌的AHLs分子進行降解可使其腐敗特性表達的水平下降，從而說明水產(chǎn)品的腐敗與AHLs是密切相關的。CHRISTENSEN[5]等研究發(fā)現(xiàn)，群體感應系統(tǒng)調(diào)控導致冷藏鮭魚腐敗變質(zhì)的變形斑沙雷菌(Serratiaproteamaculans)B5a 蛋白水解酶的活性。BAGGE-RAVN[6]等、Gubj?rnsdóttir[7]等在魚制品加工廠及對蝦生長環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了假單胞菌(Pseudomonasspp.)信號分子能夠調(diào)控生物被膜的產(chǎn)生。STINTZI[8]等報道了銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)通過群體感應信號分子調(diào)控嗜鐵素的分泌。因此，腐敗菌可通過AHLs介導的QS體系調(diào)控細菌特定腐敗基因的表達，從而在食品的腐敗過程中發(fā)揮作用。

大菱鲆低溫冷藏貨架期終點優(yōu)勢腐敗菌是腐敗希瓦氏菌和假單胞菌，同時，不管在腐敗中期還是貨架期終點都有一定比例的氣單胞菌存在，且氣單胞菌屬具有很強的信號分子分泌能力。所以本實驗利用產(chǎn)AHLs的腐敗菌(溫和氣單胞菌)，通過添加不同的外源信號分子標準品(C6-HSL、C8-HSL)和利用天然(牛奶)與人工合成(合成培養(yǎng)基)的培養(yǎng)基質(zhì)研究溫和氣單胞菌群體感應系統(tǒng)對其生物被膜、胞外蛋白酶和嗜鐵素產(chǎn)生的影響，從而確定大菱鲆4 ℃冷藏過程中QS信號分子與腐敗菌致腐因子之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株和培養(yǎng)條件

溫和氣單胞菌AS7、熒光假單胞菌PF14(Pseudomonasfluorescens, PF14)和腐敗希瓦氏菌SP25(Shewanellaputrefaciens, SP25)，從市售大菱鲆中分離，本實驗室保存。溫和氣單胞菌用TSB液體培養(yǎng)基活化，其他菌株均在28 ℃、LB 液體培養(yǎng)基活化，搖床培養(yǎng)，連續(xù)活化兩代。

1.2 儀器與設備

信號分子標準品C6-HSL、C8-HSL，購于Sigma 公司；鉻天青S (Chrome azurol Sulphonate)、十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyltrimethylammonium bromide HDTMA)、PIPEs，購自國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂粉、TSB、LB培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂，北京陸橋生物技術有限公司；酸水解酪蛋白溶液，上海滬峰化工有限公司；脫脂奶粉，購自生工生物工程(上海)有限公司，其他常規(guī)試劑均為分析純。

HZQ-X300C型恒溫振蕩器，BPS-100CA恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；MS105UD電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；Purifier Logic生物安全柜，美國LABCONCO公司；MLS-3020高壓蒸汽滅菌，日本三洋公司；Imark酶標儀，美國BIO-RAD；Biofuge Stratos冷凍高速離心機，美國THERMO公司；UV-2700紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 嗜鐵素檢測

利用CASAD嗜鐵素平板法可檢測總的嗜鐵素，不受嗜鐵素形態(tài)的限制，根據(jù)文獻[9]，制作CASAD嗜鐵素檢測平板，制作過程如下:

1)溶液 A：將 0.06 g的 CAS溶于50 mL 去離子水中，再加入10 mL 1 mmol/L 的FeCl3溶液(含有10 mmol/L 的 HCl)；

2)溶液 B：將0.07 g的 HDTMA溶于 40 mL去離子水中；

3)溶液 C：將A溶液沿著燒杯的壁緩緩加入到B溶液中，輕輕晃動，使得溶液A與溶液B混合均勻，即得到溶液 C：CAS藍色檢測液。121 ℃，15 min滅菌。

先配制好1 mmol/L 的CaCl2溶液、1 mmol/L的MgSO4·7H2O溶液、10%的酸水解酪蛋白溶液(121 ℃，15 min 單獨滅菌)；再分別取 0.2 mL 的CaCl2溶液、0.2 mL 的MgSO4·7H2O 溶液、6 mL的 10%的酸水解酪蛋白溶液，加入生物緩沖液 Pipes(sigma)，調(diào)至pH6.8～7.0。去離子水定容到 100 mL。加入 2 g 瓊脂粉，121 ℃，15 min 滅菌。當以上的固體培養(yǎng)基滅菌后，溫度降低到 60 ℃時，以 5 mL CAS 藍色檢測液每100 mL CAS培養(yǎng)基的量沿著三角瓶壁加入，混合均勻。注意不要產(chǎn)生氣泡，影響平板檢測實驗。然后按照每皿15 mL傾注于培養(yǎng)皿(直徑 90 mm)中。每孔加入菌液200 μL，空白培養(yǎng)基為陰性對照，每組3個平行，培養(yǎng)24 h。

1.3.2 蛋白酶活性檢測

牛奶平板制作參考VIJAYARAGHAVAN[10]的方法：在普通肉湯蛋白胨固體培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量分數(shù)為1.5%的牛奶。15%的脫脂乳粉用水溶解后應單獨滅菌(115 ℃，0.06 MPa，30 min)，鋪平板前再與營養(yǎng)瓊脂混合。10 mL 15%脫脂乳粉(單獨滅菌)，加到90 mL的營養(yǎng)瓊脂中，混勻，倒入底層鋪有瓊脂的平板中，打孔器打孔后加入無菌上清液150 μL,每組3次平行，培養(yǎng)24 h。無菌上清液制作方法為：將AS7菌株接種至不同培養(yǎng)基中，然后于30 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)好的菌液在10 000 r/min、離心15 min，棄菌體，留上清液，上清液加入培養(yǎng)基之前用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌。

1.3.3 生物被膜能力測定

1.3.3.1 酶標儀法定量生物被膜

[11]的方法，將過夜活化的菌懸液與培養(yǎng)基按1∶100體積混勻后，加入到無菌的標準96孔板中，每組4平行，以無菌的培養(yǎng)基為空白對照，在28 ℃下靜置培養(yǎng)。每次取出測定時，先棄去培養(yǎng)液，用無菌蒸餾水250 μL/孔清洗3 次，60 ℃或無菌風干燥固定30 min，隨后用0.1%結(jié)晶紫溶液200 μL/孔染色30 min后棄去染液，用無菌蒸餾水250 μL/孔清洗3 次，60 ℃干燥后，于200 μL/孔的95%乙醇溶解5 min，酶標儀法測定OD595值，每個處理4個重復，分別按不同時間(12、24、36、48、96 h)培養(yǎng)。

1.3.3.2 掃描電鏡觀察生物被膜

從培養(yǎng)皿中取出生物被膜載體，用無菌水沖洗干凈后，無菌風吹干，將載體放入4 ℃預冷的2.5%戊二醛中浸泡4 h，取出后依次在50%、70%、80%、90%和100%的乙醇中浸泡30 min，再經(jīng)醋酸異戊酯置換2次，自然干燥后噴金處理，用掃描電鏡鏡檢[12]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理和分析

采用SPSS 13.0 進行重復測量方差分析，Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜鐵素分析

嗜鐵素(Siderophore)，又名鐵載體蛋白，是一類由微生物在低鐵條件下合成的相對分子質(zhì)量小的、能特異地螯合Fe3+的一種螯合因子[13]，嗜鐵素主要是通過對鐵離子的競爭影響其他細菌的生長。菌株產(chǎn)生的嗜鐵素絡合環(huán)境中鐵離子，使其他微生物得不到足夠的鐵營養(yǎng)，生長發(fā)育受到抑制，從而使菌株能夠維持自己的菌體密度。利用CASAD檢測平板法，培養(yǎng)基中因含有CAS、十六烷基三甲銨(HDTMA)及Fe3+的三元復合物而呈現(xiàn)藍色。嗜鐵素會奪取藍色平板中的鐵離子，形成橙色暈圈。

不同培養(yǎng)方式處理的菌液在CAS檢測平板生長情況如圖1所示，各個受試菌株(AS7、PF14和SP25)在市售的合成培養(yǎng)基(LB、TSB)中幾乎不能產(chǎn)生嗜鐵素，而在脫脂牛奶等天然基質(zhì)中可以明顯檢測到橙色圈，可能的原因是合成培養(yǎng)基中缺少合成嗜鐵素所必須的微量元素，GRAM[14]等研究發(fā)現(xiàn)，希瓦氏菌(Shewanellaputrefuciens)嗜鐵素的分泌受到培養(yǎng)基成分的影響，只有在魚的提取物中培養(yǎng)時才能分泌嗜鐵素，在合成的基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)時不分泌嗜鐵素。綦國紅[4]等研究發(fā)現(xiàn)食源性假單胞菌在牛奶基質(zhì)中培養(yǎng)時能夠大量產(chǎn)生嗜鐵素，而在基礎培養(yǎng)基中生長時未檢測到嗜鐵素。這與我們的研究結(jié)果相一致。

圖1 不同處理下AS7嗜鐵素的分泌量Fig.1 The siderophore secretion of strain AS7 under different processing

在脫脂牛奶培養(yǎng)基中共生情況下嗜鐵素的分泌情況見圖1。結(jié)果表明，溫和氣單胞菌對熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌的嗜鐵素的分泌具有促進作用，對熒光假單胞菌的促進作用尤為顯著，可能是因為在共生培養(yǎng)的過程中，溫和氣單胞菌分泌大量的信號分子到培養(yǎng)環(huán)境中，熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌具有LuxR型受體蛋白，可以結(jié)合并利用其信號分子調(diào)控自身嗜鐵素的分泌，我們前期研究結(jié)果顯示，熒光假單胞菌嗜鐵素的分泌受到群體感應系統(tǒng)的調(diào)控[15]。

為進一步研究群體感應與溫和氣單胞菌的關系，添加了不同濃度的C6-HSL和C8-HSL標準品，結(jié)果見圖2。添加C6-HSL對菌株AS7嗜鐵素的分泌并沒有促進作用，而C8-HSL對菌株AS7嗜鐵素的分泌有顯著影響，隨著添加濃度升高，暈圈直徑明顯變化，呈現(xiàn)正相關，本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)C8-HSL為該菌主要信號分子，溫和氣單胞菌通過分泌C8-HSL來調(diào)控嗜鐵素的分泌，STINTZI[8]等報道了銅綠假單胞菌通過群體感應調(diào)控嗜鐵素的產(chǎn)生量。

1-AS7+TSB；2-AS7+牛奶；3-AS7+SP25；4-AS7+PF14；5-PF14+LB；6-PF14+牛奶；7-SP25+LB；8-SP25+牛奶；9-AS7+50 μL C6-HSL；10-AS7+25 μL C6-HSL；11-AS7+75 μL C6-HSL；12-AS7+100 μL C6-HSL；13-AS7+50 μL C8-HSL；14-AS7+25 μL C8-HSL；15-AS7+75 μL C8-HSL；16-AS7+100 μL C8-HSL圖2 不同處理下AS7嗜鐵素的分泌量Fig.2 The siderophore secretion of strain AS7 under different processing

2.2 蛋白酶分析

水產(chǎn)品屬于高蛋白類食品，其蛋白質(zhì)、游離氨基酸的含量較高，因此，只有蛋白水解酶豐富的腐敗微生物才能在其中大量繁殖，通過分泌大量的蛋白水解酶水解其中的蛋白質(zhì)，導致水產(chǎn)品失去原有的風味和氣味，最終腐敗變性，甚至產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)[2]。綦國紅[4]利用aiiA水解酶對食源性假單胞菌產(chǎn)生的AHLs分子進行降解時發(fā)現(xiàn)，其蛋白酶活性減弱，表明該菌胞外蛋白酶的產(chǎn)生受群體感應調(diào)控。HeNTZER[16]等研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌胞外蛋白酶的分泌受到群體感應調(diào)控，通過添加C-30和C-56的群體感應抑制劑發(fā)現(xiàn)該菌胞外蛋白酶分泌量明顯降低。

因此，為了確定AHLs是否也影響溫和氣單胞菌胞外蛋白酶的分泌，通過添加外源信號分子標準品并利用脫脂牛奶平板法檢測來初步評價其胞外蛋白酶分泌量與AHLs的關系，為進一步闡釋群體感應與腐敗菌致腐能力提供依據(jù)。結(jié)果如圖3和圖4所示，溫和氣單胞菌能夠分泌胞外蛋白酶，且隨著C8-HSL信號分子標準品添加量的增加呈現(xiàn)正相關，蛋白水解圈有明顯增加，說明AHLs可以促進溫和氣單胞菌胞外蛋白酶的分泌。

圖3 不同處理下AS7胞外蛋白酶的分泌量Fig.3 The extracellular protease of strain AS7 under different processing

1-AS7 ；2-AS7+25μL C8-HSL ；3-AS7+50μL C8-HSL；4-AS7+75μL C8-HSL；5-AS7+100μL C8-HSL圖4 不同處理下AS7胞外蛋白酶的分泌量Fig.4 The extracellular protease of strain AS7 under different processing

2.3 生物被膜分析

2.3.1 AHLs對溫和氣單胞菌生物被膜產(chǎn)生量的影響

生物被膜是微生物為適應脅迫環(huán)境、形成有利于生存的特殊生長狀態(tài)。是由自身分泌胞外黏質(zhì)物(如多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等)包裹的，具有高度組織化的多細胞群體結(jié)構(gòu)[17]。大量研究發(fā)現(xiàn)，細菌的群體感應系統(tǒng)可以調(diào)控其生物膜的形成[18]，KJELLEBERG[19]等表明AHLs 調(diào)控細菌黏附、游動、生物被膜的形成。FAZLI[20]等發(fā)現(xiàn)群體感應系統(tǒng)可以調(diào)控洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)生物被膜的形成；LEE[21]等研究霍氏弧菌的生物被膜形成時也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)論。本實驗通過添加外源信號分子標準品對溫和氣單胞菌生物被膜與群體感應的關系進行了研究。結(jié)果如圖5所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，生物被膜形成量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，0～24 h生物被膜產(chǎn)生量非常少，細菌以浮游態(tài)存在于培養(yǎng)基中，24～36 h是形成期，36 h后進入穩(wěn)定期，96 h后開始衰老，但生物被膜衰老的比較慢，基本維持不變，細菌的黏附是其形成生物被膜的前提條件。一旦細菌黏附到接觸表面，黏附的細菌便會汲取周圍的營養(yǎng)進行生長繁殖，進而形成生物被膜。在一定范圍，較高的菌體濃度會促進細菌在接觸面的黏附，而較多黏附的細菌會促進生物被膜的形成[22]。添加外源信號分子標準品，生物被膜的產(chǎn)生量明顯增加，且隨著添加量的增大呈現(xiàn)正相關，但在培養(yǎng)后期，高濃度的信號分子添加量會使得生物被膜衰老迅速，NILSSON[23]等認為由AHLs 介導的細菌QS 系統(tǒng)在細菌生物被膜形成、附著、固定過程起著關鍵性作用。因此，QS系統(tǒng)對溫和氣單胞菌生物被膜的形成具有調(diào)控作用。

圖5 不同時間生物被膜產(chǎn)生量與AHLs關系Fig.5 The relationship between AHLs and biofilm at different culture time

2.3.2 生物被膜掃描電鏡觀察

如圖6所示，溫和氣單胞菌在不同培養(yǎng)時間其生物被膜形成過程，在12 h菌體開始聚集黏附，是生物被膜的初始形成階段，12～24 h后菌體黏附逐漸增多，細菌間開始出現(xiàn)粘結(jié)，細菌鞭毛和菌毛會分泌大量黏性的胞外多聚糖，并與其他胞外基質(zhì)將細菌包裹起來，36 h后細菌生物被膜基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，36～48 h為溫和氣單胞菌生物被膜的成熟穩(wěn)定期；而添加不同濃度的外源信號分子標準品培養(yǎng)48 h時，結(jié)果如圖7所示，添加AHLs明顯增加溫和氣單胞菌生物被膜的形成速度和產(chǎn)生量，在添加75 μL的C8-HSL能夠形成致密的生物被膜，溫和氣單胞菌生物被膜的形成與添加AHLs濃度呈現(xiàn)正相關，說明群體感應能夠調(diào)控溫和氣單胞菌生物被膜的形成。ZHANG[24]等通過添加玫瑰花茶多酚提取物為抑制劑，抑制了銅綠假單胞菌群體感應，從而抑制其生物被膜的形成。

圖6 不同培養(yǎng)時間下AS7生物被膜形態(tài) (×10.0 K)Fig.6 Biofilm morphology of AS7 at different culture time (×10.0K)

圖7 不同濃度AHLs對生物被膜的影響 (×10.0 K)Fig.7 Influence of biofilm by the AHLs concentration (×10.0K)

3 結(jié)論

溫和氣單胞菌是水產(chǎn)品中常見的一種腐敗菌，通過研究營養(yǎng)基質(zhì)、共生培養(yǎng)和添加不同種類AHLs對其體外致腐因子(嗜鐵素、胞外蛋白酶及生物被膜)的影響可知，其嗜鐵素的分泌受到培養(yǎng)基質(zhì)的影響，在脫脂牛奶等天然基質(zhì)中可以大量分泌嗜鐵素，在市售的合成培養(yǎng)基中不能分泌嗜鐵素，其原因可能是缺乏合成必要的微量元素。共生條件下，溫和氣單胞菌對熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌嗜鐵素的分泌有明顯促進作用，溫和氣單胞菌信號分子分泌量大，分泌到共生環(huán)境中被其他菌株所利用，調(diào)控特定生物表現(xiàn)型。AHLs的添加對嗜鐵素的產(chǎn)生量有影響，其中，C8-HSL影響顯著，隨添加的增加，嗜鐵素分泌量呈現(xiàn)正相關，而C6-HSL影響不顯著。同時，AHLs的添加也可以促進溫和氣單胞菌胞外蛋白酶和生物被膜的產(chǎn)量，且呈現(xiàn)正相關，說明AHLs對溫和氣單胞菌產(chǎn)生胞外蛋白酶和生物被膜具有調(diào)控作用。掃描電鏡觀察生物被膜組織結(jié)構(gòu)，也與該實驗結(jié)果相一致。

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Influence of quorum sensing AHLs on spoilage factor secretion ofAeromonassobria

LI Ting-ting1, CUI Fang-chao2, MA Yan2, LI Jian-rong2*

1 (College of Life Science, Dalian Minzu University, Dalian 116600, China) 2 (College of Food Science and Technology, Bohai University,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage, Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products, Dalian 121013, China)

AeromonassobriaAS7 separated from spoilage turbot were used as test strain. The relationship between different treatment (the nutrition of substrate, symbiotic cultivation and adding different kind of AHLs) and the spoilage factors (siderophore, protase and biofilm) were further studied. The results showed that the secretion of siderophore was affected by medium quality, that could be secret at natural substrate such as skim milk, while could not be produced at synthetic medium. Addition of AHLs had a significant influence on the production of siderophore, wherein C8-HSL was affected significantly and the production of siderophore presented positive correlation with the increase AHLs (P<0.05), while effect on C6-HSL was not significant (P>0.05). The production of siderophore of Pseudomonas fluorescens and Shewanella putrefaciens was obvious promoted when symbiotic cultivation with AS7. Adding AHLs could also promote the production of protase and biofilm, and present the positive correlation (P<0.05), which demonstrated that the AHLs could regulate the production of extracellular protease, siderophore and biofilm in AS7.

Aeromonassobria; siderophore; protase; biofilm; quorum sensing

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703010

博士(勵建榮教授為通訊作者,E-mail：lijr6491@163.com)。

國家自然科學基金(31301572，31471639)；中國博士后科學基金(2014M552302)

2016-09-18，改回日期：2016-11-05